Nghiên Cứu Phát Hiện Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử Ở Lợn Và Gà

Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) là một trong những bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi lợn… 54 trang · Trường Đại Học Lâm Nghiệp · 2020.

• Tác giả: Nguyễn Lê Nhật Trang
• Người hướng dẫn: TS. Hà Bích Hồng
• Trường học: Trường Đại Học Lâm Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Hiện Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử Ở Lợn Và Gà Do Chủng Vi Khuẩn Clostridium Perfringens Bằng Kỹ Thuật PCR
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Bệnh truyền nhiễm
• 1.1.1. Khái niệm bệnh truyền nhiễm
• 1.1.2. Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm
• 1.1.3. Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà và lợn
• 1.1.4. Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và lợn
• 1.2. Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm trên gia súc, gia cầm
• 1.2.1. Phương pháp truyền thống
• 1.2.2. Phương pháp hiện đại
• 1.2.3. Chẩn đoán bằng kĩ thuật PCR
• 2. CHƯƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu của đề tài
• 2.1.1. Mục tiêu tổng quát
• 2.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Mẫu bệnh phẩm, hóa chất và các trang thiết bị sử dụng nghiên cứu
• 2.4.1. Mẫu bệnh phẩm
• 2.4.2. Hóa chất thí nghiệm
• 2.4.3. Trang thiết bị nghiên cứu
• 2.4.3.1. Dụng cụ thí nghiệm
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu. Thu nhận, bảo quản mẫu bệnh phẩm
• 2.5.1. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật PCR
• 2.5.2. Kỹ thuật điện di
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết DNA
• 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của lợn
• 3.1.2. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của gà
• 3.2. Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn. Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở gà
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử Ở Lợn Và Gà

Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) là một trong những bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi lợn và gà. Bệnh do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra, dẫn đến thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi. Việc phát hiện sớm và chính xác bệnh là rất quan trọng để kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe đàn vật nuôi.

1.1. Khái Niệm Về Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử

Bệnh viêm ruột hoại tử là một bệnh nhiễm trùng cấp tính, thường gặp ở lợn và gà. Bệnh gây ra bởi sự phát triển quá mức của vi khuẩn Clostridium perfringens trong đường ruột, dẫn đến tổn thương niêm mạc và triệu chứng nghiêm trọng.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Bệnh

Nghiên cứu bệnh viêm ruột hoại tử giúp xác định nguyên nhân, triệu chứng và phương pháp điều trị hiệu quả. Điều này không chỉ bảo vệ sức khỏe vật nuôi mà còn giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Phát Hiện Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử

Việc phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử gặp nhiều thách thức do triệu chứng không điển hình và sự tương đồng với các bệnh khác. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc chẩn đoán chính xác và kịp thời.

2.1. Triệu Chứng Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử

Triệu chứng của bệnh viêm ruột hoại tử bao gồm tiêu chảy, giảm ăn uống, và suy giảm sức khỏe. Những triệu chứng này có thể dễ dàng nhầm lẫn với các bệnh khác, gây khó khăn trong việc chẩn đoán.

2.2. Khó Khăn Trong Chẩn Đoán

Chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử thường dựa vào triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm. Tuy nhiên, việc sử dụng các phương pháp truyền thống có thể không đủ chính xác, dẫn đến việc điều trị không hiệu quả.

III. Phương Pháp Chẩn Đoán Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử Hiệu Quả

Để phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử một cách chính xác, các phương pháp chẩn đoán hiện đại như kỹ thuật PCR đã được áp dụng. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác vi khuẩn gây bệnh.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Chẩn Đoán

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp mạnh mẽ giúp phát hiện DNA của vi khuẩn Clostridium perfringens. Phương pháp này cho kết quả nhanh chóng và độ chính xác cao.

3.2. So Sánh Với Phương Pháp Truyền Thống

So với các phương pháp truyền thống, kỹ thuật PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao hơn và thời gian thực hiện ngắn hơn. Điều này giúp nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán bệnh.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử

Nghiên cứu về bệnh viêm ruột hoại tử không chỉ giúp phát hiện bệnh mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý và phòng ngừa bệnh trong chăn nuôi. Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để cải thiện sức khỏe đàn vật nuôi.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Và Ứng Dụng

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc áp dụng kỹ thuật PCR giúp phát hiện bệnh sớm, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời, giảm thiểu thiệt hại cho người chăn nuôi.

4.2. Tác Động Đến Ngành Chăn Nuôi

Nghiên cứu này có tác động tích cực đến ngành chăn nuôi, giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm, đồng thời bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử

Nghiên cứu bệnh viêm ruột hoại tử là cần thiết để bảo vệ sức khỏe vật nuôi và giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như PCR sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và điều trị bệnh.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Tương lai của nghiên cứu bệnh viêm ruột hoại tử sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của công nghệ sinh học, giúp cải thiện các phương pháp chẩn đoán và điều trị.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Người Chăn Nuôi

Người chăn nuôi cần áp dụng các biện pháp phòng ngừa và chẩn đoán bệnh hiệu quả để bảo vệ sức khỏe đàn vật nuôi và giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong ngành chăn nuôi gia súc và gia cầm tại Việt Nam, bệnh truyền nhiễm là trở ngại lớn gây suy giảm năng suất, giảm chất lượng thịt, giảm sản lượng trứng và có thể dẫn đến tử vong hàng loạt ở vật nuôi. Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis - NE) do vi khuẩn kỵ khí Clostridium perfringens gây ra là một trong những thách thức hàng đầu trên toàn cầu, với ước tính thiệt hại kinh tế riêng cho ngành gia cầm lên tới gần 2 tỷ USD vào năm 2015.

Tại Việt Nam, công tác chẩn đoán bệnh truyền nhiễm trên gia súc, gia cầm phần lớn vẫn phụ thuộc vào các phương pháp truyền thống như quan sát triệu chứng lâm sàng, mổ khám bệnh tích, nuôi cấy vi sinh và kiểm tra đặc tính hóa sinh. Do nhiều bệnh lý đường tiêu hóa (như cầu trùng, Salmonella, E. coli) có biểu hiện tương đồng, việc chẩn đoán truyền thống dễ dẫn đến nhầm lẫn, sử dụng kháng sinh không đúng mục tiêu, làm phát sinh hiện tượng kháng thuốc và hình thành các ổ dịch lưu hành. Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) với ưu điểm thao tác đơn giản, thời gian thực hiện nhanh, độ nhạy cao và khả năng định danh chính xác đến mức độ loài/chủng là giải pháp sinh học phân tử cần thiết để khắc phục các hạn chế trên.

Khóa luận thực hiện các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể sau:

1. Mục tiêu tổng quát: Phát hiện nhanh bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và lợn do chủng vi khuẩn Clostridium perfringens bằng kỹ thuật PCR nhằm hoàn thiện bộ kit chẩn đoán và ứng dụng trong giám sát bệnh truyền nhiễm trên gia súc, gia cầm.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • Tìm hiểu các quy trình tách chiết DNA đối với các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau (máu, mô ruột, phân) từ động vật đã được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh.
   • Tham khảo và lựa chọn cặp mồi đặc hiệu đối với tác nhân Clostridium perfringens.
   • Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi đặc hiệu bằng phương pháp PCR gradient nhiệt.
   • Xác nhận sự hiện diện của tác nhân gây bệnh trong các mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật PCR và điện di sản phẩm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Tác nhân vi khuẩn Clostridium perfringens hiện diện trong các mẫu bệnh phẩm máu, mô ruột và phân thu nhận từ lợn và gà nghi nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2019 đến tháng 05/2020.
• Phạm vi không gian: Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ gen và Di truyền phân tử, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và vi sinh vật học

• Đặc điểm vi khuẩn Clostridium perfringens: Trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,6 - 0,8 × 2 - 4 µm, kỵ khí không triệt để (yêu cầu 2 - 10% CO2), không di động, có khả năng sinh nội bào tử và hình thành giáp mô. Vi khuẩn tạo vòng dung huyết kép trên thạch máu động vật (vòng trong dung huyết hoàn toàn do độc tố beta, vòng ngoài dung huyết không hoàn toàn do độc tố alpha).
• Phân loại độc tố: C. perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố, trong đó dựa vào 4 độc tố chính (alpha - $\alpha$, beta - $\beta$, epsilon - $\varepsilon$, iota - $\iota$) để phân loại thành 5 typ độc tố (toxinotype A, B, C, D, E). Typ A (sinh độc tố $\alpha$) và typ C (sinh độc tố $\alpha$ và $\beta$) là hai tác nhân chính liên quan đến viêm ruột hoại tử ở gà và lợn.
• Gen chỉ thị phân tử: Đoạn gen mã hóa tiểu đơn vị ribosome 16S-rRNA của C. perfringens có kích thước khoảng 1,5 kb. Gen này có tính bảo thủ cao qua quá trình tiến hóa nhưng vẫn chứa các vùng trình tự đặc thù giữa các loài, được chọn làm mục tiêu thiết kế mồi PCR định danh.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu nhận và bảo quản mẫu: Mẫu máu được lấy qua tĩnh mạch dưới cánh gà hoặc chọc hút, bảo quản trong ống chứa chất chống đông EDTA; mẫu mô ruột bảo quản trong cồn tuyệt đối; mẫu phân thu bằng tăm bông tiệt trùng. Tất cả mẫu được vận chuyển trong thùng cách nhiệt chứa đá khô và lưu trữ ở 4°C.
• Tách chiết DNA: Sử dụng bộ kit thương mại G-spin™ Total DNA Extraction Kit (InTRON Biotechnology - Hàn Quốc) hoạt động theo nguyên lý hấp phụ DNA pha rắn/lỏng trên màng cột silica. Mẫu mô ruột được nghiền mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ trước khi ly giải.
• Thiết kế mồi và phản ứng PCR:
  • Sử dụng cặp mồi 16S_F/R (Wang et al., 1994) đặc hiệu cho gen 16S-rRNA của C. perfringens:
    • Mồi xuôi (16S_F): 5'-AAAGATGGCATCATCATTCAAC-3' (kích thước 22 bp, Tm 55°C, tỷ lệ G-C 36%).
    • Mồi ngược (16S_R): 5'-TACCGTCATTATCTTCCCCAAA-3' (kích thước 22 bp, Tm 55°C, tỷ lệ G-C 41%).
    • Kích thước đoạn khuếch đại lý thuyết: 279 bp.
  • Thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 20 µL): 10 µL PCR Master Mix 2X (chứa 2 mM dNTPs, 5 U Taq DNA polymerase, đệm PCR buffer, MgCl2), 1 µL mồi xuôi (10 µM), 1 µL mồi ngược (10 µM), 1 µL DNA khuôn (20 - 50 ng), 8 µL nước khử ion (dH2O).
• Tối ưu hóa chu trình nhiệt PCR: Khảo sát gradient nhiệt độ gắn mồi ($T_a$) ở các mức 50°C, 52°C, 55°C, 58°C và 60°C. Chu trình luân nhiệt: Biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; lặp lại 35 chu kỳ gồm (95°C trong 30 giây, gắn mồi 50 - 60°C trong 30 giây, kéo dài 72°C trong 1 phút); kéo dài ổn định ở 72°C trong 10 phút; giữ mẫu ở 4°C.
• Kỹ thuật điện di: Kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR trên gel agarose 1% pha trong đệm TAE 1X, bổ sung chất nhuộm acid nucleic Redsafe (hoặc Ethidium bromide). Điện di ở hiệu điện thế 60 - 80V trong 30 - 60 phút, quan sát băng sáng dưới tia UV so sánh với thang chuẩn DNA Ladder 100 bp và 1 kb.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan vấn đề nghiên cứu

Chương I hệ thống hóa cơ sở lý luận về bệnh truyền nhiễm, tác nhân gây bệnh (virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh, vi nấm) và phân tích các yếu tố thúc đẩy bệnh viêm ruột hoại tử bùng phát ở vật nuôi như chế độ dinh dưỡng (thức ăn chứa protein khó tiêu, bột cá, thiếu hụt arginine/glutamine, thừa acid lactic), độc tố nấm mốc (Mycotoxin từ Fusarium), bệnh cầu trùng (Eimeria) và nhiễm khuẩn phụ trợ (Salmonella).

Tác giả mô tả chi tiết biểu hiện bệnh lý trên gà (thể cấp tính gây ỉa phân sẫm màu có máu, ruột non sưng phồng hoại tử tạo mảng bựa vàng ngà; thể mãn tính làm còi cọc) và trên lợn (thể quá cấp tính chết trong vòng 8 giờ sau sinh, thể cấp tính 2 - 5 ngày tuổi tiêu chảy ra máu và mảng nhầy hoại tử niêm mạc ruột). Chương này cũng so sánh các kỹ thuật chẩn đoán:

• Phương pháp truyền thống: Chẩn đoán lâm sàng, bệnh tích mổ khám, hóa sinh phân tích, quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học (tồn tại nhược điểm độ nhạy thấp, dễ nhầm lẫn giữa các chủng có hình thái tương đồng).
• Phương pháp hiện đại: Kỹ thuật huyết thanh học ELISA (trực tiếp, gián tiếp, sandwich), miễn dịch huỳnh quang (IFA), lai phân tử với mẫu dò acid nucleic, và các kỹ thuật PCR cải tiến (Real-time PCR, RT-PCR, Nested-PCR, Multiplex-PCR). Đồng thời, tác giả tổng thuật các nghiên cứu ứng dụng PCR chẩn đoán bệnh thú y tại Việt Nam và trên thế giới.

Chương II: Mục tiêu, nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương II thiết lập cấu trúc thực nghiệm của đề tài, bao gồm danh mục thiết bị (tủ an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, máy luân nhiệt PCR, bể điện di, máy soi gel UV) và hóa chất (bộ kit G-spin, PCR Master Mix 2X, Redsafe, đệm TAE 50X). Chương này quy định chi tiết:

1. Quy trình thu thập và xử lý 3 nhóm mẫu bệnh phẩm (máu, mô ruột, phân).
2. Quy trình tách chiết DNA qua màng silica.
3. Thiết lập thông số phản ứng PCR cho cặp mồi 16S_F/R nhân bản gen 16S-rRNA.
4. Bố trí thí nghiệm gradient nhiệt (50 - 60°C) tìm nhiệt độ gắn mồi ($T_a$) tối ưu.
5. Quy trình đổ bản gel agarose 1%, thông số chạy điện di và phương pháp tính toán kích thước băng DNA dựa trên thang chuẩn 100 bp.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày kết quả thực nghiệm và biện luận chuyên sâu về hiệu quả tách chiết DNA và phản ứng PCR:

• Kết quả tách chiết DNA tổng số trên lợn: DNA từ mẫu máu (giếng 1) và mẫu mô ruột (giếng 3) cho vạch sáng rõ, đạt tiêu chuẩn làm khuôn PCR. DNA tách từ phân (giếng 2) không quan sát thấy vạch sáng rõ trên gel agarose 1% do hàm lượng thấp.
• Kết quả tách chiết DNA tổng số trên gà: Trong 4 mẫu máu, mẫu 01 cho nồng độ DNA cao nhất với dải smear ngắn; mẫu 02 và 03 có nồng độ thấp hơn nhưng đạt chất lượng; mẫu 04 không xuất hiện vạch nên bị loại bỏ. Đối với 2 mẫu mô ruột, mẫu 01 có hàm lượng DNA cao nhưng bị đứt gãy thành dải smear dài do quá trình nghiền mẫu trong nitơ lỏng không liên tục làm enzyme DNase nội bào hoạt động (cần pha loãng 50 lần trước khi chạy PCR); mẫu 02 không thu được DNA do thao tác lỗi ở bước ly tâm cột.
• Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: Thử nghiệm gradient nhiệt trên mẫu DNA phân lợn cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở 52°C, 55°C, 58°C và 60°C, trong khi ở 50°C không cho sản phẩm. Nhiệt độ gắn mồi 60°C tạo ra băng DNA đặc hiệu, sáng rõ nhất và không xuất hiện băng phụ.
• Kết quả phát hiện bệnh trên lợn: PCR với cặp mồi 16S_F/R ở 60°C cho kết quả dương tính (băng kích thước ~279 bp) duy nhất ở mẫu phân. Mẫu máu và mô ruột cho kết quả âm tính (giải thích: vi khuẩn C. perfringens là vi sinh vật kỵ khí cư trú đường tiêu hóa, ở giai đoạn bệnh khảo sát vi khuẩn chưa xâm nhập vào hệ tuần hoàn máu).
• Kết quả phát hiện bệnh trên gà: Phản ứng PCR trên 3 mẫu máu và 1 mẫu mô ruột (đã pha loãng) xác nhận chỉ có mẫu mô ruột cho kết quả dương tính với băng đặc hiệu 279 bp; cả 3 mẫu máu đều âm tính (giải thích: vi khuẩn cư trú trên lông nhung niêm mạc ruột, thời gian tồn tại trong máu ngắn hoặc đã bị ức chế bởi thuốc điều trị trước đó).
• Đánh giá quy trình tổng thể: Quy trình chẩn đoán từ khi tiếp nhận mẫu đến khi đọc kết quả điện di được chuẩn hóa và thực hiện hoàn tất trong thời gian 04 giờ.

Chương IV: Kết luận và kiến nghị

Chương IV đúc kết các kết quả đạt được về tách chiết DNA, xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu (60°C) và hiệu quả phát hiện C. perfringens trên phân lợn và mô ruột gà. Đồng thời, chương này đưa ra các khuyến nghị mở rộng phạm vi đối tượng gia súc, gia cầm, tối ưu hóa tách chiết DNA từ mẫu huyết tương (thay vì máu toàn phần), và phát triển các cặp mồi chuyên biệt để phân loại các typ độc tố (A - E) của vi khuẩn.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã chuẩn hóa quy trình sinh học phân tử để phát hiện nhanh vi khuẩn Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử trên gia súc và gia cầm.

Bảng tổng hợp kết quả tách chiết DNA và phát hiện PCR

Đối tượng	Loại mẫu bệnh phẩm	Chất lượng DNA tổng số trên gel agarose 1%	Kết quả phản ứng PCR (Mồi 16S_F/R, $T_a = 60^\circ\text{C}$)	Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp)
Lợn (Heo)	Máu	Đạt tiêu chuẩn, vạch rõ	Âm tính (Không xuất hiện băng)	-
	Mô ruột	Đạt tiêu chuẩn, vạch rõ	Âm tính (Không xuất hiện băng)	-
	Phân	Hàm lượng rất thấp (Không thấy vạch)	Dương tính (Băng đặc hiệu sáng rõ)	~279 bp
Gà	Máu (Mẫu 01, 02, 03)	Đạt tiêu chuẩn (Mẫu 01 đậm; Mẫu 02, 03 mờ)	Âm tính (Cả 3 mẫu không xuất hiện băng)	-
	Máu (Mẫu 04)	Không đạt (Loại bỏ)	Không thực hiện	-
	Mô ruột (Mẫu 01)	Nồng độ cao, DNA bị đứt gãy (smear)	Dương tính (Sau khi pha loãng 50 lần)	279 bp
	Mô ruột (Mẫu 02)	Không đạt do lỗi thao tác (Loại bỏ)	Không thực hiện	-

Đóng góp thực tiễn và phương pháp luận

1. Chuẩn hóa quy trình PCR 4 giờ: Rút ngắn toàn bộ thời gian xét nghiệm từ khâu xử lý mẫu, tách chiết DNA, phản ứng luân nhiệt 35 chu kỳ đến điện di kiểm tra xuống còn 04 giờ, đáp ứng yêu cầu chẩn đoán nhanh trong dịch tễ học thú y.
2. Xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu: Xác lập nhiệt độ gắn mồi thích hợp nhất của cặp mồi 16S_F/R là 60°C (thay vì mức 55°C theo tài liệu công bố ban đầu của Wang et al., 1994), giúp loại bỏ hoàn toàn các liên kết không đặc hiệu.
3. Định hướng loại mẫu bệnh phẩm chuẩn: Chứng minh thực nghiệm rằng đối với C. perfringens, mẫu phân (ở lợn) và mẫu mô ruột (ở gà) là các nguồn bệnh phẩm tin cậy nhất để tách chiết DNA đích; việc dùng mẫu máu toàn phần dễ dẫn đến kết quả âm tính giả do đặc tính kỵ khí và khả năng tồn tại thấp của vi khuẩn trong hệ tuần hoàn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Số lượng mẫu bệnh phẩm khảo sát còn hạn chế (03 mẫu bệnh phẩm trên lợn và 06 mẫu máu, 02 mẫu ruột trên gà).
• Thao tác nghiền mô ruột trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ thủ công chưa kiểm soát tuyệt đối nhiệt độ, dẫn đến hiện tượng enzyme DNase nội bào phân giải một phần DNA (tạo dải smear).
• Phương pháp tách chiết DNA từ máu toàn phần gặp khó khăn do nồng độ vi khuẩn trong máu thấp hoặc bị ức chế bởi các thành phần trong máu; chưa tách riêng phần huyết tương để đánh giá.
• Nghiên cứu mới dừng lại ở việc phát hiện sự hiện diện của loài Clostridium perfringens qua gen 16S-rRNA, chưa xác định cụ thể các typ độc tố (A, B, C, D, E) của vi khuẩn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục ứng dụng cặp mồi 16S_F/R để mở rộng kiểm tra phát hiện C. perfringens trên các đối tượng gia súc, gia cầm khác (vịt, chim cút, bò, cừu).
• Cải tiến quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu: Chuyển sang tách chiết từ huyết tương nhằm nâng cao khả năng thu nhận DNA vi khuẩn khi nhiễm trùng máu.
• Nghiên cứu thiết kế và phối hợp các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các gen mã hóa độc tố chính ($\alpha, \beta, \varepsilon, \iota$) để phân loại các typ độc tố của C. perfringens phục vụ công tác điều trị trúng đích.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng sau:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ sinh học, Thú y, Chăn nuôi: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật PCR một bước, các bước xử lý mẫu bệnh phẩm động vật và phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi bằng kỹ thuật gradient nhiệt.
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Cung cấp thông số vận hành chuẩn (thành phần nồng độ hóa chất phản ứng 20 µL, chu trình luân nhiệt, điều kiện điện di gel agarose 1% với chất nhuộm Redsafe) và quy trình chẩn đoán rút gọn trong 04 giờ.
• Cán bộ nghiên cứu bệnh học thú y: Tham khảo cơ sở thực nghiệm về sự phân bố của vi khuẩn C. perfringens trong các loại bệnh phẩm khác nhau (máu, mô ruột, phân) để lựa chọn mẫu xét nghiệm phù hợp, tránh hiện tượng âm tính giả.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi 16S_F/R sử dụng trong nghiên cứu có trình tự và thông số kỹ thuật như thế nào?

Cặp mồi 16S_F/R được sử dụng để nhân bản đoạn gen 16S-rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Clostridium perfringens (theo công bố của Rong-Fu Wang và cộng sự, 1994):

• Mồi xuôi (16S_F): 5'-AAAGATGGCATCATCATTCAAC-3' (chiều dài 22 bp, Tm = 55°C, tỷ lệ G-C = 36%).
• Mồi ngược (16S_R): 5'-TACCGTCATTATCTTCCCCAAA-3' (chiều dài 22 bp, Tm = 55°C, tỷ lệ G-C = 41%).
• Kích thước đoạn khuếch đại: 279 bp.

2. Nhiệt độ gắn mồi ($T_a$) tối ưu của phản ứng PCR được xác định là bao nhiêu?

Nhiệt độ gắn mồi tối ưu được xác định chính xác là 60°C. Thử nghiệm gradient nhiệt ở 5 dải nhiệt độ (50°C, 52°C, 55°C, 58°C, 60°C) trên mẫu phân lợn cho thấy ở 50°C phản ứng không tạo sản phẩm; ở 52°C, 55°C, 58°C và 60°C đều xuất hiện băng DNA, nhưng ở 60°C băng sản phẩm đạt độ sáng nét và độ đặc hiệu cao nhất.

3. Nguyên nhân gây đứt gãy DNA ở mẫu mô ruột gà và cách xử lý trong nghiên cứu là gì?

Hiện tượng DNA bị đứt gãy (xuất hiện dải smear kéo dài trên gel điện di) ở mẫu mô ruột gà số 01 xảy ra do quá trình nghiền mô bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng bị gián đoạn, nitơ bay hơi hết khiến mẫu không duy trì được độ lạnh sâu, tạo điều kiện cho enzyme DNase nội bào hoạt động cắt gãy DNA. Để khắc phục và đảm bảo phản ứng PCR không bị ức chế do hàm lượng DNA quá đặc, mẫu DNA này đã được pha loãng 50 lần trước khi đưa vào phản ứng PCR.

4. Tại sao các mẫu máu ở cả lợn và gà đều cho kết quả PCR âm tính trong khi mẫu phân và mô ruột lại dương tính?

Vi khuẩn Clostridium perfringens là vi khuẩn kỵ khí cư trú và bám dính chủ yếu trên lớp lông nhung niêm mạc ruột. Ở các cá thể khảo sát, vi khuẩn chủ yếu phát triển cục bộ trong lòng ruột và thải ra phân mà chưa xâm nhập vào hệ tuần hoàn máu. Ngoài ra, khả năng tồn tại của vi khuẩn trong môi trường dịch thể máu thấp hoặc vi khuẩn đã bị ức chế bởi thuốc kháng sinh điều trị, dẫn đến mẫu máu toàn phần không chứa đủ lượng DNA khuôn của vi khuẩn để phản ứng PCR phát hiện.

5. Thành phần một phản ứng PCR 20 µL trong khóa luận bao gồm những gì?

Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tích 20 µL, gồm:

• 10 µL Đệm 2X PCR Master Mix (chứa 2 mM dNTPs, 5 U Taq DNA polymerase, đệm và MgCl2).
• 1 µL Mồi xuôi 16S_F (nồng độ 10 µM).
• 1 µL Mồi ngược 16S_R (nồng độ 10 µM).
• 1 µL DNA khuôn (hàm lượng 20 - 50 ng).
• 8 µL Nước khử ion ($dH_2O$).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Lê Nhật Trang đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật PCR phát hiện nhanh vi khuẩn Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn và gà với thời gian thực hiện 04 giờ. Nghiên cứu đã xác định được nhiệt độ gắn mồi tối ưu của cặp mồi 16S_F/R là 60°C, tạo ra sản phẩm khuếch đại đặc hiệu kích thước 279 bp trên mẫu phân lợn và mẫu mô ruột gà. Kết quả thực nghiệm khẳng định tính ưu việt của phương pháp sinh học phân tử trong việc định danh chính xác mầm bệnh, đồng thời chỉ ra mẫu phân và mô ruột là nguồn bệnh phẩm tối ưu cho công tác chẩn đoán dịch tễ học thú y.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Bệnh truyền nhiễm 1. Khái niệm bệnh truyền nhiễm Bệnh truyền nhiễm là loại bệnh có khả năng lây lan nhanh chóng (từ một quần thể nhỏ đến cả một cộng đồng), thời gian ủ bệnh tương đối dài nên việc phát hiện và kiểm soát bệnh là một vấn đề khó khăn trong y tế dự phòng. Bên cạnh đó một số bệnh có những biểu hiện, triệu chứng bệnh có điểm tương tự nhau, bệnh xâm nhiễm ở một loài hay nhiều loài nhất định, mức độ phát tán và bệnh trạng phụ thuộc vào đặc tính hình thái, cấu tạo và cấu trúc sinh học của những tác nhân gây bệnh.

Bệnh truyền nhiễm là nguyên nhân chủ yếu làm trì trệ sự phát triển bền vững của lĩnh vực chăn nuôi, không chỉ thiệt hại về kinh tế, mà còn ảnh hưởng đến môi trường, và sức khỏe cộng đồng. Một số bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại ngành chăn nuôi gia cầm ở Việt Nam như: dịch cúm gia cầm (12/2003), nước ta đã phải thiêu hủy 38 triệu con tương đương với hơn 380 tỷ đồng (https://www.vn/kinhte/item/8045602-.html), hàng năm phải tiêu hủy hàng nghìn gia cầm do các trận dịch nhỏ, lẻ xảy ra thường xuyên rải rác khắp cả nước; hay bệnh viêm ruột hoại tử (NE), ORT (Vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale), viêm thanh khí quản (Gallid herpesvirus 1), tiêu chảy (Vi khuẩn Escherichia Coli), thương hàn (Salmonella Gallinarum),. đều là những bệnh phổ biến ở Việt Nam, bệnh xảy ra thường xuyên nếu gặp điều kiện thời tiết và dinh dưỡng thích hợp trong năm. Điển hình là những trận dịch lợn tai xanh (Arterivirus), lở mồm long móng (Aphthovirus) và gần đây nhất là dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever virus) đã gây thiệt hại vô cùng lớn cho ngành chăn nuôi (Đỗ Tiến Duy, 2015, 2016; Nguyễn Đình Quát, 2015).

Một số bệnh không gây tử vong nhưng thiệt hại kinh tế do chúng mang đến thậm chí còn nghiêm trọng hơn các bệnh gây tử vong, bởi hậu quả của những căn bệnh đó là làm vật chủ chậm phát triển và 2 giảm sản lượng trứng. Các tác nhân gây bệnh hầu hết đều là sinh vật nhân sơ, chúng chính là những sinh vật đơn bào có tần số đột biến cao, lợi thế về vòng đời ngắn ngủi giúp cho các tác nhân gây bệnh có thể dễ dàng hình thành nên một quần thể kháng kháng thể (hoặc kháng thuốc kháng sinh) mới thông qua tích lũy đột biến và các yếu tố chọn lọc. Ngoài ra, ở sinh vật nhân sơ cũng không có những yếu tố sửa sai hệ gen như ở sinh vật nhân thực, điều này dẫn đến tỉ lệ đột biến ở sinh vật nhân sơ tăng cao. Thứ yếu, sự phát tán bệnh từ một quần thể cách ly và nhỏ, bệnh lan truyền qua đường vận chuyển quốc tế, truyền máu,.

Thứ ba, sự phát tán của các virus có sẵn ở các sinh vật khác địa vực (sống cách ly), các nhà khoa học ước lượng rằng ba phần tư các bệnh mới bắt nguồn theo cách này. Các loài sinh vật được xem như là ổ chứa tự nhiên của các chủng virus, như bệnh SARS bùng phát năm 2002 ở Trung Quốc, nguyên nhân là dơi, ổ chứa bệnh SARS được bán làm thức ăn cùng thời điểm đó (World Health Organization). Một cách thức quan trọng khác là sự tái tổ hợp di truyền nếu một vật chủ bị lây nhiễm nhiều chủng virus cùng một thời điểm. Cụ thể hơn là virus cúm, được xem như là nguyên nhân dẫn đến bùng phát đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918, virus 1918 gây ra đại dịch được cho là hậu đại của 02 chủng virus cúm từ động vật có vú và loài chim thông qua sự trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift), (https://www.gov/flu/about/viruses/change.

Bệnh phát tán thường thông qua đường sol khí, hoặc tiếp xúc trực tiếp với dịch thể nhiễm bệnh (máu, nước bọt ,.), các dụng cụ ô nhiễm (kim tiêm, đồ dùng sinh hoạt ,.), hay vật trung gian (côn trùng, thức ăn ô nhiễm ,. Các tác nhân gây bệnh có thể phá hủy hay giết các tế bào bằng việc giải phóng enzyme thủy phân từ lysosome làm phân giải màng tế bào vật chủ, hoặc bản thân tác nhân có thành phần phân tử là độc tố như phần protein của lớp áo virus, phần lipid của vi khuẩn… Mức độ phá hủy tế bào chủ mà các tác nhân có thể gây ra phụ thuộc vào khả năng tái sinh của mô bị lây nhiễm qua quá trình phân chia tế bào. Nhiều 3 triệu chứng tạm thời liên quan đến sự lây nhiễm (như virus,.), bao gồm sốt cao, đau nhức thường là do các nỗ lực đáp ứng của chính cơ thể nhằm chống lại virus hơn là do các tế bào bị chết bởi virus. Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm Những tác nhân gây bệnh chính gồm virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh, vi nấm; ngoài ra còn có viroid (hiện vật chủ là thực vật) và prion (gây tổn hại đến hệ thần kinh động vật) được xem như là hai tác nhân gây bệnh nguy hiểm đơn giản nhất (Campbell, 2008).

Bệnh do virus và vi khuẩn gây ra có tỉ lệ tử vong cho vật chủ cao hơn so với các tác nhân gây bệnh khác. Hiện chưa có một loại thuốc hay kháng sinh nào tác động hữu hiệu đến virus, chỉ có thể chủng ngừa virus thông qua tiêm phòng vaccin. Virus Virus được xem là tác nhân gây bệnh nguy hiểm và khó kiểm soát nhất, phần lớn các ca tử vong do mắc bệnh truyền nhiễm đều là tác nhân virus gây ra. Virus là dạng sống ký sinh nội bào bắt buộc.

Virus gồm lõi (axit nucleic) được bọc bằng vỏ capsid (protein), một số chủng có thêm màng ngoài. Virus gây độc vật chủ bằng cách tiết enzyme thủy phân làm ly giải màng tế bào, hoặc bản thân lớp vỏ capsid của virus là độc tố có thể gây độc tế bào ảnh hưởng đến các quá trình sinh hóa trong tế bào. Hình thức sinh sản Chu kỳ sinh tan: virus sẽ xâm nhập tế bào chủ thông qua thụ thể đặc hiệu tồn tại trên tế bào chủ và tiêm vật chất di truyền (DNA, RNA) vào trong tế bào chủ. Virus sẽ trưng dụng hệ enzyme và nguyên vật liệu (dNTPs,.) của tế bào chủ để sao chép (tạo vật chất di truyền) và phiên mã, dịch mã (tạo vỏ capsid).

Hàm lượng vật chất di truyền và vỏ capsid đủ lớn, chúng sẽ tự đóng gói lại với nhau hoàn thiện thành các hạt virus hoàn chỉnh. Sau quá trình đóng gói chúng sẽ làm chết tế bào bằng cách ồ ạt phá vỡ tế bào và di chuyển sang các tế bào lân cận hay thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào. Chu kỳ tiềm tan: virus sẽ chèn vật chất di truyền của chúng vào trong 4 hệ gen tế bào chủ và cùng sao chép, phiên mã, dịch mã với hệ gen tế bào chủ. Virus ở dạng tiềm tan sẽ không gây chết đến tế bào.

Bên cạnh đó, khi gặp một số điều kiện kích thích nhất định, virus ở dạng tiềm tan sẽ chuyển sang dạng sinh tan và làm chết tế bào. Vi khuẩn Vi khuẩn được xem như là bậc thầy về khả năng thích nghi từ Deinococcus radiodurans có thể sống ở bức xạ 3 triệu rads đến Picrophilus oshimae sinh trưởng ở pH 0. Một số vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử khi gặp điều kiện môi trường bất lợi. Vi khuẩn hay còn gọi là vi trùng (sinh vật nhân sơ) vừa là sinh vật gây hại vừa là sinh vật có ích hoặc trung lập, vi khuẩn gây hại phần lớn là những vi khuẩn có dạng sống dị dưỡng (ký sinh) và có ích gồm các dạng sống cộng sinh (hệ vi sinh đường ruột,.) hoặc một số vi khuẩn có dạng sống tự dưỡng.

Vi khuẩn có cấu tạo phức tạp hơn virus, gồm màng tế bào, vùng nhân, plasmid và ribosome. Hệ gene vi khuẩn có từ vài trăm đến vài nghìn gene. Có 3 hình dạng phổ biến gồm hình cầu, hình que và hình xoắn. Dựa vào cấu trúc trên bề mặt tế bào, vi khuẩn có thể được chia làm 2 loại gồm khuẩn Gram (-) và khuẩn Gram (+).

Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh nhờ cấu trúc màng ngoài, vi khuẩn còn có plasmid R (DNA sợi đơn, dạng vòng) là một loại plasmid chứa các gen kháng kháng sinh. Khả năng sinh sản nhanh chóng là một ưu thế của vi khuẩn, vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi, từ một tế bào mẹ tạo thành hai tế bào con y hệt nhau và cứ thế chúng tiếp tục phân đôi. Trong những điều kiện tối thích hợp, nhiều chủng vi khuẩn cứ 1-3 tiếng lại phân chia, một số loài có thể tạo ra thế hệ mới chỉ trong thời gian 20 phút. Vi khuẩn gây bệnh bằng cách tạo ra các chất độc gồm ngoại độc tố và nội độc tố.

Ngoại độc tố là các protein được tiết ra bởi vi khuẩn như độc tố botulinum được tạo ra thông qua lên men nhiều loại thức ăn. Nội độc tố là các thành phần lớp màng ngoài lipopolysaccharide của nhóm khuẩn Gram (-). Động vật nguyên sinh Động vật nguyên sinh là nhóm động vật đơn bào (hoặc đa bào) hay còn gọi là ký sinh trùng thuộc nhóm nguyên sinh vật. Một số chủng phổ biến gây bệnh ở gia cầm như Histomonias -bệnh đầu đen, chi Eimeria – bệnh cầu trùng, bệnh ký sinh trùng máu do Leucocytotozoone, hoặc các loại bệnh giun, sán dây là những căn bệnh nghiêm trọng do nhóm động vật đơn bào gây ra trên gia cầm.

Hình thức sinh sản của nhóm động vật nguyên sinh khá là phức tạp, một số chỉ sinh sản vô tính, số khác còn có thể sinh sản hữu tính hoặc ít nhất sử dụng các quá trình hữu tính của giảm phân và thụ tinh. Hoặc vừa sinh sản vô tính vừa sinh sản hữu tính. Chi Eimeria thuộc nhóm động vật nguyên sinh vừa sinh sản hữu tính vừa sinh sản vô tính. Động vật nguyên sinh gây bệnh bằng cách phá hủy tế bào, mô hay các tổ chức cơ quan bằng enzyme thủy phân, các ngoại tiết tố làm mất cân bằng nội môi và ly giải màng tế bào.

Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà và lợn NE là bệnh nhiễm trùng ruột cấp tính; bệnh gây ra bởi vi khuẩn Clostridium perfringens, do mức độ hiện diện cao của C. perfringens trong môi trường bên trong lẫn bên ngoài cơ thể dẫn đến bệnh khá phổ biến trên khắp thế giới và bệnh có tỷ lệ tử vong cao trong đàn. perfringens là một loại vi khuẩn gần như có mặt ở khắp mọi nơi, từ trong đất, bụi, thức ăn cho đến đường ruột của động vật. Bệnh xảy ra do sự thay đổi hệ vi sinh đường ruột hoặc một tình trạng dẫn đến tổn thương niêm mạc ruột (chẳng hạn, bệnh cầu trùng, hay nhiễm khuẩn Salmonella thường là những tác nhân chính dẫn đến viêm ruột hoại tử).