Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Phân Tích Vi Rút Gây Bệnh Trong Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ

Nghiên cứu về virus nhuyễn thể hai mảnh vỏ đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ ngành nuôi trồng nhuyễn thể… 203 trang · Đại học Bách Khoa Hà Nội · 2024.

• Tác giả: Phan Thị Thanh Hà
• Người hướng dẫn: TS. Lê Quang Hòa
• Trường học: Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Tích Vi Rút Gây Bệnh Trong Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Virus Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ 55

Nghiên cứu về virus nhuyễn thể hai mảnh vỏ đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ ngành nuôi trồng nhuyễn thể và đảm bảo an toàn thực phẩm. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ, bao gồm ngao, sò, hàu, và trai, là nguồn thực phẩm quan trọng. Tuy nhiên, chúng dễ bị nhiễm virus gây bệnh, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và gây thiệt hại kinh tế lớn. Bệnh virus nhuyễn thể có thể lây lan nhanh chóng, gây ra các đợt dịch bệnh nghiêm trọng. Việc nghiên cứu các phương pháp phân tích virus hiệu quả là điều cần thiết để kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh nhuyễn thể. Nghiên cứu này tập trung vào các virus gây bệnh ở thủy sản thường gặp như Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus (HAstV), đồng thời xây dựng các quy trình chẩn đoán bệnh virus nhuyễn thể tiên tiến. Báo cáo thống kê của FAO cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể tăng mạnh, vì vậy, cần bảo đảm chất lượng sản phẩm.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu bệnh virus nhuyễn thể

Nghiên cứu bệnh học nhuyễn thể giúp xác định các tác nhân gây bệnh, hiểu rõ cơ chế lây nhiễm và phát triển bệnh. Điều này rất quan trọng để đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả, bảo vệ sức khỏe nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Các biện pháp này bao gồm kiểm soát môi trường nuôi trồng, sử dụng giống kháng bệnh, và áp dụng các biện pháp vệ sinh an toàn thực phẩm. Theo lãnh đạo Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn, việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trò quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản.

1.2. Các loại virus phổ biến gây bệnh cho nhuyễn thể

Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus (HAstV) là những virus gây hại ngao, sò, hàu, trai thường gặp. Chúng gây ra các bệnh về đường tiêu hóa và gan, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra tình trạng đồng nhiễm nhiều loại virus trong cùng một mẫu bệnh phẩm, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Việc phát hiện và phân loại virus gây bệnh nhuyễn thể đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát dịch bệnh.

II. Thách Thức Kiểm Soát Virus Trên Nhuyễn Thể 52 ký tự

Việc kiểm soát virus gây bệnh trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ gặp nhiều thách thức. Khả năng tích lũy virus ở nhuyễn thể từ môi trường ô nhiễm là một vấn đề lớn. Các biện pháp phòng bệnh virus nhuyễn thể truyền thống thường không hiệu quả hoàn toàn. Việc thiếu các quy trình phân tích virus thủy sản chuẩn hóa cũng gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm. Thêm vào đó, sự xuất hiện của các chủng virus mới và biến thể làm phức tạp thêm quá trình chẩn đoán bệnh virus nhuyễn thể. Một số nghiên cứu về các virus tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân virus trên cùng một mẫu bệnh phẩm. Việc phát triển quy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân virus gây bệnh truyền qua thực phẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết.

2.1. Khả năng tích lũy virus từ môi trường ô nhiễm

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có khả năng lọc nước và tích lũy các vi sinh vật gây bệnh nhuyễn thể, bao gồm cả virus, từ môi trường xung quanh. Khi môi trường ô nhiễm, nồng độ virus trong nhuyễn thể tăng cao, làm tăng nguy cơ lây nhiễm cho người tiêu dùng. Cần có các biện pháp quản lý dịch bệnh nhuyễn thể và kiểm soát ô nhiễm môi trường để giảm thiểu nguy cơ này.

2.2. Thiếu quy trình phân tích virus chuẩn hóa

Hiện nay, chưa có nhiều quy trình xét nghiệm virus trên nhuyễn thể được chuẩn hóa, gây khó khăn cho việc so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm và đánh giá chính xác mức độ ô nhiễm virus. Quy trình ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và HAV nhưng các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và HEV còn chưa được chuẩn hóa. Việc phát triển và áp dụng các quy trình chuẩn hóa là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của các xét nghiệm phát hiện virus ở nhuyễn thể.

III. Phương Pháp PCR Phát Hiện Virus Nhuyễn Thể 53

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp phân tích virus hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong việc phát hiện và định lượng virus trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. PCR virus nhuyễn thể cho phép khuếch đại đoạn gen đặc trưng của virus, giúp phát hiện virus ngay cả khi nồng độ thấp. Kỹ thuật Real-time PCR (RT-PCR) cho phép định lượng virus một cách chính xác. RT-PCR virus nhuyễn thể ngày càng trở nên phổ biến nhờ tính nhanh chóng và độ nhạy cao. Luận án tập trung xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013.

3.1. Ưu điểm của kỹ thuật Real time RT PCR

Real-time RT-PCR có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống, bao gồm độ nhạy cao, khả năng định lượng chính xác, và thời gian phân tích ngắn. Kỹ thuật này cho phép phát hiện virus nhuyễn thể hai mảnh vỏ với độ tin cậy cao. Real-time RT-PCR được sử dụng để phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV.

3.2. Ứng dụng Real time RT PCR trong kiểm nghiệm

Real-time RT-PCR được ứng dụng rộng rãi trong công tác kiểm nghiệm thực phẩm, giúp phát hiện virus gây bệnh ở thủy sản và đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Kỹ thuật này cho phép kiểm tra nhanh chóng và chính xác các mẫu nhuyễn thể, từ đó đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh kịp thời. Real-time RT-PCR phục vụ xét nghiệm nhanh virus này.

3.3. Xây dựng quy trình Real time RT PCR cho HEV và HAstV

Luận án này tập trung vào việc xây dựng quy trình Real-time RT-PCR để phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Quy trình này được thiết kế để tương thích với chu trình nhiệt được mô tả trong tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013, giúp đơn giản hóa quy trình kiểm nghiệm. Mục tiêu là phát hiện và định lượng virus gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.

IV. Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Virus 57

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử virus nhuyễn thể rất quan trọng để hiểu rõ sự lây lan và phát triển của virus. Việc xác định kiểu gen virus giúp theo dõi sự biến đổi của virus và đánh giá nguy cơ gây bệnh. Phân tích sinh học phân tử virus nhuyễn thể cho phép phát hiện các chủng virus mới và biến thể. Thông tin này rất hữu ích cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Nghiên cứu sẽ phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các virus gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.

4.1. Vai trò của việc xác định kiểu gen virus

Xác định kiểu gen virus cho phép theo dõi sự biến đổi của virus và đánh giá nguy cơ gây bệnh. Thông tin này rất quan trọng để đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh phù hợp. Phân tích kiểu gen giúp xác định nguồn gốc và đường lây lan của virus.

4.2. Ứng dụng trong phòng ngừa dịch bệnh

Thông tin về kiểu gen virus được sử dụng để phát triển các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh hiệu quả, bao gồm vaccine và các phương pháp điều trị. Nắm vững đặc điểm sinh học phân tử virus nhuyễn thể giúp dự đoán sự lây lan của dịch bệnh và đưa ra các biện pháp ứng phó kịp thời.

V. Tình Hình Nhiễm Virus Trong Nhuyễn Thể 55 ký tự

Nghiên cứu này sẽ khảo sát tình hình nhiễm virus gây bệnh truyền nhiễm trên nhuyễn thể trên thị trường. Phân tích tỷ lệ nhiễm các loại virus như Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV) trong các mẫu nhuyễn thể được thu thập. So sánh tình hình nhiễm virus giữa các năm, khu vực và loại nhuyễn thể khác nhau. Đánh giá ảnh hưởng của virus đến nhuyễn thể và nguy cơ lây nhiễm cho người tiêu dùng. Đánh giá tình trạng virus gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và 2022.

5.1. Tỷ lệ nhiễm virus theo loại nhuyễn thể

So sánh tỷ lệ nhiễm virus giữa các loại nhuyễn thể khác nhau (ngao, sò, hàu, trai) để xác định loại nào dễ bị nhiễm virus hơn. Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm virus, bao gồm điều kiện nuôi trồng, môi trường sống, và phương pháp thu hoạch.

5.2. Phân bố nồng độ virus trong mẫu dương tính

Xác định nồng độ virus trong các mẫu nhuyễn thể dương tính với virus để đánh giá mức độ ô nhiễm và nguy cơ lây nhiễm. Phân tích sự phân bố nồng độ virus theo loại nhuyễn thể, khu vực, và thời gian thu thập mẫu.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Về Virus 52 ký tự

Nghiên cứu về virus nhuyễn thể hai mảnh vỏ là một lĩnh vực quan trọng và cần thiết. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin hữu ích cho việc quản lý và kiểm soát dịch bệnh, bảo vệ ngành nuôi trồng nhuyễn thể và đảm bảo an toàn thực phẩm. Hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh virus hiệu quả hơn, cũng như tìm hiểu sâu hơn về tác nhân gây bệnh nhuyễn thể. Các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các virus gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn chế.

6.1. Phát triển biện pháp phòng ngừa và điều trị

Nghiên cứu tiếp tục tập trung vào việc phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh virus hiệu quả hơn, bao gồm vaccine và các phương pháp điều trị dựa trên sinh học phân tử virus nhuyễn thể. Tìm kiếm các chất ức chế virus tự nhiên và an toàn để sử dụng trong nuôi trồng nhuyễn thể.

6.2. Nghiên cứu sâu hơn về tác nhân gây bệnh

Tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của các virus gây bệnh ở nhuyễn thể, bao gồm tương tác giữa virus và tế bào chủ, và các yếu tố ảnh hưởng đến sự lây lan của virus. Phân tích sự biến đổi di truyền của virus và khả năng kháng thuốc của chúng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết của đề tài

Báo cáo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) trên toàn cầu tăng mạnh trong năm 2021. Tại Việt Nam, theo số liệu của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), kim ngạch xuất khẩu NTHMV năm 2021 đạt 141,6 triệu USD (tăng 35% so với năm 2020), trong đó ngao chiếm 73% (103 triệu USD), tiếp đến là hàu. NTHMV của Việt Nam đã xuất khẩu đến 42 quốc gia, với thị trường tiêu thụ lớn nhất là Liên minh châu Âu (EU), chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu. Tuy nhiên, EU áp dụng các quy chuẩn kỹ thuật và kiểm soát an toàn thực phẩm nghiêm ngặt. Thực tế trong giai đoạn 2020–2021, nhiều lô hàng hàu tươi ướp đá xuất khẩu của Việt Nam đã bị cảnh báo do nhiễm Norovirus (10 lô năm 2020 và 2 lô năm 2021). Tại thị trường nội địa, Thông tư số 33/2015/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cũng quy định việc giám sát bắt buộc đối với vi rút trong NTHMV.

NTHMV sinh sống theo phương thức lọc nước lấy thức ăn, dẫn đến nguy cơ tích lũy cao các vi rút gây bệnh đường ruột từ nguồn nước ô nhiễm. Hơn 100 loại vi rút đường ruột có thể hiện diện trong thực phẩm bị ô nhiễm, trong đó Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV) là các tác nhân phổ biến gây viêm dạ dày ruột cấp và viêm gan. Các nghiên cứu dịch tễ ghi nhận tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm và mẫu thực phẩm.

Khoảng trống nghiên cứu

Hiện nay, phương pháp Real-time RT-PCR phát hiện NoV và HAV đã được tiêu chuẩn hóa quốc tế theo ISO 15216-1:2013. Tuy nhiên, các quy trình xét nghiệm HEV và HAstV vẫn tồn tại riêng lẻ, chưa được chuẩn hóa đồng bộ về chu trình nhiệt với ISO 15216-1:2013, làm tăng thời gian và chi phí phân tích khi cần tầm soát đồng thời cả bốn tác nhân. Mặt khác, các bộ mồi công bố trước đây đối với HEV và HAstV chưa bao phủ đầy đủ các biến chủng mới trên GenBank. Tại Việt Nam, dữ liệu về tỷ lệ lưu hành, mức độ nhiễm tạp và đặc điểm sinh học phân tử (kiểu gen) của NoV, HAV, HEV, HAstV trong NTHMV thương phẩm còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013.
2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thị trường.
3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Bốn loại vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm gồm NoV (nhóm GI, GII), HAV, HEV, HAstV; mẫu thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ (ngao, hàu, sò, trai...).
• Phạm vi không gian: Các chợ truyền thống và siêu thị tại Việt Nam, cùng bối cảnh kiểm soát hàng thủy sản xuất khẩu.
• Phạm vi thời gian: Khảo sát, thu thập và phân tích mẫu NTHMV tại hai mốc thời gian là năm 2016 và năm 2022; luận án hoàn thành năm 2024.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước trên thế giới

• Dịch tễ học ngộ độc thực phẩm do vi rút trong NTHMV: Thống kê 359 vụ ngộ độc do tiêu thụ NTHMV giai đoạn 1980–2012 của các tác giả quốc tế chỉ ra NoV chiếm 83,7% và HAV chiếm 12,8% [10]. Tại Mỹ, NoV gây ra 19–21 triệu ca bệnh và 570–800 ca tử vong mỗi năm [11]. Khảo sát của Cơ quan An toàn Sản phẩm Tiêu dùng và Thực phẩm Hà Lan (NVWA, 2013–2017) phát hiện 45,5% mẫu NTHMV dương tính với NoV [12]. Tại Thái Lan, tỷ lệ nhiễm NoV trong NTHMV là 12,3% (hàu 14%, ngao 6%) [13]. Về HAV, vụ dịch tại Thượng Hải năm 1988 do ăn ngao ô nhiễm khiến gần 300.000 người mắc [14]; hai vụ dịch tại Tây Ban Nha năm 1999 (184 ca) và 2008 (100 ca) do nhập khẩu ngao từ Peru [15]. Nghiên cứu của David Polo và cộng sự phát hiện tỷ lệ nhiễm HAV đạt 50% trên các mẫu NTHMV nhập khẩu từ Việt Nam [16]. Về HEV, khảo sát tại vịnh Bột Hải (Trung Quốc) ghi nhận 17,5% mẫu NTHMV dương tính [18]; tại Tây Ban Nha, Rivadulla phát hiện 24,4% mẫu nhiễm HEV-3 [20]; tại Scotland, 85% mẫu trai dương tính với HEV [19]. Về HAstV, Vilarino phát hiện 12,2% mẫu NTHMV tại Tây Ban Nha nhiễm vi rút [23]; Diem Lan Vu ghi nhận 13,3% mẫu dương tính với 66% trường hợp đồng nhiễm [22].
• Kỹ thuật tách chiết và phát hiện phân tử: Nghiên cứu của Metcalf (1980) và Maalouf (2011) chứng minh nồng độ vi rút tập trung chủ yếu tại tuyến tiêu hóa của NTHMV, việc xử lý riêng tuyến tiêu hóa giúp tăng độ nhạy phát hiện lên 100 lần và loại bỏ chất ức chế [63, 64]. Các nghiên cứu của Le Guyader và cộng sự (2006–2013) hoàn thiện phương pháp giải phóng vi rút bằng proteinase K và tinh sạch RNA bằng hạt từ silica, làm cơ sở cho bộ tiêu chuẩn ISO/TS 15216-1:2013 [58-62].
• Hệ thống mồi và mẫu dò Real-time RT-PCR: Phát hiện NoV và HAV dựa trên tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 [66]. Phát hiện HEV sử dụng bộ mồi của Jothikumar (2006, vùng ORF3, 69 bp) [86] và Schlosser (2014, vùng ORF3, 81 bp) [87]. Phát hiện HAstV sử dụng bộ mồi của Le Cann (2004, vùng 3'UTR, 90 bp) [70]. Nghiên cứu của Cuevas-Ferrando (2020), Fusco (2019) và Goh (2019) đã áp dụng các bộ mồi này để tối ưu chu trình nhiệt [88, 91, 92].
• Công nghệ biến tính mồi/mẫu dò (MGB và LNA): Nghiên cứu của Afonina (1997, 2000) và Garson (2017) chứng minh Minor Groove Binders (MGB) gắn ở đầu 3' giúp tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm), cho phép rút ngắn chiều dài mẫu dò và tăng độ nhạy đối với các biến thể đột biến [100-102]. Nghiên cứu của Braasch (2000), Letertre (2003) và Wang (2018) chứng minh Locked Nucleic Acids (LNA) giúp tăng Tm từ 1–8°C mỗi gốc và tăng độ nhạy phản ứng lên đến 100 lần [98, 103, 107].
• Xác định kiểu gen: Sử dụng kỹ thuật Nested RT-PCR và giải trình tự gen. Mồi định typ NoV của Kojima (2002) nhắm vào vùng VP1 [114]; mồi HAV của Taffon (2011) nhắm vào vùng VP1/2A [116]; mồi HEV của Fogeda (2009, vùng 5'MeT) và Okamoto (2001, vùng ORF2) [119, 120]; mồi HAstV của Hata (2014, vùng giao ORF1b-ORF2) [123].

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Các công bố trong nước trước đây tập trung chủ yếu trên mẫu lâm sàng (phân, huyết thanh của bệnh nhân):

Tác nhân	Địa điểm	Thời gian	Cỡ mẫu	Số dương tính	Tỷ lệ (%)	Phương pháp	Tài liệu trích dẫn
NoV	TP. Hồ Chí Minh	11/2008	252	34	13,5	ELISA	[8]
NoV	Đồng Tháp	11/2008	110	4	3,6	ELISA	[8]
NoV	TP. Hồ Chí Minh	2002–2003	1010	57	5,5	RT-PCR	[7]
NoV	Khánh Hòa	12/2005–06/2006	183	12	6,6	RT-PCR	[160]
NoV	Hà Nội	2007–2008	501	180	36,0	Real-time RT-PCR	[8]
NoV	TP. Hồ Chí Minh	2009–2010	1419	292	20,6	RT-PCR	[161]
HAstV	TP. Hồ Chí Minh	2002–2003	1010	6	0,6	RT-PCR	[7]
HAstV	Thái Bình	2011–2012	410	10	2,4	Real-time RT-PCR	[6]
Đồng nhiễm	TP. Hồ Chí Minh	2002–2003	1010	57	5,5	ELISA-PCR	[7]
Đồng nhiễm	Thái Bình	2011–2012	410	70	17,1	Real-time RT-PCR	[6]

Nghiên cứu của Nguyễn Vân Trang (2007–2013) ghi nhận NoV GII.4 là kiểu gen lưu hành ưu thế (>20% là GII.3, bên cạnh các dòng GI.1–GI.13) [162]. Khảo sát huyết thanh học về HEV tại huyện Duy Tiên, Hà Nam (2015) ghi nhận tỷ lệ kháng thể IgG anti-HEV là 26,5% và IgM là 0,8% [164].

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Luận án lấp đầy khoảng trống kỹ thuật bằng việc thiết kế lại bộ mồi/mẫu dò HEV và HAstV ứng dụng MGB/LNA để đồng bộ hóa hoàn toàn điều kiện phản ứng với chu trình nhiệt ISO 15216-1:2013; đồng thời cung cấp bộ cơ sở dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về tỷ lệ nhiễm, tải lượng và biến chủng di truyền của cả 4 nhóm vi rút trên NTHMV tại thị trường Việt Nam qua hai giai đoạn 2016 và 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Đặc điểm sinh học của các vi rút mục tiêu

• Norovirus (NoV): Họ Caliciviridae, hệ gen RNA sợi đơn dương (+ssRNA) kích thước ~7,6 kb, không vỏ bọc, đối xứng hình khối 20 mặt (đường kính 27–35 nm). Hệ gen gồm 3 khung đọc mở: ORF1 mã hóa polyprotein 194 kDa (được protease cắt thành N-Term, NTPase, p22, VPg, 3C-like protease và RdRp 57 kDa); ORF2 mã hóa protein capsid VP1; ORF3 mã hóa protein cấu trúc nhỏ VP2. Phân chia thành 10 nhóm gen (GI–GX, 49 kiểu gen), trong đó NoV GI và GII gây bệnh chủ yếu ở người. Vùng bảo thủ phát hiện: ranh giới ORF1–ORF2; vùng xác định kiểu gen: VP1.
• Hepatitis A virus (HAV): Họ Picornaviridae, hệ gen +ssRNA kích thước ~7,5 kb, hạt vi rút đối xứng 20 mặt (27–32 nm). Cấu trúc gồm: 5'UTR (735–745 nt, bảo thủ >89%, chứa cấu trúc bậc hai IRES và liên kết VPg-3B), một ORF duy nhất (vùng P1 mã hóa capsid VP1–VP4; vùng P2, P3 mã hóa protein phi cấu trúc 2A–3D) và 3'UTR poly(A). Có 1 serotype và 6 kiểu gen; vùng bảo thủ phát hiện: 5'NCR; vùng xác định kiểu gen: VP1/2A (đoạn 168 nt).
• Hepatitis E virus (HEV): Họ Hepeviridae, hệ gen +ssRNA kích thước ~7,2 kb, hạt vi rút 20 mặt đối xứng. Cấu trúc gồm 5'NTR, 3'NTR, ORF1 (mã hóa MeT, Hel, RdRp), ORF2 (capsid protein 660 aa), ORF3 (protein chức năng 113 aa), vùng tiếp giáp JR và hai yếu tố cis-reactive element (CRE1, CRE2 dạng stem-loop). Có 7 kiểu gen (HEV-1 đến HEV-7; HEV-1, 2, 3, 4, 7 lây nhiễm ở người) chia thành 26 phân typ. Vùng bảo thủ phát hiện: tiếp giáp ORF2–ORF3; vùng xác định kiểu gen: 5'MeT và ORF2.
• Human Astrovirus (HAstV): Họ Astroviridae, hệ gen +ssRNA kích thước ~6,8 kb, hạt vi rút hình cầu cắt góc lục giác (28–35 nm), không vỏ ngoài. Hệ gen gồm ORF1a, ORF1b (mã hóa serine protease và RNA polymerase) và ORF2 (mã hóa protein capsid), có vùng tín hiệu trượt khung dịch mã frameshift signal và vùng ORF-X bảo thủ. Gồm 8 kiểu gen (HAstV1–HAstV8), trong đó HAstV1 chiếm >80% tại châu Á. Vùng bảo thủ phát hiện: 3'UTR; vùng xác định kiểu gen: giao điểm ORF1b–ORF2.

Phương pháp xử lý mẫu và tách chiết RNA vi rút

• Thu nhận và băm nhỏ mô tuyến tiêu hóa của NTHMV (khối lượng phân tích từ 1,5 g đến 2,0 g tuyến tiêu hóa mỗi mẫu).
• Phân giải mô và giải phóng vi rút bằng enzyme Proteinase K kết hợp xử lý nhiệt ở 37°C và 60°C để làm biến tính các protein nền mẫu và bất hoạt enzyme RNase nội sinh.
• Phá vỡ capsid vi rút bằng muối biến tính Guanidinium Isothiocyanate (GuSCN); bắt giữ và tinh sạch RNA trên hệ thống hạt từ silica, loại bỏ triệt để các chất ức chế phản ứng (polysaccharide, lipid, protein).

Thiết kế mồi, mẫu dò và ứng dụng công nghệ MGB/LNA

• Khảo sát độ bao phủ của các trình tự mồi gốc từ ngân hàng dữ liệu NCBI GenBank.
• Hiệu chỉnh trình tự và gắn cấu trúc biến tính để tăng Tm tương thích nhiệt độ bắt cặp 60°C của ISO 15216-1:2013:
  • Gắn phân tử MGB (Minor Groove Binders) vào đầu 3' của mẫu dò huỳnh quang TaqMan.
  • Thay thế các nucleotide chuẩn bằng nucleotide LNA (Locked Nucleic Acids - dẫn xuất khóa cầu 2'-O, 4'-C methylene) tại các vị trí đặc thù trên mồi và mẫu dò.

Tác nhân vi rút	Mồi / Mẫu dò	Trình tự nucleotide (5' – 3')	Kích thước đoạn gen	Vùng gen khuếch đại	Tài liệu tham khảo
NoV GI	QNIF4 NV1LCR NVGG1p	CGC TGG ATG CGN TTC CAT CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC TGG ACA GGA GAY CGC RATCT	86 bp	ORF1–ORF2	ISO 15216 [66]
NoV GII	QNIF2 COG2R QNIFs	ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA AGCACGTGGGAGGGCGATCG	89 bp	ORF1–ORF2	ISO 15216 [66]
HAV	HAV68 HAV240 HAV150(-)	TCA CCG CCG TTT GCC TAG GGA GAG CCC TGG AAG AAA G CCTGAACCTGCAGGAATTAA	173 bp	5'NCR	ISO 15216 [66]
HEV	JVHEVF JVHEVR JVHEVP	GGTGGTTTCTGGGG TGAC AGGGGTTGGTTGGATGAA TGATTCTCAGCCCTTCGC	69 bp	ORF3	Jothikumar, 2006 [86]
HEV	HEV.Fa HEV.Fb HEV.R HEV.P	GTG CCG GCG GTG GTT TC GTG CCG GCG GTG GTT TCT G GCG AAG GGG TTG GTT GGA TG TGACMG GGTTGATTCTC AGCC	81 bp	ORF3	Schlosser, 2014 [87]
HAstV	AV1 AV2 AVs	CCG AGT AGG ATC GAG GGT GCT TCT GAT TAA ATC AAT TTT AA CTTTTCTGTCTCTGTTTAGATTATTTTAATCACC	90 bp	3'UTR	Le Cann, 2004 [70]

Phương pháp phân tích sinh học phân tử thực nghiệm

• Tạo mẫu chuẩn (RNA standard): Nhân dòng đoạn gen mục tiêu vào vector plasmid pJET1.2, biến nạp vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α, sàng lọc dòng tái tổ hợp bằng colony PCR và giải trình tự khẳng định. Thực hiện phiên mã in vitro tổng hợp RNA chứng dương để xây dựng đường chuẩn định lượng và xác định giới hạn phát hiện.
• Kỹ thuật Real-time RT-PCR định lượng: Sử dụng kít SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit.
  • Chu trình nhiệt theo ISO 15216-1:2013: Phiên mã ngược tại 55°C trong 60 phút; hoạt hóa enzyme tại 95°C trong 5 phút; chạy 45 chu kỳ gồm biến tính 95°C (15 giây), bắt cặp mồi 60°C (60 giây), kéo dài 65°C (60 giây).
  • Chu trình nhiệt rút gọn: Tối ưu hóa phản ứng 2 bước (kết hợp bắt cặp và kéo dài mạch) nhằm rút ngắn thời gian xét nghiệm nhanh.
  • Xác định đặc tính kỹ thuật: Giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính đường chuẩn, hiệu suất khuếch đại và kiểm tra phản ứng chéo với các vi sinh vật khác.
• Kỹ thuật xác định kiểu gen (Genotyping): Thực hiện phản ứng Nested RT-PCR qua hai vòng khuếch đại (vòng 1 mồi ngoài, vòng 2 mồi trong). Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch, giải trình tự trực tiếp (Sanger sequencing), xử lý và gióng hàng trình tự với các chủng tham chiếu trên GenBank bằng phần mềm chuyên dụng, dựng cây phát sinh loài (phylogenetic tree).
• Phân tích thống kê: Dữ liệu tỷ lệ nhiễm, mức độ nhiễm và các biến số dịch tễ được thu thập, xử lý và kiểm định bằng phần mềm SPSS.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của việc bảo đảm an toàn thực phẩm đối với ngành hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ xuất khẩu và tiêu thụ nội địa tại Việt Nam; xác định rõ 3 mục tiêu nghiên cứu, 3 nội dung trọng tâm; nêu bật ý nghĩa khoa học trong việc làm chủ kỹ thuật sinh học phân tử và ý nghĩa thực tiễn phục vụ kiểm nghiệm, đánh giá rủi ro an toàn thực phẩm.

Chương 1: Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm; Tổng quan các phương pháp nghiên cứu

• Hiện trạng sản xuất và thách thức: Diện tích nuôi trồng NTHMV tại Việt Nam đạt trên 35.000 ha với sản lượng 471.000 tấn (năm 2021). Kim ngạch xuất khẩu chịu sức ép lớn từ các tiêu chuẩn kiểm soát vi rút của thị trường EU và cảnh báo RASFF.
• Tổng quan 4 tác nhân vi rút: Phân tích chi tiết cấu trúc hạt vi rút, cấu trúc hệ gen, các khung đọc mở (ORF), protein chức năng và tính bền vững của NoV, HAV, HEV, HAstV trước tác nhân lý hóa môi trường (chịu được dải pH rộng, nhiệt độ tới 60°C, chất tẩy rửa clo).
• Đánh giá các phương pháp phân tích: So sánh kỹ thuật RT-LAMP, RT-PCR truyền thống và Real-time RT-PCR. Kết luận Real-time RT-PCR là công cụ có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, hạn chế nhiễm chéo và cho phép định lượng chính xác nồng độ bản sao vi rút trong nền mẫu phức tạp.
• Cơ sở công nghệ MGB và LNA: Nguyên lý liên kết rãnh nhỏ của MGB và cơ chế khóa cầu phân tử đường của LNA giúp tăng Tm từ 1–8°C, cho phép thiết kế các đoạn mồi/mẫu dò kích thước ngắn nhưng có ái lực liên kết cao, tăng độ đặc hiệu đối với các vùng gen bảo thủ có kích thước hẹp.
• Tổng quan dịch tễ phân tử: Tổng hợp chi tiết tình hình lưu hành các nhóm gen, kiểu gen NoV (GI, GII), HAV (IA, IB, IIIA), HEV (HEV-1 đến HEV-4) và HAstV (HAstV-1 đến HAstV-8) trên thế giới và tại Việt Nam.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

• Vật liệu nghiên cứu: Mẫu NTHMV thu thập tại các chợ và siêu thị; các chủng vi rút kiểm soát; chủng vi khuẩn E. coli DH5α; vector tách dòng pJET1.2; các hóa chất sinh học phân tử đạt chuẩn phân tích.
• Quy trình thiết kế và tối ưu Real-time RT-PCR: Quy trình lựa chọn và hiệu chỉnh mồi/mẫu dò HEV (tổ hợp A và B dựa trên Schlosser và Jothikumar) và HAstV (dựa trên Le Cann); khảo sát nồng độ ion Mg²⁺, nồng độ mồi, nồng độ mẫu dò; tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (Ta) và thời gian các bước trong chu trình nhiệt.
• Quy trình xác định đặc tính kỹ thuật: Phương pháp đánh giá độ nhạy phân tích (LOD, LOD95%), khoảng định lượng (LOQ), xây dựng đường chuẩn định lượng và kiểm tra độ đặc hiệu/phản ứng chéo.
• Quy trình giám sát thực địa: Phương pháp lấy mẫu, xử lý tuyến tiêu hóa, tách chiết RNA vi rút đồng loạt từ mẫu NTHMV thu thập trong hai đợt (2016 và 2022).
• Quy trình giải trình tự và phân tích phả hệ: Các cặp mồi Nested RT-PCR vòng ngoài và vòng trong cho từng vi rút, thành phần phản ứng PCR, chu trình nhiệt luân nhiệt và phương pháp dựng cây phát sinh loài.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ

• Quy trình phát hiện và định lượng HEV:
  • Đã hiệu chỉnh và thiết kế 2 tổ hợp mồi/mẫu dò ứng dụng công nghệ MGB và LNA (tổ hợp HEV-A và HEV-B) nhắm vào vùng bảo thủ ORF3.
  • Tách dòng thành công đoạn gen đích vào vector pJET1.2, biến nạp vào E. coli DH5α, khẳng định bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự DNA; tổng hợp thành công RNA chứng dương chuẩn bằng phiên mã in vitro.
  • Tối ưu hóa nồng độ Mg²⁺, nồng độ mồi và nồng độ mẫu dò cho phản ứng; tối ưu thành công điều kiện phản ứng tương thích hoàn toàn với chu trình nhiệt ISO 15216-1:2013.
  • Xây dựng thành công chu trình nhiệt rút gọn (kết hợp bắt cặp và kéo dài mạch) phục vụ xét nghiệm nhanh.
  • Xác định giới hạn phát hiện LOD95%, khoảng định lượng LOQ và thiết lập đường chuẩn định lượng có độ tuyến tính cao; thử nghiệm phản ứng chéo khẳng định độ đặc hiệu tuyệt đối với các tác nhân không mục tiêu.
• Quy trình phát hiện và định lượng HAstV:
  • Hiệu chỉnh bộ mồi/mẫu dò nhắm vào vùng 3'UTR của HAstV kết hợp công nghệ LNA để nâng nhiệt độ nóng chảy Tm.
  • Tách dòng và tạo hạt chuẩn RNA qua vector pJET1.2 và phiên mã in vitro.
  • Tối ưu hóa nồng độ hóa chất, nhiệt độ gắn mồi và thời gian phản ứng cho cả hai chu trình: chu trình nhiệt ISO 15216-1:2013 và chu trình nhiệt rút gọn.
  • Xác định các thông số LOD95%, khoảng định lượng LOQ, đường chuẩn định lượng và chứng minh không có phản ứng chéo.

2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

• Đợt khảo sát năm 2016: Phân tích tỷ lệ nhiễm và mức độ nhiễm tải lượng RNA của NoV (GI, GII), HAV, HEV và HAstV trên các chủng loại NTHMV thu thập tại các chợ truyền thống và siêu thị; ghi nhận tỷ lệ nhiễm đơn và tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu theo thời điểm lấy mẫu.
• Đợt khảo sát năm 2022: Đánh giá sự hiện diện, tỷ lệ mẫu dương tính và phân bố nồng độ bản sao của 4 loại vi rút trên các nhóm mẫu NTHMV tại các điểm bán lẻ và siêu thị.
• So sánh biến động dịch tễ 2016 và 2022: So sánh tổng hợp sự thay đổi về tỷ lệ nhiễm vi rút, cơ cấu tác nhân gây nhiễm chiếm ưu thế và phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính giữa hai mốc thời gian cách nhau 6 năm.

3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

• Phân tích NoV: Thực hiện phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại vùng gen ORF1–ORF2 và VP1 của NoV GI và NoV GII từ các mẫu NTHMV dương tính; giải trình tự gen, xây dựng cây phát sinh loài, xác định sự phân bố các kiểu gen NoV GI và NoV GII lưu hành trên thị trường.
• Phân tích HEV: Khuếch đại Nested RT-PCR thành công vùng gen đặc hiệu, giải trình tự và đối chiếu phát sinh loài với các chủng HEV tham chiếu trên GenBank để xác định kiểu gen HEV lưu hành.
• Phân tích HAstV: Khuếch đại Nested RT-PCR vùng gen giao điểm ORF1b–ORF2 của các mẫu HAstV phát hiện được; giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài của các chủng HAstV thu nhận từ NTHMV tại Việt Nam.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

1. Thiết kế và hiệu chỉnh thành công các tổ hợp mồi và mẫu dò huỳnh quang ứng dụng công nghệ MGB và LNA có độ bao phủ cao trên các biến chủng HEV và HAstV hiện có trong cơ sở dữ liệu GenBank.
2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HEV và HAstV tương thích hoàn toàn với chu trình luân nhiệt của tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013; từ đó tạo khả năng chạy đồng thời 4 phản ứng phân tích NoV, HAV, HEV, HAstV trong cùng một mẻ xét nghiệm trên cùng một thiết bị.
3. Thiết lập chu trình nhiệt rút gọn (2 bước) cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV và HAstV, rút ngắn thời gian phân tích phục vụ yêu cầu xét nghiệm nhanh.
4. Cung cấp bộ dữ liệu khoa học về tỷ lệ nhiễm tạp, mức độ nhiễm và tình trạng đồng nhiễm của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV, HAstV trong NTHMV trên thị trường Việt Nam tại hai thời điểm 2016 và 2022.
5. Xác định thành công các kiểu gen di truyền (genotype) của NoV GI, NoV GII, HEV và HAstV lưu hành trong NTHMV tại Việt Nam.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Cung cấp quy trình kiểm nghiệm phân tử hoàn chỉnh, có độ nhạy và độ tin cậy cao để các phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, y tế dự phòng và kiểm soát thủy sản áp dụng trong giám sát chất lượng NTHMV cũng như các nền mẫu thực phẩm, môi trường nước.
• Hỗ trợ các cơ quan quản lý nhà nước và doanh nghiệp thủy sản đáp ứng yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt của các thị trường nhập khẩu (như EU, Mỹ, Nhật Bản) và phục vụ việc thực thi Thông tư số 33/2015/TT-BNNPTNT.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đưa quy trình phân tích đồng thời 4 vi rút vào hệ thống giám sát định kỳ tại các vùng nuôi trồng và cơ sở chế biến, kinh doanh NTHMV.
• Tăng cường kiểm soát nguồn nước thải tại các vùng nuôi để ngăn chặn nguy cơ ô nhiễm chéo vi rút đường ruột vào chuỗi thực phẩm.
• Khuyến cáo người tiêu dùng thực hiện chế biến nhiệt đầy đủ đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ trước khi sử dụng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các đợt thu thập mẫu NTHMV tập trung tại các kênh phân phối bán lẻ (chợ truyền thống, siêu thị) tại hai thời điểm cắt ngang (năm 2016 và năm 2022), chưa bao phủ toàn diện chuỗi cung ứng từ các vùng nuôi trồng tự nhiên và bãi thu hoạch trên phạm vi toàn quốc.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng phạm vi giám sát dọc theo chuỗi từ vùng nước nuôi trồng, cơ sở sơ chế đến bàn ăn.
  • Nghiên cứu phát triển phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR gộp 4 tác nhân trong cùng một giếng phản ứng để tối ưu hóa chi phí hóa chất.
  • Phân tích dịch tễ học phân tử chuyên sâu nhằm so sánh phả hệ giữa các chủng vi rút phân lập từ NTHMV với các chủng vi rút phân lập trực tiếp từ các bệnh nhân viêm dạ dày ruột và viêm gan tại các bệnh viện ở Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh vật học, Dịch tễ học và Thú y thủy sản.
  • Cán bộ kiểm nghiệm: Tại các viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (Viện Dinh dưỡng, Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia), trung tâm kiểm chuẩn y tế, phòng phân tích chất lượng của NAFIQAD và các doanh nghiệp chế biến thủy hải sản.
  • Cơ quan quản lý: Cục An toàn Thực phẩm (Bộ Y tế), Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn).
• Nội dung trọng tâm cần tham khảo:
  • Trình tự mồi và mẫu dò cải tiến gắn MGB/LNA, kỹ thuật nhân dòng vector pJET1.2 và phiên mã in vitro tạo RNA chuẩn (Chương 2 và Chương 3).
  • Quy trình xử lý mẫu tuyến tiêu hóa NTHMV bằng Proteinase K kết hợp hạt từ silica (Chương 1 và Chương 2).
  • Dữ liệu so sánh tỷ lệ nhiễm và phả hệ di truyền của các chủng vi rút (Chương 3).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao luận án lại điều chỉnh chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV và HAstV theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013?

Tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 hiện chỉ quy định phát hiện NoV và HAV. Các quy trình phát hiện HEV và HAstV trước đây sử dụng các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác biệt. Việc hiệu chỉnh mồi/mẫu dò của HEV và HAstV để chạy chung một chu trình nhiệt chuẩn của ISO 15216-1:2013 (phiên mã ngược ở 55°C, bắt cặp ở 60°C, kéo dài ở 65°C) cho phép kỹ thuật viên có thể phân tích đồng thời cả bốn tác nhân trên cùng một phiến phản ứng trong một lần vận hành máy, giúp tiết kiệm thời gian, nhân lực và chi phí xét nghiệm.

2. Vai trò của việc ứng dụng công nghệ MGB và LNA trong thiết kế mồi và mẫu dò của luận án là gì?

Vùng gen đích bảo thủ của HEV (ORF3) và HAstV (3'UTR) có kích thước ngắn và hàm lượng nucleotide biến đổi. Việc bổ sung phân tử MGB ở đầu 3' hoặc kết hợp các nucleotide LNA vào mạch oligonucleotide làm tăng độ bền liên kết lai và nâng nhiệt độ nóng chảy (Tm) từ 1–8°C. Nhờ đó, các đoạn mồi và mẫu dò được thiết kế ngắn hơn nhưng vẫn đảm bảo độ đặc hiệu, độ nhạy cao và bắt cặp ổn định tại nhiệt độ 60°C của quy trình ISO.

3. Vì sao quy trình tách chiết vi rút lại tập trung xử lý tuyến tiêu hóa của nhuyễn thể hai mảnh vỏ thay vì toàn bộ mô cơ thể?

Các nghiên cứu của Metcalf (1980) và Maalouf (2011) chỉ ra rằng vi rút đường ruột tích tụ chủ yếu ở tuyến tiêu hóa của NTHMV qua quá trình lọc thức ăn. Khối lượng tuyến tiêu hóa chỉ chiếm khoảng 1/10 trọng lượng cơ thể nhưng chứa hầu hết phần tử vi rút. Tách chiết riêng tuyến tiêu hóa (1,5–2,0 g) giúp làm tăng nồng độ vi rút lên 100 lần, giảm thời gian xử lý và loại bỏ phần lớn các hợp chất ức chế PCR có trong các mô khác.

4. Luận án sử dụng các hệ mồi Nested RT-PCR nào để xác định kiểu gen của bốn loại vi rút?

Luận án sử dụng các hệ mồi Nested RT-PCR đã được kiểm chứng trên thế giới:

• NoV: Bộ mồi của Kojima và cộng sự (2002) nhắm vào vùng gen mã hóa vỏ capsid VP1.
• HAV: Bộ mồi của Taffon và cộng sự (2011) nhắm vào vùng tiếp giáp VP1/2A.
• HEV: Hai bộ mồi của Fogeda và cộng sự (2009, vùng 5'MeT) và Okamoto và cộng sự (2001, vùng ORF2).
• HAstV: Bộ mồi của Hata và cộng sự (2014) nhắm vào vùng giao điểm ORF1b–ORF2.

5. Thông số chu trình nhiệt luân nhiệt theo ISO 15216-1:2013 được áp dụng trong luận án gồm các bước nào?

Chu trình nhiệt bao gồm: giai đoạn phiên mã ngược mRNA thành cDNA ở 55°C trong 60 phút; giai đoạn hoạt hóa enzyme polymerase ở 95°C trong 5 phút; tiếp theo là 45 chu kỳ khuếch đại gồm 3 bước: biến tính ở 95°C trong 15 giây, bắt cặp mồi ở 60°C trong 60 giây và kéo dài mạch ở 65°C trong 60 giây.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Hà đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xây dựng phương pháp sinh học phân tử đồng bộ để phân tích bốn nhóm vi rút có nguy cơ cao (NoV, HAV, HEV, HAstV) trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Thông qua việc ứng dụng công nghệ MGB và LNA, tác giả đã chuẩn hóa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV và HAstV theo chu trình nhiệt của tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013, đồng thời phát triển chu trình nhiệt rút gọn phục vụ xét nghiệm nhanh. Công trình đã cung cấp các dữ liệu thực nghiệm có giá trị về thực trạng nhiễm tạp vi rút tại Việt Nam trong hai năm 2016 và 2022 cùng các dẫn liệu phân loại kiểu gen di truyền của các chủng vi rút lưu hành, đóng góp cơ sở khoa học và công cụ thực tiễn phục vụ công tác kiểm soát an toàn thực phẩm thủy sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 [1]. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, xuất khẩu NTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020; trong đó, ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minh châu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3].

Tuy nhiên, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu, gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam. Tháng 4 năm 2022, trong “Diễn đàn phát triển thủy sản bền vững”, lãnh đạo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã khẳng định việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trò quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra, trong đó việc bảo đảm kiểm soát chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuất ban đầu đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4]. Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụ NTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xác định được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ô nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV [5].

Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm [6-8]. Trước tình hình ô nhiễm thực phẩm do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao, cùng với những kết quả về tình trạng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển quy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết [7]. Hiện nay, trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và HAV trong thực phẩm thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và HEV còn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong công tác kiểm nghiệm. Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm bảo 1 độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản ứng Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc bốn tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 sẽ góp phần rút ngắn thời gian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho công tác điều trị.

Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, việc xác định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) là công đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởi các tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV, hướng tới đề xuất biện pháp ứng phó kịp thời, ngăn chặn sự lây lan vi rút trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về sức khỏe, kinh tế và xã hội. Do vậy, luận án “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử” đã được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013.

- Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thị trường - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Nội dung nghiên cứu 3. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 3. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 2 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 3.

Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2022 - So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 và năm 2022 3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong NTHMV 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.

Ý nghĩa khoa học - Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu dò có độ bao phủ cao với các trình tự HEV và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank. - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để có thể phát hiện được RNA của HEV và HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013; từ đó mở ra khả năng phát hiện và định lượng được 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và HAstV trong một lần chạy Real-time RT-PCR. - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV và HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút này - Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV và HAstV nhiễm tạp trong NTHMV, góp phần đánh giá nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp một quy trình phân tích cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV với tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ chạy cùng một chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mẫu thực phẩm, bệnh phẩm, môi trường nói chung để các cơ sở xét nghiệm có thể ứng dụng trong phân tích.

- Góp phần nâng cao năng lực kiểm soát an toàn thực phẩm, tăng tính cạnh tranh của NTHMV và các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị trường quốc tế. Tính mới của đề tài - Thiết kế, hiệu chỉnh được tổ hợp mồi, mẫu dò phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV có độ bao phủ cao với các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ liệu Genbank. - Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013. - Xác định được tỷ lệ và mức nhiễm tạp của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV trong năm 2016 và 2022 tại Việt Nam.

- Xác định được kiểu gen của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV trong năm 2016 tại Việt Nam. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm 1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ Theo FAO, nhu cầu đối với các mặt hàng NTHMV (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 do các hạn chế về COVID-19 đã giảm bớt ở các quốc gia tiêu thụ chính những mặt hàng này.000 tấn hàu đã được nhập khẩu trên toàn thế giới, cao hơn 15.000 tấn so với năm 2020 và thậm chí cao hơn 6.000 tấn so với năm 2019. Cũng trong năm 2021, tổng thương mại ngao trên toàn thế giới tăng, khoảng 287.000 tấn đã được nhập khẩu, nhiều hơn 20.000 tấn so với năm 2020 [1].

Việt Nam có đặc điểm địa lý thuận lợi để phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng các loài nhuyễn thể nhờ vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2 nằm bên bờ Tây của Biển Đông - là một biển lớn của Thái Bình Dương, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 cùng hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền [9]. Năm 2021, diện tích nhuyễn thể của Việt Nam đạt trên 35.000 ha, sản lượng 471.000 tấn; trong đó, diện tích và sản lượng nuôi ngao chiếm khoảng 50%; cụ thể, năm 2021, diện tích nuôi trên 17.000 ha, sản lượng đạt trên 236. Đến nay, nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu NTHMV của Việt Nam năm 2021 đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020.

Trong đó, ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2].