Luận án tiến sĩ nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Phan Thị Thanh Hà
• Người hướng dẫn: TS. Lê Quang Hòa
• Trường học: Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phương Pháp Phân Tích Vi Rút Nguy Cơ Cao Trong Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.5. Tính mới của đề tài
• 2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT, TIÊU THỤ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ THÁCH THỨC VỀ AN TOÀN THỰC PHẨM
• 2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 2.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 2.3. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 3. QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI RÚT TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ
• 3.1. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút
• 3.2. Các phương pháp xác định vi rút
• 3.3. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR
• 3.3.1. Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi, mẫu dò trong phản ứng Real – time RT - PCR
• 3.3.2. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders)
• 3.3.3. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids)
• 3.4. Phương pháp xác định kiểu gen vi rút
• 3.4.1. Kỹ thuật Nested RT - PCR
• 3.4.2. Kỹ thuật giải trình tự Sanger
• 4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CÁC KIỂU GEN CỦA NOV, HAV, HEV, HASTV TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
• 4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 5. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Vật liệu nghiên cứu
• 5.2. Vật liệu kiểm soát
• 5.3. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 5.4. Phương pháp nghiên cứu
• 5.5. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 5.6. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 5.7. Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 6.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.1.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV
• 6.1.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro
• 6.1.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013
• 6.1.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
• 6.1.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013
• 6.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.2.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV
• 6.2.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro
• 6.2.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013
• 6.2.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
• 6.2.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013
• 6.3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.3.1. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016
• 6.3.2. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2022
• 6.3.3. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022
• 6.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.4.1. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.4.2. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• 6.4.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ BỔ TRỢ CỦA LUẬN ÁN
• PHỤ LỤC 2: SẢN PHẨM CỦA LUẬN ÁN

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Nghiên cứu về phân tích vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) trở nên cấp thiết do nhu cầu tiêu thụ gia tăng và các vấn đề an toàn thực phẩm. Theo báo cáo của FAO, nhu cầu đối với NTHMV đã tăng mạnh trong năm 2021. Việt Nam đã xuất khẩu NTHMV đạt 141,6 triệu USD, trong đó ngao chiếm 73%. Tuy nhiên, thị trường EU có quy định nghiêm ngặt về an toàn thực phẩm, tạo ra thách thức cho ngành nuôi trồng. Việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể cần đảm bảo kiểm soát chất lượng từ khâu sản xuất đến chế biến. Tình trạng viêm dạ dày ruột và viêm gan do tiêu thụ NTHMV nhiễm vi rút là vấn đề đáng lo ngại. Các vi rút như Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus (HAstV) thường gặp trong NTHMV. Nghiên cứu cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều vi rút trong cùng một mẫu, điều này nhấn mạnh sự cần thiết phát triển quy trình phát hiện và định lượng các vi rút này.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xây dựng quy trình phân tích vi rút nguy cơ cao trong NTHMV. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc phát hiện và định lượng các vi rút như NoV, HAV, HEV và HAstV. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu sẽ phát triển các phương pháp tách chiết RNA vi rút và xác định vi rút bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR. Quy trình này sẽ được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Việc phát triển quy trình này không chỉ giúp nâng cao chất lượng kiểm nghiệm mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và an toàn thực phẩm. Nghiên cứu cũng sẽ phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút để hiểu rõ hơn về sự lưu hành và tính đa dạng của chúng trong NTHMV.

III. Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm nhiều khía cạnh quan trọng liên quan đến phân tích vi rút trong NTHMV. Đầu tiên, nghiên cứu sẽ khảo sát tình hình sản xuất và tiêu thụ NTHMV, đồng thời đánh giá tình trạng nhiễm vi rút trong các mẫu. Tiếp theo, nghiên cứu sẽ xây dựng quy trình phát hiện và định lượng vi rút dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút sẽ được áp dụng để đảm bảo chất lượng mẫu. Nghiên cứu cũng sẽ sử dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng cường độ nhạy của phản ứng. Cuối cùng, việc phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút sẽ giúp xác định kiểu gen và mối liên hệ giữa các chủng vi rút, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho công tác quản lý và kiểm soát dịch bệnh.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc. Về mặt khoa học, việc phát triển quy trình phân tích vi rút sẽ đóng góp vào kho tàng kiến thức về vi rút gây bệnh trong NTHMV. Nó sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về sinh học phân tử và dịch tễ học của các vi rút này. Về mặt thực tiễn, quy trình phát hiện và định lượng vi rút sẽ giúp các cơ quan chức năng kiểm soát chất lượng thực phẩm, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao an toàn thực phẩm. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh nhu cầu tiêu thụ NTHMV ngày càng tăng và các quy định nghiêm ngặt từ thị trường quốc tế. Nghiên cứu cũng sẽ hỗ trợ ngành nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững và đáp ứng yêu cầu của thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử" do nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Hà thực hiện tại Đại học Bách khoa Hà Nội (năm 2023), thuộc ngành Công nghệ Sinh học (Mã số: 9420201), dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai.

1. Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Ngành sản xuất và xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) đóng vai trò kinh tế quan trọng. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, kim ngạch xuất khẩu NTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD (tăng 35% so với năm 2020), trong đó ngao chiếm 73% (gần 103 triệu USD) và tiếp đến là hàu. NTHMV Việt Nam đã xuất khẩu sang 42 quốc gia, với thị trường tiêu thụ lớn nhất là Liên minh châu Âu (EU) chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu.

Tuy nhiên, với đặc tính ăn lọc nước để lấy dinh dưỡng, NTHMV có khả năng tích lũy các vi sinh vật gây bệnh từ môi trường nước bị ô nhiễm. Trong hơn 100 loại vi rút đường ruột được ghi nhận ở người, bốn nhóm tác nhân truyền qua thực phẩm có nguy cơ cao và phổ biến gồm: Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV). Các vụ cảnh báo an toàn thực phẩm quốc tế liên tục được đưa ra, điển hình là các lô hàng hàu tươi ướp đá từ Quảng Ninh bị cảnh báo nhiễm NoV (10 lô năm 2020 và 2 lô năm 2021).

Khoảng trống nghiên cứu thực tế bao gồm:

• Tiêu chuẩn quốc tế ISO 15216-1:2013 mới chỉ chuẩn hóa quy trình Real-time RT-PCR cho NoV và HAV. Các quy trình phát hiện HEV và HAstV vẫn tồn tại riêng lẻ, chưa được đồng bộ về điều kiện nhiệt để phân tích đồng thời với chu trình của ISO 15216-1:2013.
• Hiện tượng đồng nhiễm nhiều loại vi rút trong cùng một mẫu NTHMV diễn ra phức tạp, đòi hỏi giải pháp kỹ thuật tích hợp.
• Dữ liệu dịch tễ phân tử và sự lưu hành các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV, HAstV trong NTHMV tại thị trường Việt Nam còn rất hạn chế.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác lập 3 mục tiêu cụ thể:

1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong NTHMV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013.
2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV trên thị trường.
3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Bốn loại vi rút gây bệnh đường ruột truyền qua thực phẩm (NoV, HAV, HEV, HAstV) và mẫu NTHMV (ngao, hàu...).
• Phạm vi không gian: Các chợ truyền thống và siêu thị tại Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Đánh giá tình trạng nhiễm và biến động lưu hành kiểu gen qua hai mốc thời gian năm 2016 và năm 2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các tài liệu dịch tễ học quốc tế đã chỉ ra mức độ nguy hại của các đợt bùng phát dịch bệnh liên quan đến NTHMV:

• Tình hình nhiễm vi rút: Thống kê 359 vụ ngộ độc do NTHMV từ năm 1980 đến 2012 ghi nhận NoV chiếm 83,7% và HAV chiếm 12,8% (Scallan và cs.). Nghiên cứu của Cơ quan An toàn Sản phẩm Tiêu dùng và Thực phẩm Hà Lan (NVWA, 2013–2017) trên 756 mẫu phát hiện 45,5% dương tính với NoV. Tại Trung Quốc, vụ dịch tiêu thụ ngao ô nhiễm năm 1988 tại Thượng Hải gây nhiễm HAV cho gần 300.000 người; tại Bột Hải ghi nhận 17,5% mẫu NTHMV nhiễm HEV. Tây Ban Nha ghi nhận các đợt dịch HAV từ ngao Peru (1999, 2008), HEV trong 24,4% mẫu NTHMV (Rivadulla và cs., 2019) và HAstV trong 12,2% mẫu (Vilarino và cs.). Đáng chú ý, David Polo và cộng sự (2010) khảo sát 50 mẫu NTHMV nhập khẩu từ Ma rốc, Peru, Hàn Quốc và Việt Nam đã phát hiện 50% mẫu NTHMV từ Việt Nam nhiễm HAV và có hiện tượng đồng nhiễm HAstV + HAV + NoV GI.
• Đặc điểm cấu trúc hệ gen vi rút:
  • Norovirus (NoV): Thuộc họ Caliciviridae, virion 27–35 nm, capsid 20 mặt đối xứng cấu tạo từ 90 dimer (58 kDa), hệ gen (+)ssRNA dài ~7,6 kb với 3 khung đọc mở (ORF1 mã hóa polyprotein 194 kDa phân cắt thành N-Term, NTPase, p22, VPg, 3C-like protease, RdRp; ORF2 mã hóa capsid VP1; ORF3 mã hóa VP2). NoV được chia thành 10 nhóm gen (GI–GX) gồm 49 kiểu gen.
  • Hepatitis A virus (HAV): Thuộc họ Picornaviridae, virion 27–32 nm, hệ gen (+)ssRNA dài ~7,5 kb gồm vùng 5'UTR bảo thủ (>89% tương đồng giữa các kiểu gen I, II, III), một ORF lớn (P1 mã hóa VP1–VP4; P2 và P3 mã hóa protein phi cấu trúc 2A–2C, 3A–3D) và vùng 3'UTR chứa đuôi poly(A).
  • Hepatitis E virus (HEV): Thuộc họ Hepeviridae, virion 20 mặt đối xứng, hệ gen (+)ssRNA dài ~7,2 kb (ở người/động vật có vú) gồm 5'NTR, 3'NTR, ORF1 (MeT, Hel, RdRp), ORF2 (capsid protein 660 aa), ORF3 (protein 113 aa), vùng tiếp giáp (JR), và hai yếu tố điều hòa cis (CRE1, CRE2). HEV gồm 7 kiểu gen (HEV-1 đến HEV-7).
  • Astrovirus (HAstV): Thuộc họ Astroviridae, virion hình sao/lục giác 28–35 nm, hệ gen (+)ssRNA dài ~6,8 kb gồm ORF1a, ORF1b (mã hóa serine protease và RdRp), ORF2 (capsid protein) và vùng ORF-X tại điểm giao ORF1b–ORF2. Gồm 8 kiểu gen (HAstV-1 đến HAstV-8).

Tác nhân vi rút	Họ vi rút	Kích thước hạt virion	Kích thước hệ gen	Vùng gen bảo thủ / Gen mục tiêu Real-time PCR	Vùng gen định kiểu gen (Genotyping)
Norovirus (NoV)	Caliciviridae	27–35 nm	~7,6 kb	Điểm giao ORF1–ORF2	Vùng C / VP1, RdRp
Hepatitis A (HAV)	Picornaviridae	27–32 nm	~7,5 kb	Vùng 5'UTR (5'NCR)	Vùng nối VP1–2A (168 bp)
Hepatitis E (HEV)	Hepeviridae	27–34 nm	~7,2 kb	Vùng giao ORF2–ORF3	Vùng 5' MeT, vùng ORF2
Astrovirus (HAstV)	Astroviridae	28–35 nm	~6,8 kb	Vùng 3'UTR	Giao ORF1b–ORF2, ORF2

• Phát triển kỹ thuật phân tích:
  • Tách chiết RNA: Phương pháp xử lý mô tiêu hóa bằng Proteinase K kết hợp muối phân rã cấu trúc GuSCN và hạt từ silica (theo nguyên lý ISO 15216-1:2013) cho hiệu suất cao hơn so với tách chiết trực tiếp bằng Trizol (dễ bị tồn dư phenol gây ức chế enzyme) hay rửa giải bằng đệm kiềm/PEG.
  • Mồi và mẫu dò Real-time RT-PCR: Nghiên cứu của Jothikumar (2006, 69 bp vùng ORF3) và Schlosser (2014, 81 bp vùng ORF3) cho HEV; nghiên cứu của Le Cann (2004, 90 bp vùng 3'UTR) cho HAstV.
  • Công nghệ cải tiến mẫu dò: Ứng dụng Minor Groove Binders (MGB - Afonina và cs., 1997, 2000; Garson và cs., 2017) gắn ở đầu 3' và Locked Nucleic Acids (LNA - Braasch và cs., 2000; Wang và cs., 2018) với cầu nối 2'-O, 4'-C methylene giúp tăng nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) từ 1–8°C, cho phép rút ngắn chiều dài mồi/mẫu dò mà vẫn bảo đảm độ đặc hiệu cao.
  • Xác định kiểu gen: Phương pháp Nested RT-PCR kết hợp giải trình tự Sanger tự động (Kojima và cs., 2002 cho NoV; Taffon và cs., 2011 cho HAV; Fogeda, 2009 và Okamoto, 2001 cho HEV; Hata, 2014 cho HAstV).

2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và vị trí của luận án

Tại Việt Nam, các công bố trước đây chủ yếu tập trung khảo sát NoV hoặc HAV trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng người bị tiêu chảy cấp. Việc nghiên cứu toàn diện sự lưu hành, mức độ nhiễm tạp và kiểu gen của cả 4 nhóm vi rút (NoV, HAV, HEV, HAstV) trên đối tượng thực phẩm NTHMV còn khoảng trống lớn. Luận án định vị trọng tâm vào việc thiết kế, hiệu chỉnh mồi/mẫu dò ứng dụng MGB/LNA nhằm chuẩn hóa quy trình Real-time RT-PCR cho HEV và HAstV đồng bộ với chu trình nhiệt ISO 15216-1:2013, phục vụ kiểm nghiệm an toàn thực phẩm thực tế.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Cơ sở lý thuyết và nguyên lý kỹ thuật

• Tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013: Khung quy chuẩn quốc tế về định lượng NoV và HAV trong thực phẩm bằng Real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò thủy phân mang chất phát huỳnh quang và chất dập huỳnh quang (TaqMan probe). Chu trình nhiệt chuẩn gồm: phiên mã ngược ở 55°C trong 60 phút; hoạt hóa enzyme ở 95°C trong 5 phút; 45 chu kỳ khuếch đại (biến tính 95°C trong 15 giây, bắt cặp 60°C trong 60 giây, kéo dài 65°C trong 60 giây).
• Nguyên lý tăng nhiệt độ nóng chảy bằng MGB và LNA:
  • MGB: Phân tử gắn vào đầu 3' của mẫu dò, liên kết với rãnh nhỏ của chuỗi xoắn kép DNA, tăng tính ổn định của phức hợp lai.
  • LNA: Cấu trúc tương tự ribonucleotide bị "khóa" bởi cầu nối giữa 2'-O và 4'-C, làm giảm tính linh động của vòng furanose, giúp tăng ái lực liên kết và độ bền nhiệt.
• Kỹ thuật Nested RT-PCR: Sử dụng hai cặp mồi liên tiếp (mồi ngoài - outer primer và mồi trong - inner primer) để khuếch đại vùng gen đích, triệt tiêu sản phẩm phụ không đặc hiệu.
• Giải trình tự chuỗi Sanger tự động: Khuếch đại kết thúc chuỗi sử dụng 4 loại dideoxynucleotide (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) gắn 4 chất huỳnh quang khác nhau, phân tách bằng điện di mao quản và ghi nhận tín hiệu huỳnh quang qua đầu đọc detector laser.

2. Vật liệu và phương pháp thực nghiệm

• Vật liệu kiểm soát và chuẩn:
  • Tách dòng vùng gen đích của HEV và HAstV vào vector dòng hóa pJET1.2/blunt, biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5α.
  • Sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR, giải trình tự kiểm tra plasmid tái tổ hợp.
  • Phiên mã in vitro (In vitro transcription) để tổng hợp các đoạn chứng dương RNA chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn định lượng.
• Xử lý mẫu NTHMV và tách chiết RNA:
  • Thu nhận tuyến tiêu hóa từ mẫu NTHMV (khối lượng 1,5–2,0 g), cắt nhỏ đồng nhất.
  • Xử lý phân giải bằng enzyme Proteinase K (ủ ở 37°C và 60°C), ly tâm thu dịch nổi.
  • Tách chiết và tinh sạch RNA vi rút bằng hệ hóa chất muối chaotropic GuSCN và hạt từ silica.
• Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR:
  • Hóa chất: Bộ sinh phẩm SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit.
  • Khảo sát nồng độ ion $\text{Mg}^{2+}$, nồng độ mồi xuôi/ngược, nồng độ mẫu dò.
  • Thiết lập hai chế độ chu trình nhiệt: (1) Chu trình nhiệt tương thích tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013; (2) Chu trình nhiệt rút gọn (kết hợp bước bắt cặp và kéo dài mạch) phục vụ xét nghiệm nhanh.
  • Xác định các thông số kỹ thuật: Giới hạn phát hiện ở xác suất 95% ($\text{LOD}_{95%}$), khoảng tuyến tính định lượng, hệ số tương quan ($R^2$), hiệu suất phản ứng ($E$) và phản ứng chéo với các vi rút đường ruột khác.
• Phương pháp xác định kiểu gen:
  • Khuếch đại cDNA qua phản ứng Nested RT-PCR với các bộ mồi chuyên biệt.
  • Điện di kiểm tra kích thước đoạn khuếch đại trên gel agarose 1,5%.
  • Giải trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger.
  • Xây dựng cây phát sinh loài (Phylogenetic tree) dựa trên khoảng cách di truyền (Branch length) đối chiếu với các trình tự chuẩn quốc tế từ ngân hàng dữ liệu GenBank.
• Phương pháp xử lý thống kê: Phân tích dữ liệu bằng phần mềm SPSS để đánh giá mối tương quan giữa các biến số (loại mẫu, địa điểm thu mẫu tại chợ/siêu thị, thời điểm thu mẫu, tác động của dịch COVID-19, năm lấy mẫu) tới tỷ lệ và mức độ nhiễm vi rút trong NTHMV.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh kinh tế của ngành xuất khẩu NTHMV Việt Nam, phân tích nguy cơ an toàn thực phẩm do vi rút đường ruột, khẳng định tính cấp thiết, 3 mục tiêu nghiên cứu, 4 nội dung chính, ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn và 4 điểm mới của luận án.

Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học về:

• Tình hình khai thác, nuôi trồng và xuất khẩu NTHMV tại Việt Nam (diện tích nuôi trồng >35.000 ha, sản lượng 471.000 tấn năm 2021).
• Đặc điểm hình thái học, cấu trúc hệ gen, cơ chế phiên mã - dịch mã của NoV, HAV, HEV và HAstV.
• So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp xét nghiệm vi rút: RT-LAMP, RT-PCR truyền thống và Real-time RT-PCR.

Phương pháp	Bản chất đích	Ưu điểm	Nhược điểm
RT-LAMP	Axit nucleic (RNA)	Không yêu cầu thiết bị luân nhiệt phức tạp, có thể triển khai tại hiện trường.	Thiết kế 4–6 mồi phức tạp, không có khả năng định lượng chính xác nồng độ bản sao.
RT-PCR	Axit nucleic (RNA)	Giới hạn phát hiện thấp, chi phí thiết bị cơ bản.	Phải điện di kiểm tra, dễ ngoại nhiễm, không định lượng được.
Real-time RT-PCR	Axit nucleic (RNA)	Độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kết quả hiển thị trực tiếp, định lượng được nồng độ bản sao hệ gen.	Yêu cầu máy luân nhiệt huỳnh quang, chi phí hóa chất cao, phụ thuộc hiệu quả mồi/mẫu dò.

• Đánh giá các bộ mồi quốc tế kinh điển và công nghệ tổng hợp mồi/mẫu dò cải tiến (MGB, LNA).
• Báo cáo dữ liệu dịch tễ học và phân bố kiểu gen của NoV (chiếm ưu thế GII.4, GII.3, GII.17), HAV (kiểu gen IA, IB, IIIA), HEV (kiểu gen HEV-1 đến HEV-4) và HAstV (HAstV-1 đến HAstV-8) trên thế giới và tại Việt Nam.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Quy định chi tiết quy trình thu thập mẫu NTHMV ngoài thị trường; các bước chế tạo plasmid chuẩn pJET1.2 mang đoạn chèn gen đích HEV và HAstV; quy trình phiên mã in vitro; thiết lập các thông số luân nhiệt cho phản ứng Real-time RT-PCR và Nested RT-PCR; danh mục các cặp mồi giải trình tự.

Kết quả và bàn luận

1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ

• Phân tích độ bao phủ in silico trên GenBank đối với bộ mồi của Schlosser (2014) và Jothikumar (2006) trên hệ gen chuẩn HEV của WHO (mã số AB630970).
• Thiết kế, hiệu chỉnh hai tổ hợp mồi/mẫu dò HEV-A và HEV-B tích hợp công nghệ MGB/LNA.
• Khuếch đại đoạn gen đích HEV-A và HEV-B, tách dòng thành công vào vector pJET1.2 trong E. coli DH5α, khẳng định bằng giải trình tự Sanger.
• Tối ưu hóa thành phần phản ứng: Nồng độ $\text{Mg}^{2+}$, nồng độ mồi xuôi/ngược và nồng độ mẫu dò huỳnh quang.
• Tối ưu hóa chu trình nhiệt ISO 15216-1:2013 và xây dựng thành công chu trình nhiệt rút gọn (khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi, thời gian gắn mồi và kéo dài mạch).
• Xác định các thông số giá trị sử dụng của phương pháp: Giới hạn phát hiện xác suất 95% ($\text{LOD}_{95%}$), khoảng tuyến tính định lượng, đường chuẩn định lượng và kiểm tra không xảy ra phản ứng chéo với các vi rút đường ruột khác.

2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ

• Hiệu chỉnh bộ mồi gốc của Le Cann (2004) nhắm vào vùng 3'UTR (mã số tham chiếu NC_001943.1) kết hợp gắn các đơn phân LNA nhằm nâng nhiệt độ nóng chảy $T_m$.
• Dòng hóa đoạn gen mục tiêu vào plasmid pJET1.2, biến nạp vào E. coli DH5α và tổng hợp RNA chuẩn bằng phiên mã in vitro.
• Tối ưu hóa nồng độ $\text{Mg}^{2+}$, mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR.
• Thiết lập chu trình nhiệt chuẩn theo ISO 15216-1:2013 và chu trình nhiệt rút gọn.
• Xác định $\text{LOD}_{95%}$, khoảng định lượng tuyến tính, lập đường chuẩn định lượng và kiểm tra độ đặc hiệu (không có phản ứng chéo).

3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ

• Đánh giá tỷ lệ nhiễm và mức nồng độ bản sao của 4 loại vi rút (NoV GI, NoV GII, HAV, HEV, HAstV) trong các mẫu NTHMV thu thập tại chợ và siêu thị trong năm 2016.
• Đánh giá tỷ lệ nhiễm và mức nồng độ bản sao vi rút trong các mẫu NTHMV thu thập năm 2022.
• Phân tích tình trạng mẫu đồng nhiễm nhiều loại vi rút đồng thời.
• So sánh biến động dịch tễ giữa hai thời điểm năm 2016 và 2022.
• Sử dụng phần mềm thống kê SPSS phân tích mối tương quan giữa các yếu tố nền: loại mẫu NTHMV, địa điểm lấy mẫu (chợ truyền thống so với siêu thị), thời điểm lấy mẫu trong năm, giai đoạn dịch COVID-19 và năm lấy mẫu đối với mức độ nhiễm NoV GI và NoV GII.

4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ

• Khuếch đại thành công vùng gen ORF1–ORF2 của các mẫu dương tính NoV GI và NoV GII bằng kỹ thuật Nested RT-PCR (kiểm tra kích thước vạch sản phẩm trên gel agarose 1,5%).
• Giải trình tự Sanger, dựng cây phát sinh loài (Phylogenetic tree) và xác định phân bố các kiểu gen NoV GI và NoV GII lưu hành trong NTHMV tại Việt Nam.
• Khuếch đại và phân tích kiểu gen của các chủng HEV phát hiện được trong NTHMV thông qua cây phát sinh loài.
• Khuếch đại và phân tích kiểu gen của các chủng HAstV phát hiện được trong NTHMV thông qua cây phát sinh loài.

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp mới về mặt khoa học

• Thiết kế và hiệu chỉnh thành công các tổ hợp mồi và mẫu dò đặc hiệu phát hiện RNA của HEV (vùng ORF3) và HAstV (vùng 3'UTR) có độ bao phủ cao với các trình tự biến chủng công bố trên GenBank nhờ ứng dụng công nghệ hóa học MGB và LNA.
• Đồng bộ hóa thành công điều kiện phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV và HAstV với chu trình luân nhiệt của tiêu chuẩn quốc tế ISO 15216-1:2013. Kết quả này cho phép các phòng kiểm nghiệm có thể vận hành đồng thời 4 phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện 4 tác nhân (NoV, HAV, HEV, HAstV) trong cùng một mẻ chạy máy.
• Thiết lập chu trình nhiệt rút gọn (2 bước nhiệt) cho HEV và HAstV, rút ngắn thời gian phân tích, phục vụ xét nghiệm nhanh.
• Cung cấp dữ liệu sinh học phân tử và phân bố kiểu gen đầu tiên của NoV GI, NoV GII, HEV và HAstV trên đối tượng NTHMV tại Việt Nam.

2. Ý nghĩa thực tiễn và đề xuất giải pháp

• Quy trình phân tích có độ tin cậy và tính đặc hiệu cao, áp dụng được cho việc kiểm soát chất lượng an toàn thực phẩm đối với NTHMV thương phẩm cũng như mở rộng cho các nền mẫu thực phẩm, mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu nước môi trường.
• Hỗ trợ các cơ quan quản lý nhà nước và doanh nghiệp chế biến thủy sản nâng cao năng lực kiểm soát chuỗi cung ứng, đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn sinh học khắt khe của thị trường nhập khẩu (đặc biệt là EU và Mỹ).
• Phục vụ công tác giám sát dịch tễ học, cảnh báo sớm nguy cơ bùng phát ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền nhiễm đường ruột trong cộng đồng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

1. Hạn chế

• Nghiên cứu tập trung vào 4 nhóm tác nhân vi rút đường ruột chính (NoV, HAV, HEV, HAstV), chưa mở rộng sang toàn bộ các vi rút đường ruột khác.
• Dữ liệu giám sát thực tế được thu thập qua 2 đợt cắt ngang trong năm 2016 và năm 2022 tại một số kênh phân phối (chợ, siêu thị), chưa bao phủ toàn bộ các vùng nuôi trồng thủy sản trọng điểm trên cả nước.
• Kỹ thuật xác định kiểu gen phụ thuộc vào các đoạn mồi Nested RT-PCR giải trình tự Sanger cục bộ từng phân đoạn gen, chưa giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing).

2. Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiếp tục mở rộng phạm vi giám sát định kỳ sự lưu hành vi rút tại các vùng nuôi trồng NTHMV tập trung nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu quốc gia về dịch tễ vi rút thực phẩm.
• Nghiên cứu tích hợp các phản ứng đơn lẻ thành phản ứng Real-time RT-PCR đa mồi (Multiplex Real-time RT-PCR) phát hiện đồng thời nhiều vi rút trong cùng một giếng phản ứng.
• Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) để phân tích biến động di truyền và các biến thể tái tổ hợp của vi rút đường ruột lưu hành trong thủy hải sản.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn cao cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành: Tham khảo phương pháp luận khoa học về thiết kế mồi/mẫu dò cải tiến bằng công nghệ MGB/LNA, kỹ thuật dòng hóa tạo RNA chuẩn phiên mã in vitro, và quy trình tối ưu hóa các thông số thẩm định phương pháp Real-time RT-PCR định lượng.
• Cán bộ kiểm nghiệm tại các phòng thử nghiệm (VFA, NAFIQAD, các trung tâm kiểm nghiệm chất lượng): Áp dụng trực tiếp quy trình kỹ thuật để mở rộng chỉ tiêu kiểm nghiệm vi rút đường ruột tương thích với tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và dịch tễ học: Sử dụng các số liệu thực chứng về tỷ lệ nhiễm, mức độ nhiễm tạp và phân bố kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV để xây dựng chính sách giám sát và kiểm soát rủi ro an toàn thực phẩm trong chuỗi cung ứng nhuyễn thể.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần đồng bộ chu trình nhiệt phát hiện HEV và HAstV theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013?

Tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 vốn chỉ quy định chu trình nhiệt Real-time RT-PCR cho NoV và HAV. Việc hiệu chỉnh mồi/mẫu dò của HEV và HAstV để hoạt động chính xác ở cùng chu trình nhiệt này cho phép kỹ thuật viên chạy đồng thời 4 phản ứng phát hiện 4 loại vi rút trong cùng một lần vận hành máy luân nhiệt, giúp tiết kiệm thời gian phân tích, giảm chi phí vận hành và phát hiện kịp thời các ca mẫu đồng nhiễm.

2. Vai trò của công nghệ MGB và LNA trong việc thiết kế mồi và mẫu dò của luận án là gì?

Các vùng gen mục tiêu bảo thủ của HEV (ORF3) và HAstV (3'UTR) có chiều dài ngắn hoặc hàm lượng GC không đồng đều. Việc gắn MGB ở đầu 3' hoặc kết hợp nucleotide biến đổi LNA giúp tăng độ bền liên kết và nâng nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) của mồi/mẫu dò lên từ 1–8°C mà không cần kéo dài đoạn oligonucleotide, đảm bảo mẫu dò bắt cặp đặc hiệu ở nhiệt độ 60°C theo chuẩn ISO.

3. Phương pháp nào được sử dụng để tạo mẫu chuẩn định lượng nồng độ vi rút trong luận án?

Luận án sử dụng kỹ thuật dòng hóa các đoạn gen đích của HEV và HAstV vào vector pJET1.2, biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α, sau đó tiến hành phiên mã in vitro (In vitro transcription) để tạo các phân tử chứng dương RNA tinh khiết với nồng độ bản sao biết trước để xây dựng đường chuẩn định lượng.

4. Quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA vi rút từ NTHMV trong luận án dựa trên nguyên lý nào?

Mẫu tuyến tiêu hóa của NTHMV (1,5–2,0 g) được đồng nhất và xử lý bằng enzyme Proteinase K nhằm phân giải protein mô và làm biến tính các enzyme RNase bảo vệ RNA vi rút. Sau đó, RNA vi rút được giải phóng bằng dung dịch muối chaotropic GuSCN và tinh sạch qua hệ hạt từ silica trước khi đưa vào phản ứng khuếch đại.

5. Việc phân tích kiểu gen của các vi rút trong luận án được thực hiện bằng kỹ thuật gì?

Các mẫu dương tính được khuếch đại phân đoạn gen đa hình (vùng ORF1–ORF2 của NoV; vùng VP1/2A của HAV; vùng MeT/ORF2 của HEV; vùng giao ORF1b–ORF2 của HAstV) bằng kỹ thuật Nested RT-PCR 2 bước, sau đó giải trình tự nucleotide bằng phương pháp Sanger tự động và xây dựng cây phát sinh loài đối chiếu với dữ liệu GenBank.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phan Thị Thanh Hà đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu chuẩn hóa quy trình phân tích Real-time RT-PCR định lượng hai tác nhân HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ tương thích với tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 và chu trình nhiệt rút gọn. Bằng việc kết hợp công nghệ MGB/LNA, phiên mã in vitro tạo chuẩn và kỹ thuật phân tích kiểu gen qua Nested RT-PCR/Sanger, công trình đã cung cấp giải pháp kỹ thuật có độ chính xác cao để phát hiện đồng thời 4 loại vi rút đường ruột nguy cơ cao (NoV, HAV, HEV, HAstV). Đồng thời, các kết quả khảo sát thực tế trên thị trường giai đoạn 2016 và 2022 đã đóng góp nguồn dữ liệu dịch tễ sinh học phân tử quan trọng, phục vụ công tác kiểm soát an toàn thực phẩm thủy hải sản và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 [1]. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, xuất khẩu NTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020; trong đó, ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minh châu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3].

Tuy nhiên, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu, gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam. Tháng 4 năm 2022, trong “Diễn đàn phát triển thủy sản bền vững”, lãnh đạo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã khẳng định việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trò quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra, trong đó việc bảo đảm kiểm soát chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuất ban đầu đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4]. Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụ NTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xác định được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ô nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV [5].

Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm [6-8]. Trước tình hình ô nhiễm thực phẩm do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao, cùng với những kết quả về tình trạng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển quy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết [7]. Hiện nay, trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và HAV trong thực phẩm [9-12] thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và HEV còn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong công tác kiểm nghiệm. Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm bảo độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản ứng Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc cả bốn tác nhân NoV, HAV, 1 HEV và HAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 sẽ góp phần rút ngắn thời gian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho công tác điều trị.

Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, việc xác định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) là công đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởi các tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV, hướng tới đề xuất biện pháp ứng phó kịp thời, ngăn chặn sự lây lan vi rút trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về sức khỏe, kinh tế và xã hội.