ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic được biết đến là các lợi khuẩn có nhiều giá trị thiết thực đối với sức khỏe con người như: chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol…. Trong vài thập kỷ trở lại đây, số lượng nghiên cứu về probiotic cũng như số chế phẩm probiotic có mặt trên thị trường xuất hiện ngày càng nhiều. Lactobacillus sporogenes là một chủng vi khuẩn có nhiều đặc tính nổi trội để có thể sử dụng làm nguyên liệu cho các chế phẩm probiotic: có khả năng sinh bào tử giúp chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường và dạ dày, do đó làm tăng tỉ lệ sống sót và tăng hiệu quả điều trị; ngoài ra chúng còn có khả năng lên men đồng hình tạo acid L (+) lactic mà cơ thể có thể chuyển hóa hoàn toàn được…. Tại Việt Nam, vi khuẩn Lactobacillus sporogenes đã bắt đầu được nghiên cứu trong những năm gần đây.
Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu chưa nhiều và tập trung chủ yếu vào nhóm ngành thực phẩm và thú y. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài ―Nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để tạo nguyên liệu probiotic‖ được thực hiện với các mục tiêu: 1. Nhận dạng một số đặc tính sinh học của Lactobacillus sporogenes. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu được Lactobacillus sporogenes thu sinh khối.
Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành. 1 Luan van thac si Chƣơng 1. Đại cƣơng về probiotic Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, ―biotic‖ hay ―biosis‖ từ chữ ―life‖ là đời sống, và ―pro‖ là thân thiện, nên probiotics có thể hiểu theo nghĩa là cái gì đó thân thiện với đời sống con người.
Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn có ích [41], [58]. Khái niệm probiotics đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, trong cuốn sách ―Kéo dài sự sống‖ của ông đưa ra năm 1908. Ông cho rằng những người nông dân Bulgary sống lâu là vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi khuẩn sinh acid lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột [50]. Theo Parker (1974), Probiotics là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ.
Van De Kerkove (1979), Barrows và Deam (1985), Lestradet (1995) cùng cho rằng probiotics được sử dụng như một liệu pháp trong việc chữa trị bệnh tiêu chảy hay như là cách phòng bệnh ở người và động vật để giảm đến mức tổi thiểu sự phát tán của vi sinh vật đường ruột, sự kháng lại liệu pháp sinh học và sự di căn của chứng viêm dạ dày ruột. Đến năm 1989, theo Fuller thì probiotics cũng được nhận thấy là có những ảnh hưởng có lợi trên sức khỏe của sinh vật chủ. Năm 1992, Havenaar đã mở rộng định nghĩa về probiotics: probiotics được định nghĩa như là các vi sinh vật sống riêng lẻ hay hỗn hợp mà có ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh vật chủ [46]. Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về Probiotics ở thời điểm hiện tại như sau: ―Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ‖ [46], [58].
Tuy nhiên, không phải 2 Luan van thac si tất cả những vi sinh vật sống có lợi nào cũng là probiotics. Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn chủng VSV probiotics sử dụng dưới dạng thực phẩm và dược phẩm là chủng khuẩn đó phải có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và phải có khả năng phát triển trong ruột. Do trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotics phải đối mặt với nhiều điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng bất cứ sản phẩm chứa probiotics nào cũng phải chứa ít nhất 106 cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng vì liều điều trị tối thiểu mỗi ngày được đề xuất là từ 108 ÷ 109 tế bào [26], [55]. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam Việc sử dụng thực phẩm có chứa các vi sinh vật có lợi cho cơ thể đã được biết đến từ lâu, tuy nhiên việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỉ 20.
Năm 1998, Apajalahti và cộng sự đã thực hiện những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật [15]. Netherwood và cộng sự (1999) [48]; Gong và cộng sự (2002) [31]; Yoon và cộng sự (2002) [61] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotics. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ. Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế.
Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm 3 Luan van thac si trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh…), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột [40], [52]. Trong thời gian gần đây đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotics. Probiotics ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang… hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như viên đặt, kem bôi da.
Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn. Để cải thiện số lượng vi khuẩn sống sót trong suốt quá trình bảo quản và trong môi trường có độ pH thấp trong cơ thể, trên thị trường đã có các sản phẩm probiotics được bao tới thế hệ 2,3… [5]. Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, chúng phải chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất nhiều và không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây tác dụng. Việc đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lưu hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản; do vậy đã có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông khô tạo bột, áp dụng phương pháp lên men 2 bước, phương pháp vi nang hóa, phương pháp sử dụng kết hợp với tá dược bảo vệ [28].
Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nước ta như công ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên Pasteur Đà Lạt, công ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang đã lưu hành với một số chế phẩm hay gặp trên thị trường như Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver với chủng vi sinh vật Bacillus subtilis. Mới đây, đã xuất hiện thêm công ty cổ phần ANABIO Research & Development, có nhà máy sản xuất nguyên liệu probiotics hiện đại không kém so với các nước trên thế giới. Ngoài chủng vi sinh vật Bacillus subtilis, ANABIO còn có thêm nguyên liệu chứa các chủng vi sinh vật lactic. Do vậy, thị 4 Luan van thac si trường chế phẩm probiotics không chỉ lớn về số lượng mà còn đa dạng về chủng loại vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm probiotics đã được hạ nhiều.
Tuy nhiên, sản phẩm ở đây vẫn chủ yếu thuộc thế hệ 1 nên khả năng bảo vệ vi sinh vật vẫn còn rất thấp. Lactobacillus sporogenes Năm 1915, vi khuẩn này được phân lập bởi B. Hammer tại Phòng thí nghiệm nông nghiệp Iowa (Mỹ) và được biết đến lần đầu tiên dưới tên gọi Bacillus coagulans do một đợt bùng phát của việc một sản phẩm đặc biệt của sữa bị đông vón hàng loạt [33]. Năm 1932, vi khuẩn này lại được Horowitz và Wlasowa phân lập và đặt tên là Lactobacillus sporogenes [42].
Đến năm 1957, vi sinh vật này được phân loại lại trong Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology dựa trên các đặc tính sinh hóa và danh pháp chính xác hiện tại là Bacillus coagulans [20]. Do vi khuẩn này có các đặc điểm của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, nên vị trí phân loại của nó giữa hai họ Lactobacillaceae và Bacillaceae vẫn còn gây nhiều tranh cãi [36]. Ngày nay, vi khuẩn này được biết đến với cả hai tên gọi trên, nhưng tên gọi Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều hơn trong các chế phẩm thương mại xuất hiện trên thị trường. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes tồn tại trong tự nhiên ở hai dạng: dạng tế bào sinh dưỡng và dạng bào tử.
Tế bào sinh dƣỡng Đặc điểm hình thái: Lactobacillus sporogenes được mô tả là trực khuẩn Gram dương, hình que, kích thước 0,5 – 0,7µm × 1,6 – 7,1 µm, có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử [33], [37]. 5 Luan van thac si Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở dạng chuỗi ngắn [33],[37]. Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes Điều kiện nuôi cấy: L. sporogenes là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ từ 35- 50oC, pH khoảng 5,5 – 6,5 [33], [37].
Về dinh dưỡng, vi khuẩn này có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau: glucose, lactose, maltose, dextrose, fructose, galactose… [11], [33]. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: L. sporogenes cho phản ứng catalase dương tính [33], [37]. sporogenes có khả năng tổng hợp acid L (+) lactic, không tổng hợp đồng phân D(-).