Luận án tiến sĩ: Phân tích vi rút nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

• Tác giả: Phan Thị Thanh Hà
• Người hướng dẫn: TS. Lê Quang Hòa
• Trường học: Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phương Pháp Phân Tích Vi Rút Nguy Cơ Cao Trong Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.5. Tính mới của đề tài
• 2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT, TIÊU THỤ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ THÁCH THỨC VỀ AN TOÀN THỰC PHẨM
• 2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 2.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 2.3. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 3. QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI RÚT TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ
• 3.1. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút
• 3.2. Các phương pháp xác định vi rút
• 3.3. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR
• 3.3.1. Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi, mẫu dò trong phản ứng Real – time RT - PCR
• 3.3.2. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders)
• 3.3.3. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids)
• 3.4. Phương pháp xác định kiểu gen vi rút
• 3.4.1. Kỹ thuật Nested RT - PCR
• 3.4.2. Kỹ thuật giải trình tự Sanger
• 4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CÁC KIỂU GEN CỦA NOV, HAV, HEV, HASTV TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
• 4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 5. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Vật liệu nghiên cứu
• 5.2. Vật liệu kiểm soát
• 5.3. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 5.4. Phương pháp nghiên cứu
• 5.5. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 5.6. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 5.7. Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 6.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.1.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV
• 6.1.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro
• 6.1.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013
• 6.1.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
• 6.1.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013
• 6.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.2.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV
• 6.2.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro
• 6.2.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013
• 6.2.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
• 6.2.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013
• 6.3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.3.1. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016
• 6.3.2. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2022
• 6.3.3. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022
• 6.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.4.1. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.4.2. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.4.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ BỔ TRỢ CỦA LUẬN ÁN
• PHỤ LỤC 2: SẢN PHẨM CỦA LUẬN ÁN

I. Tính cấp thiết của đề tài

Nghiên cứu về phân tích vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) trở nên cấp thiết do nhu cầu tiêu thụ gia tăng và các vấn đề an toàn thực phẩm. Theo báo cáo của FAO, nhu cầu đối với NTHMV đã tăng mạnh trong năm 2021. Việt Nam đã xuất khẩu NTHMV đạt 141,6 triệu USD, trong đó ngao chiếm 73%. Tuy nhiên, thị trường EU có quy định nghiêm ngặt về an toàn thực phẩm, tạo ra thách thức cho ngành nuôi trồng. Việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể cần đảm bảo kiểm soát chất lượng từ khâu sản xuất đến chế biến. Tình trạng viêm dạ dày ruột và viêm gan do tiêu thụ NTHMV nhiễm vi rút là vấn đề đáng lo ngại. Các vi rút như Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus (HAstV) thường gặp trong NTHMV. Nghiên cứu cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều vi rút trong cùng một mẫu, điều này nhấn mạnh sự cần thiết phát triển quy trình phát hiện và định lượng các vi rút này.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xây dựng quy trình phân tích vi rút nguy cơ cao trong NTHMV. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc phát hiện và định lượng các vi rút như NoV, HAV, HEV và HAstV. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu sẽ phát triển các phương pháp tách chiết RNA vi rút và xác định vi rút bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR. Quy trình này sẽ được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Việc phát triển quy trình này không chỉ giúp nâng cao chất lượng kiểm nghiệm mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và an toàn thực phẩm. Nghiên cứu cũng sẽ phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút để hiểu rõ hơn về sự lưu hành và tính đa dạng của chúng trong NTHMV.

III. Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm nhiều khía cạnh quan trọng liên quan đến phân tích vi rút trong NTHMV. Đầu tiên, nghiên cứu sẽ khảo sát tình hình sản xuất và tiêu thụ NTHMV, đồng thời đánh giá tình trạng nhiễm vi rút trong các mẫu. Tiếp theo, nghiên cứu sẽ xây dựng quy trình phát hiện và định lượng vi rút dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút sẽ được áp dụng để đảm bảo chất lượng mẫu. Nghiên cứu cũng sẽ sử dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng cường độ nhạy của phản ứng. Cuối cùng, việc phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút sẽ giúp xác định kiểu gen và mối liên hệ giữa các chủng vi rút, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho công tác quản lý và kiểm soát dịch bệnh.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc. Về mặt khoa học, việc phát triển quy trình phân tích vi rút sẽ đóng góp vào kho tàng kiến thức về vi rút gây bệnh trong NTHMV. Nó sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về sinh học phân tử và dịch tễ học của các vi rút này. Về mặt thực tiễn, quy trình phát hiện và định lượng vi rút sẽ giúp các cơ quan chức năng kiểm soát chất lượng thực phẩm, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao an toàn thực phẩm. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh nhu cầu tiêu thụ NTHMV ngày càng tăng và các quy định nghiêm ngặt từ thị trường quốc tế. Nghiên cứu cũng sẽ hỗ trợ ngành nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững và đáp ứng yêu cầu của thị trường.