MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 [1]. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, xuất khẩu NTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020; trong đó, ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minh châu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3].
Tuy nhiên, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu, gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam. Tháng 4 năm 2022, trong “Diễn đàn phát triển thủy sản bền vững”, lãnh đạo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã khẳng định việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trò quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra, trong đó việc bảo đảm kiểm soát chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuất ban đầu đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4]. Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụ NTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xác định được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ô nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV [5].
Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm [6-8]. Trước tình hình ô nhiễm thực phẩm do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao, cùng với những kết quả về tình trạng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển quy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết [7]. Hiện nay, trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và HAV trong thực phẩm thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và HEV còn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong công tác kiểm nghiệm. Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm bảo 1 độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản ứng Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc bốn tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 sẽ góp phần rút ngắn thời gian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho công tác điều trị.
Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, việc xác định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) là công đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởi các tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV, hướng tới đề xuất biện pháp ứng phó kịp thời, ngăn chặn sự lây lan vi rút trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về sức khỏe, kinh tế và xã hội. Do vậy, luận án “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử” đã được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013.
- Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thị trường - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Nội dung nghiên cứu 3. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 3. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 2 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 3.
Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2022 - So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 và năm 2022 3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong NTHMV 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.
Ý nghĩa khoa học - Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu dò có độ bao phủ cao với các trình tự HEV và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank. - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để có thể phát hiện được RNA của HEV và HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013; từ đó mở ra khả năng phát hiện và định lượng được 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và HAstV trong một lần chạy Real-time RT-PCR. - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV và HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút này - Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV và HAstV nhiễm tạp trong NTHMV, góp phần đánh giá nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp một quy trình phân tích cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV với tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ chạy cùng một chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mẫu thực phẩm, bệnh phẩm, môi trường nói chung để các cơ sở xét nghiệm có thể ứng dụng trong phân tích.
- Góp phần nâng cao năng lực kiểm soát an toàn thực phẩm, tăng tính cạnh tranh của NTHMV và các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị trường quốc tế. Tính mới của đề tài - Thiết kế, hiệu chỉnh được tổ hợp mồi, mẫu dò phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV có độ bao phủ cao với các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ liệu Genbank. - Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013. - Xác định được tỷ lệ và mức nhiễm tạp của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV trong năm 2016 và 2022 tại Việt Nam.
- Xác định được kiểu gen của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV trong năm 2016 tại Việt Nam. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm 1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ Theo FAO, nhu cầu đối với các mặt hàng NTHMV (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 do các hạn chế về COVID-19 đã giảm bớt ở các quốc gia tiêu thụ chính những mặt hàng này.000 tấn hàu đã được nhập khẩu trên toàn thế giới, cao hơn 15.000 tấn so với năm 2020 và thậm chí cao hơn 6.000 tấn so với năm 2019. Cũng trong năm 2021, tổng thương mại ngao trên toàn thế giới tăng, khoảng 287.000 tấn đã được nhập khẩu, nhiều hơn 20.000 tấn so với năm 2020 [1].
Việt Nam có đặc điểm địa lý thuận lợi để phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng các loài nhuyễn thể nhờ vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2 nằm bên bờ Tây của Biển Đông - là một biển lớn của Thái Bình Dương, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 cùng hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền [9]. Năm 2021, diện tích nhuyễn thể của Việt Nam đạt trên 35.000 ha, sản lượng 471.000 tấn; trong đó, diện tích và sản lượng nuôi ngao chiếm khoảng 50%; cụ thể, năm 2021, diện tích nuôi trên 17.000 ha, sản lượng đạt trên 236. Đến nay, nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu NTHMV của Việt Nam năm 2021 đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020.
Trong đó, ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2].