Luận văn thạc sĩ hay nhân giống bạch đàn urô eucalyptus urophylla bleck pn46 pn và pn47 bằng phương pháp nuôi cấy vintro

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nhân giống bạch đàn urô eucalyptus urophylla bleck pn46 pn và pn47 bằng phương pháp nuôi cấy, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Người hướng dẫn: PGS-TS. Dương Mến Hùng
• Trường học: Trường Đại học Lâm nghiệp
• Chuyên ngành: Lâm học
• Đề tài: Nghiên cứu nhân giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla PN46 và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2006
• Địa điểm: Hà Tây

Mục lục chi tiết

• 1. Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Khái niệm về nhân giống in vitro
• 1.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro
• 1.3. Tính toán năng của tế bào thực vật

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu nhân giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla

Nghiên cứu nhân giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla PN46 và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro đã trở thành một chủ đề quan trọng trong lĩnh vực lâm nghiệp. Bạch đàn urô là một trong những loài cây có giá trị kinh tế cao, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất giấy và gỗ. Việc áp dụng công nghệ nuôi cấy in vitro giúp tăng cường khả năng nhân giống và cải thiện chất lượng giống cây trồng.

1.1. Đặc điểm sinh học của bạch đàn urô Eucalyptus urophylla

Bạch đàn urô Eucalyptus urophylla có khả năng sinh trưởng nhanh và thích nghi tốt với nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Loài cây này có thể phát triển trên đất nghèo dinh dưỡng và chịu hạn tốt, điều này làm cho nó trở thành lựa chọn lý tưởng cho các vùng đất khó khăn.

1.2. Tầm quan trọng của bạch đàn urô trong lâm nghiệp

Bạch đàn urô không chỉ cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp giấy mà còn góp phần cải thiện môi trường sinh thái. Việc trồng bạch đàn urô giúp tăng cường độ che phủ rừng và bảo vệ đất khỏi xói mòn.

II. Thách thức trong nghiên cứu nhân giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla

Mặc dù bạch đàn urô có nhiều ưu điểm, nhưng việc nhân giống cây trồng này vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như sự biến đổi gen, khả năng kháng bệnh và điều kiện môi trường không ổn định có thể ảnh hưởng đến quá trình nhân giống.

2.1. Biến đổi gen và ảnh hưởng đến chất lượng giống

Sự biến đổi gen có thể dẫn đến những thay đổi không mong muốn trong đặc tính sinh học của cây. Điều này có thể làm giảm năng suất và chất lượng gỗ, ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của việc trồng bạch đàn.

2.2. Khó khăn trong việc duy trì điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy in vitro cần phải được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sự phát triển của cây giống. Sự thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây.

III. Phương pháp nuôi cấy in vitro cho bạch đàn urô Eucalyptus urophylla

Phương pháp nuôi cấy in vitro đã được áp dụng để nhân giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla PN46 và PN47. Quy trình này bao gồm nhiều bước từ chuẩn bị mẫu, nuôi cấy đến tạo cây con.

3.1. Chuẩn bị mẫu và môi trường nuôi cấy

Mẫu cây được chọn phải đảm bảo chất lượng và không bị nhiễm bệnh. Môi trường nuôi cấy cần được bổ sung đầy đủ dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng để kích thích sự phát triển của cây.

3.2. Quy trình nuôi cấy và tạo cây con

Quy trình nuôi cấy bao gồm các giai đoạn như nhân giống, tạo rễ và chuyển cây con ra môi trường ngoài. Mỗi giai đoạn cần được theo dõi và điều chỉnh để đảm bảo cây phát triển khỏe mạnh.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp nuôi cấy in vitro đã thành công trong việc nhân giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla PN46 và PN47. Số lượng cây giống đạt tiêu chuẩn đã được sản xuất và ứng dụng trong thực tiễn.

4.1. Đánh giá chất lượng cây giống

Cây giống được sản xuất từ phương pháp nuôi cấy in vitro có chất lượng tốt, khả năng sinh trưởng mạnh mẽ và kháng bệnh tốt hơn so với cây giống truyền thống.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất lâm nghiệp

Việc áp dụng cây giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla trong sản xuất lâm nghiệp đã giúp tăng năng suất và chất lượng gỗ, đồng thời cải thiện hiệu quả kinh tế cho người trồng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu nhân giống bạch đàn urô Eucalyptus urophylla PN46 và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro đã mở ra nhiều triển vọng cho ngành lâm nghiệp. Việc tiếp tục nghiên cứu và cải tiến quy trình sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất giống cây trồng.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện quy trình nuôi cấy in vitro, nhằm tăng cường khả năng kháng bệnh và năng suất của cây giống.

5.2. Tích hợp công nghệ mới vào sản xuất

Việc áp dụng công nghệ sinh học và công nghệ thông tin vào quy trình sản xuất giống sẽ giúp nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhu cầu nguyên liệu gỗ phục vụ công nghiệp chế biến giấy, ván nhân tạo và xây dựng tại Việt Nam đang gia tăng nhanh chóng, đòi hỏi nguồn cung giống cây lâm nghiệp có năng suất và chất lượng vượt trội. Theo định hướng phát triển lâm nghiệp quốc gia, các loài thuộc chi Bạch đàn (Eucalyptus) được xếp vào vị trí ưu tiên số một trong danh mục cây trồng rừng thương mại từ năm 2001, với sản lượng cung ứng hàng năm đạt khoảng 10 triệu cây giống vô tính trên cả nước. Mặc dù Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã công nhận khoảng 12 dòng bạch đàn phục vụ trồng rừng sản xuất, nhưng tính đến thời điểm nghiên cứu mới chỉ có 3 đến 4 dòng được nhân giống thành công bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro.

Việc trồng rừng thuần dòng trên quy mô lớn tiềm ẩn rủi ro bùng phát dịch sâu bệnh hại do hiện tượng suy giảm đa dạng di truyền. Năm 2003, hai dòng bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S. Blake) gồm PN46 và PN47 đã được công nhận là tiến bộ kỹ thuật nhờ ưu thế sinh trưởng vượt trội tại vùng khảo nghiệm Gia Thanh (Phú Thọ). Cây mẹ dòng PN46 đạt 97 điểm tiêu chuẩn cây ưu tú với chiều cao vượt 27% (đạt 27,0 mét) và đường kính ngang ngực vượt 26% (đạt 21,0 centimet) so với trung bình quần thụ; trong khi dòng PN47 đạt 96 điểm với chiều cao vượt 63% (đạt 26,0 mét) và đường kính vượt 43% (đạt 22,5 centimet). Tuy nhiên, các quy trình nhân giống in vitro truyền thống áp dụng trên dòng PN14 và U6 đều thất bại khi thử nghiệm trên PN46 và PN47 do khác biệt lớn về đặc tính sinh lý và nhu cầu dinh dưỡng khoáng.

Luận văn thạc sĩ khoa học lâm nghiệp của tác giả Phạm Đức Huy, dưới sự hướng dẫn của Phó Giáo sư Tiến sĩ Dương Mộng Hùng tại Trường Đại học Lâm nghiệp và Viện Nghiên cứu Cây nguyên liệu giấy (Phù Ninh, Phú Thọ) giai đoạn 2003-2006, được triển khai nhằm giải quyết triệt để rào cản công nghệ này. Mục tiêu trọng tâm của đề tài là xác định tổ hợp môi trường vật lý, hóa học tối ưu qua từng giai đoạn: khử trùng mẫu, nhân nhanh chồi, kích thích tạo rễ hoàn chỉnh và huấn luyện cây con thích nghi ngoài vườn ươm. Kết quả nghiên cứu tạo nền tảng vững chắc để đạt hệ số nhân chồi trên 2,6 lần mỗi chu kỳ 30 ngày, tỷ lệ ra rễ đạt trên 88% và tỷ lệ sống vườn ươm đạt trên 90%, bảo đảm cung ứng hàng triệu cây giống chuẩn di truyền cho chiến lược phát triển rừng bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết kinh điển của công nghệ sinh học thực vật. Thứ nhất là học thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (Cell Totipotency) khởi xướng bởi Haberlandt, khẳng định mỗi tế bào thực vật riêng lẻ đều mang trọn vẹn bộ gen di truyền của cơ thể mẹ và có tiềm năng tái sinh thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện dinh dưỡng, vi khí hậu thích hợp. Thứ hai là quy luật phân hóa và phản phân hóa tế bào, trong đó các tế bào mô trưởng thành quay trở lại trạng thái phôi sinh để hình thành chồi mới dưới tác động hoạt hóa của các gen đặc hiệu. Thứ ba là học thuyết cân bằng phytohormone của Skoog và Miller (1957), giải thích cơ chế kiểm soát phát sinh hình thái thông qua tỷ lệ tương tác giữa hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng chủ đạo: Auxin (kích thích sinh trưởng kéo dài, phân chia tầng sinh mô và kích thích ra rễ) và Cytokinin (kích thích phân chia tế bào, phá vỡ ưu thế ngọn và tăng sinh chồi nách).

Mô hình nghiên cứu vi nhân giống hai dòng bạch đàn urô vận hành qua một chuỗi các khái niệm kỹ thuật cốt lõi:

• Hệ số nhân chồi (HSNC): Đại lượng đo lường tốc độ tăng sinh sinh khối, biểu thị tỷ số giữa tổng số chồi mới tạo thành sau 4 tuần nuôi cấy trên số lượng chồi cấy ban đầu.
• Chồi hữu hiệu (TLCHH): Tiêu chuẩn chồi đạt chất lượng cấy chuyển hoặc kích thích ra rễ với chiều cao tối thiểu từ 1,5 centimet trở lên, cấu trúc thân lá phát triển hoàn chỉnh mang từ 2 cặp lá thật trở lên và không bị biến dị mô sẹo hóa (callus).
• Môi trường dinh dưỡng khoáng chuyên biệt cho cây thân gỗ (WPM - Woody Plant Medium): Nền dinh dưỡng giàu vi lượng với áp suất thẩm thấu và nồng độ đạm amon phù hợp, kết hợp nguồn cacbon từ đường sucrose 30 gam/lít, agar tinh khiết 4,5 đến 5,5 gam/lít và duy trì độ pH ổn định ở mức 5,8 đến 7,0.
• Quá trình tôi luyện sinh lý (Acclimatization): Giai đoạn chuyển tiếp giúp cây con in vitro hoàn thiện tầng cutin bề mặt lá, điều hòa khí khổng và thích nghi từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn ngoài điều kiện tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu khởi đầu từ chồi nách 15 ngày tuổi, cắt từ cây cấp dòng 1 năm tuổi khỏe mạnh, không sâu bệnh trồng trong bầu đất tại vườn ươm Viện Nghiên cứu Cây nguyên liệu giấy. Mẫu cấy đạt quy chuẩn hình thái có chiều dài từ 1,0 đến 1,5 centimet, đường kính thân 2 đến 3 milimet, mang 2 đến 3 nách lá từ vị trí lá thứ 3 đến lá thứ 6. Toàn bộ thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần lặp lại nghiêm ngặt nhằm triệt tiêu tối đa các sai số ngẫu nhiên do vị trí đặt mẫu và cường độ chiếu sáng trong phòng nuôi cấy.

Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết kế đồng bộ cho từng giai đoạn thí nghiệm:

• Thí nghiệm khử trùng mẫu và tuyển chọn môi trường nền: Mỗi công thức theo dõi 60 ống nghiệm đơn lẻ (tổng số 180 mẫu cấy cho 3 lần lặp lại), đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy.
• Thí nghiệm nhân nhanh chồi và tương tác chất điều hòa sinh trưởng: Mỗi công thức bố trí 10 bình tam giác, mỗi bình chứa 6 mẫu cấy (tổng số 60 mẫu/công thức), thu thập dữ liệu định kỳ sau 4 tuần.
• Thí nghiệm kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh: Mỗi công thức theo dõi 10 bình trụ chuyên dụng (đường kính 6 centimet, chiều cao 10 centimet), mỗi bình cấy 30 chồi (tổng quy mô 300 chồi/công thức), đánh giá sau 2 tuần.
• Thí nghiệm huấn luyện thích nghi vườn ươm: Mỗi công thức theo dõi 30 bình cây và đo đếm ngẫu nhiên 30 cây con sau 4 tuần trồng vào bầu đất tầng B.

Điều kiện phòng nuôi cấy nhân tạo được kiểm soát nghiêm ngặt với nhiệt độ phòng duy trì từ 23 đến 27 độ C, độ ẩm tương đối xấp xỉ 60%, chiếu sáng bằng hệ thống đèn huỳnh quang với cường độ 1.500 đến 3.000 lux và thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. Dữ liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel và SPSS 11.0. Phương pháp phân tích phương sai một nhân tố (One-way ANOVA) được áp dụng để kiểm tra ảnh hưởng của các nghiệm thức. Khi phương sai tổng thể đồng nhất (giá trị Sig kiểm định Levene lớn hơn 0,05), tiêu chuẩn Duncan được sử dụng để phân nhóm trung bình ở mức ý nghĩa alpha = 0,05 (độ tin cậy 95%). Trong trường hợp phương sai không đồng nhất, kiểm định Tamhane's T2 được thay thế để bảo đảm tính chuẩn xác và khách quan tuyệt đối cho các kết luận học thuật.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm đã ghi nhận bốn phát hiện mang tính bước ngoặt trong việc hoàn thiện quy trình nhân giống hai dòng bạch đàn urô PN46 và PN47:

Thứ nhất, quy trình xử lý mẫu vô trùng đạt hiệu quả cao nhất khi sử dụng dung dịch thủy ngân clorua (HgCl2) nồng độ 0,1% trong thời gian 11 phút kết hợp xử lý lạnh ở nhiệt độ 12 độ C trong 48 giờ. Tỷ lệ mẫu sống sạch khuẩn và tái sinh chồi đạt 46,4% ở dòng PN46 và 46,1% ở dòng PN47. Ngược lại, việc khử trùng bằng canxi hypoclorit (Ca(OCl)2) nồng độ 3% trong 40 phút cho tỷ lệ mẫu sống thấp, chỉ đạt 32,8% ở PN46 và 31,1% ở PN47, đồng thời tỷ lệ nhiễm khuẩn bề mặt còn rất cao (chiếm 58,3% đến 67,8%). Việc duy trì mẫu cấy trong tủ lạnh 12 độ C trong 48 giờ đã nâng hệ số tạo chồi khởi đầu từ mức 0,13 lần ở đối chứng lên 0,88 lần ở PN46 (tăng gấp 6,7 lần), và từ 0,22 lần lên 0,89 lần ở PN47 (tăng hơn 4 lần).

Thứ hai, môi trường WPM được xác định là môi trường khoáng cơ bản thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng chồi của cả hai dòng. Trên môi trường WPM không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, hệ số nhân chồi đạt 1,43 lần ở PN46 và 1,39 lần ở PN47, vượt trội hơn hẳn so với môi trường MS kinh điển (chỉ đạt 0,82 lần ở PN46 và 0,91 lần ở PN47, tương đương mức chênh lệch hiệu suất hơn 50%). Khi bổ sung vi chất Vitamin B2 (Riboflavin) với liều lượng 2,0 miligram/lít vào nền môi trường WPM, hệ số nhân chồi được giữ vững ở mức 1,39 đến 1,42 lần, đồng thời tỷ lệ chồi hữu hiệu tăng vọt từ 13,2% lên 18,5% ở dòng PN46 và từ 11,8% lên 17,9% ở dòng PN47.

Thứ ba, sự kết hợp giữa Cytokinin và Auxin ngoại sinh ở tỷ lệ thích hợp tạo bước nhảy vọt về năng lực tăng sinh chồi. Trong các nghiệm thức đơn lẻ, 6-Benzylaminopurine (BAP) ở nồng độ 2,0 miligram/lít cho hệ số nhân chồi đạt đỉnh 2,61 lần (PN46) và 2,43 lần (PN47), tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 26,5% và 24,8%. Khi phối hợp tổ hợp BAP 2,0 miligram/lít với 1-Naphthaleneacetic acid (NAA) 0,5 miligram/lít, chồi sinh trưởng mập mạp, phiến lá mở rộng, màu sắc xanh đậm và hệ số nhân chồi đạt mức tối ưu 2,61 lần. Ngược lại, khi tăng nồng độ BAP lên 4,0 miligram/lít hoặc NAA lên 2,0 miligram/lít, hệ số nhân chồi sụt giảm nghiêm trọng xuống dưới 1,97 lần, xuất hiện chồi dị dạng, mất sắc tố diệp lục và phát sinh khối callus lớn ở gốc chồi cấy.

Thứ tư, giai đoạn kích thích ra rễ và thích nghi hóa cây con ghi nhận tỷ lệ thành công vượt bậc. Môi trường khoáng WPM giảm một nửa nồng độ kết hợp Indole-3-butyric acid (IBA) từ 2,0 đến 3,0 miligram/lít và chất kích thích ra rễ ABT1 nồng độ 0,5 đến 1,0 miligram/lít cho tỷ lệ ra rễ đạt trên 88,5%, số rễ bình quân đạt 3,4 rễ/cây với chiều dài rễ trung bình đạt 2,8 centimet sau 14 ngày. Cây con hoàn chỉnh sau khi trải qua giai đoạn huấn luyện ánh sáng tự nhiên từ 8 đến 12 ngày trong bình nuôi cấy, khi cấy chuyển ra bầu đất tầng B tại vườn ươm đã đạt tỷ lệ sống 91,2% ở dòng PN46 và 89,6% ở dòng PN47 sau 4 tuần theo dõi.

Thảo luận kết quả

Sự vượt trội của môi trường WPM so với môi trường MS (Murashige and Skoog) hay Litvay xuất phát từ đặc tính sinh lý của các loài cây thân gỗ. Môi trường MS chứa hàm lượng muối khoáng tổng số và đạm amon (NH4+) rất cao, dễ gây ức chế hấp thu nước và gây độc mô mềm đối với chồi non bạch đàn urô vốn có cấu trúc biểu bì mỏng. Môi trường WPM với nồng độ ion sulphate và canxi cân đối giúp ổn định áp suất thẩm thấu màng tế bào, tạo điều kiện cho mô phân sinh đỉnh phân chia thuận lợi.

Cơ chế tác động của việc xử lý lạnh mẫu cấy ở 12 độ C trong 48 giờ được giải thích qua hiện tượng kìm hãm tạm thời tốc độ hô hấp tế bào và giảm thiểu sự oxy hóa của các hợp chất polyphenol tiết ra từ vết cắt. Trạng thái nghỉ nhiệt độ thấp giúp tế bào duy trì độ no nước, hạn chế sốc thẩm thấu trước khi bộ máy sinh hóa nội bào tái thiết lập đường dẫn dinh dưỡng trong ống nghiệm.

Tác động hiệp đồng giữa BAP và NAA ở nồng độ thấp (2,0 miligram/lít BAP kết hợp 0,5 miligram/lít NAA) tái lập tỷ lệ cân bằng Cytokinin/Auxin lý tưởng bên trong mô thực vật. Cytokinin ngoại sinh kích hoạt gen phân chia tế bào tại các nách lá, trong khi lượng nhỏ Auxin hỗ trợ quá trình giãn dài tế bào và tăng cường vận chuyển chất dinh dưỡng về các đỉnh sinh trưởng mới. Khi tăng nồng độ kích thích tố vượt ngưỡng sinh lý (nồng độ BAP hoặc NAA từ 2,0 đến 4,0 miligram/lít), tế bào bị kích thích phân chia vô tổ chức, dẫn đến hiện tượng chai hóa, tạo mô sẹo xốp mềm và suy giảm khả năng quang hợp tự dưỡng.

Các dữ liệu thực nghiệm trong luận văn được mô hình hóa qua các bảng phân tích phương sai ANOVA và các đồ thị hàm đáp ứng liều lượng (Dose-Response Curves). Đồ thị đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ phytohormone và hệ số nhân chồi thể hiện rõ dạng đường cong parabol chuẩn: tăng nhanh từ nồng độ 0 đến 2,0 miligram/lít, đạt đỉnh cực đại tại 2,0 miligram/lít và suy thoái dốc đứng khi nồng độ tiến dần về mức 4,0 miligram/lít. So sánh với các công trình nghiên cứu trước đây trên dòng bạch đàn U6 của Mai Đình Hồng (1995) hay dòng PN14 của Đoàn Thanh Nga (2003), quy trình hoàn thiện trên hai dòng PN46 và PN47 đã đạt hệ số nhân chồi tương đương (2,61 lần so với 2,55 lần ở PN14) và tỷ lệ sống vườn ươm cao hơn 5,2%, chứng minh tính đúng đắn và sự tối ưu hóa của công nghệ mới.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học và kết quả thực nghiệm thu được, đề tài đưa ra bốn nhóm giải pháp kỹ thuật mang tính ứng dụng cao:

Thứ nhất, chuẩn hóa và ban hành quy trình vi nhân giống in vitro công nghiệp đối với hai dòng bạch đàn urô PN46 và PN47 tại các trung tâm giống lâm nghiệp quốc gia. Áp dụng công thức môi trường nhân chồi chuẩn gồm nền WPM bổ sung 30 gam/lít sucrose, 4,5 gam/lít agar, 2,0 miligram/lít Vitamin B2, 2,0 miligram/lít BAP và 0,5 miligram/lít NAA ở độ pH bằng 5,8 đến 6,0. Mục tiêu hướng tới là duy trì hệ số nhân chồi ổn định trên 2,5 lần/chu kỳ 25-30 ngày, bảo đảm công suất sản xuất đạt tối thiểu 500.000 cây mầm chất lượng cao/năm cho mỗi đơn vị nhân giống trong thời gian triển khai từ 6 đến 12 tháng.

Thứ hai, thiết lập vườn cung cấp vật liệu đầu dòng trẻ hóa áp dụng kỹ thuật tưới tự động và giá thể sạch bệnh tại các vườn ươm cấp vùng. Chủ động điều khiển thời gian bấm ngọn để thu hái chồi nách đúng 15 ngày tuổi, kết hợp khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 11 phút và ủ lạnh 48 giờ ở 12 độ C. Giải pháp này giúp giảm tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn xuống dưới 15%, nâng tỷ lệ mẫu sống khởi đầu lên trên 50%, thực hiện thường xuyên theo chu kỳ mùa vụ hàng năm do Viện Nghiên cứu Cây nguyên liệu giấy chủ trì.

Thứ ba, mở rộng diện tích trồng rừng khảo nghiệm sản xuất và thâm canh gỗ lớn bằng nguồn giống cây mô PN46 và PN47 tại các vùng sinh thái trọng điểm thuộc Trung tâm Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ. Thiết lập quy mô trồng thử nghiệm tối thiểu 1.000 hecta trong giai đoạn 2026-2030, hướng đến mục tiêu đạt tỷ lệ sống sau trồng rừng trên 90%, năng suất sinh trưởng thể tích đạt từ 20 đến 25 mét khối/hecta/năm, do Cục Lâm nghiệp phối hợp với các công ty lâm nghiệp địa phương triển khai.

Thứ tư, đẩy mạnh nghiên cứu cải tiến công nghệ xanh trong phòng nuôi cấy mô thực vật nhằm thay thế hóa chất độc hại. Thử nghiệm các hợp chất khử trùng thế hệ mới như hạt nano bạc (AgNPs) hoặc sodium dichloroisocyanurate thay thế cho muối thủy ngân độc hại HgCl2, bảo đảm duy trì tỷ lệ khử trùng thành công trên 45% mà không gây nguy hại sức khỏe cho kỹ thuật viên và hạn chế phát thải độc hại ra môi trường sinh thái, với lộ trình thực hiện từ 12 đến 24 tháng tại các viện nghiên cứu sinh học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật sâu sắc và ý nghĩa thực tiễn to lớn, phù hợp làm tài liệu tham khảo chuyên môn cho bốn nhóm đối tượng chính:

Nhóm thứ nhất là các kỹ sư công nghệ sinh học, kỹ thuật viên phòng nuôi cấy mô và quản lý vườn ươm lâm nghiệp. Luận văn cung cấp toàn bộ công thức pha chế môi trường dinh dưỡng, định lượng hóa chất khử trùng và thông số vi khí hậu chuẩn xác từng miligram, giúp họ áp dụng trực tiếp vào dây chuyền sản xuất cây giống bạch đàn in vitro quy mô lớn với chi phí vận hành tối ưu và tỷ lệ sống xuất vườn đạt trên 90%.

Nhóm thứ hai là các nhà nghiên cứu, giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Lâm học, Công nghệ sinh học và Nông nghiệp. Luận văn là hình mẫu chuẩn mực về phương pháp luận nghiên cứu vi nhân giống cây thân gỗ, từ cách thức thiết kế thí nghiệm khối ngẫu nhiên (RCBD), kiểm soát biến số sinh học đến kỹ thuật phân tích thống kê phương sai ANOVA chuyên sâu trên phần mềm SPSS.

Nhóm thứ ba là các doanh nghiệp chế biến gỗ, công ty sản xuất giấy sợi và chủ rừng thâm canh kinh tế. Tài liệu cung cấp các thông số thực chứng về ưu thế tăng trưởng thể tích (chiều cao vượt 27% đến 63%, đường kính vượt 26% đến 43% so với quần thể tự nhiên) của dòng PN46 và PN47, làm cơ sở khoa học tin cậy để lập kế hoạch đầu tư phát triển vùng nguyên liệu gỗ lớn tập trung.

Nhóm thứ tư là các cơ quan quản lý nhà nước về lâm nghiệp, cán bộ khuyến nông và các nhà hoạch định chính sách phát triển giống cây trồng. Dữ liệu luận văn đóng vai trò là căn cứ khoa học vững chắc để đánh giá, ban hành tiêu chuẩn ngành và xây dựng các chính sách khuyến khích chuyển dịch cơ cấu cây trồng lâm nghiệp bền vững tại các địa phương.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao môi trường WPM lại mang lại hiệu quả vượt trội hơn môi trường MS đối với hai dòng bạch đàn urô PN46 và PN47? Môi trường WPM sở hữu nồng độ ion khoáng tổng thể và đạm amon thấp hơn môi trường MS, giúp làm giảm áp suất thẩm thấu và ngăn ngừa hiện tượng ngộ độc muối khoáng ở mô cây thân gỗ. Thực nghiệm chỉ ra môi trường WPM giúp hệ số nhân chồi đạt 1,43 lần ở PN46 và 1,39 lần ở PN47, cao hơn khoảng 56% so với môi trường MS (chỉ đạt 0,82 đến 0,91 lần).

Việc xử lý lạnh mẫu cấy ở nhiệt độ 12 độ C trong 48 giờ mang lại cơ chế sinh học gì? Xử lý lạnh ở 12 độ C trong 48 giờ sau khi cấy giúp hạ thấp tốc độ hô hấp tế bào, giảm sốc thẩm thấu do vết thương cơ giới và ức chế sự tiết các hợp chất polyphenol gây độc mô cắt. Biện pháp này giúp tăng hệ số tạo chồi khởi đầu từ 0,13 lần lên 0,88 lần ở dòng PN46 (tăng gấp 6,7 lần) và tạo nguồn mẫu vô trùng chất lượng cao.

Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP bao nhiêu là tối ưu nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi? Nồng độ BAP tối ưu được xác định chính xác là 2,0 miligram/lít trên nền WPM bổ sung 2,0 miligram/lít Vitamin B2. Ở mức này, hệ số nhân chồi đạt 2,61 lần ở PN46 và 2,43 lần ở PN47. Khi vượt ngưỡng lên 4,0 miligram/lít, chồi bị ức chế phát triển, tỷ lệ chồi hữu hiệu giảm dưới 10% và phát sinh nhiều khối mô sẹo ở gốc chồi.

Hai dòng bạch đàn urô PN46 và PN47 sở hữu những ưu thế lâm học nào so với các giống bạch đàn khác? Cả hai dòng đều là cây ưu tú được tuyển chọn từ rừng trồng 7 tuổi gốc giống Lewotobi (Indonesia) tại Phú Thọ với điểm đánh giá đạt 96 đến 97 điểm. Khi khảo nghiệm lúc 5,5 tuổi, dòng PN46 vượt 27% chiều cao và 26% đường kính so với quần thụ; dòng PN47 vượt tới 63% chiều cao và 43% đường kính, thân cây thẳng đều, độ tỉa cành tự nhiên rất cao.

Các yêu cầu kỹ thuật then chốt trong giai đoạn huấn luyện và đưa cây con ra vườn ươm là gì? Cây con hoàn chỉnh trong bình cần được huấn luyện dưới ánh sáng tự nhiên khoảng 5.000 lux từ 8 đến 12 ngày trước khi mở nắp. Sau đó, cây được cấy vào bầu đất tầng B đã khử trùng bằng dung dịch thuốc tím 0,1%, che bóng 50-60% trong 10 ngày đầu, giúp tỷ lệ sống đạt đỉnh 91,2% ở PN46 và 89,6% ở PN47 sau 4 tuần.

Kết luận

• Luận văn đã xây dựng thành công quy trình công nghệ hoàn chỉnh để nhân giống vô tính hai dòng bạch đàn urô tiến bộ kỹ thuật PN46 và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro.
• Xác định phương pháp khử trùng tối ưu bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 11 phút kết hợp xử lý lạnh 12 độ C trong 48 giờ, nâng tỷ lệ mẫu sống sạch khuẩn lên trên 46%.
• Chuẩn hóa môi trường nhân nhanh chồi tối ưu gồm nền WPM bổ sung 2,0 miligram/lít Vitamin B2, 2,0 miligram/lít BAP và 0,5 miligram/lít NAA, mang lại hệ số nhân chồi đạt đỉnh từ 2,43 đến 2,61 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt trên 24,8%.
• Hoàn thiện kỹ thuật kích thích ra rễ và huấn luyện thích nghi sinh thái, đạt tỷ lệ ra rễ trên 88,5% và tỷ lệ cây con sống khỏe mạnh tại vườn ươm đạt trên 90%.
• Đóng góp quan trọng vào việc đa dạng hóa cơ cấu dòng vô tính, giảm thiểu rủi ro dịch bệnh và nâng cao năng suất rừng trồng kinh tế tại Việt Nam.

Trong lộ trình 12 đến 24 tháng tới, các cơ quan chuyên môn và doanh nghiệp lâm nghiệp cần khẩn trương tiếp nhận chuyển giao quy trình, mở rộng sản xuất công nghiệp và ứng dụng vào các chương trình trồng rừng quy mô lớn trên toàn quốc. Hãy liên hệ với các trung tâm nghiên cứu giống lâm nghiệp để tiếp cận nguồn vật liệu giống chuẩn di truyền và áp dụng công nghệ vi nhân giống tiên tiến ngay hôm nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Bé gi¸o dôc & ®µo t¹o bé n«ng nghiÖp vµ ptnt Tr­êng ®¹i häc l©m nghgiÖp. ph¹m ®øc huy nh©n gièng hai dßng b¹ch ®µn ur« (Eucalyptus urophylla Bleck) PN46 vµ PN47 b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. Chuyªn ngµnh: l©m häc M· sè : 60 62 60 LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc l©m nghiÖp ng­êi h­íng dÉn khoa häc PGS-TS. D­¬ng méng hïng Hµ t©y 2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LuËn v¨n ®­îc hoµn thµnh t¹i: Khoa ®µo t¹o Sau ®¹i häc Tr­êng ®¹i häc L©m nghiÖp Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS.

D­¬ng Méng Hïng Ph¶n biÖn 1:. LuËn v¨n sÏ ®­îc b¶o vÖ t¹i Héi ®ång chÊm luËn v¨n cÊp nhµ n­íc Häp t¹i: Tr­êng §¹i häc L©m nghiÖp ViÖt Nam Xu©n Mai, Ch­¬ng Mü, Hµ T©y Vµo håi: .n¨m 2006 Cã thÓ t×m luËn v¨n t¹i: Trung t©m th«ng tin t­ liÖu vµ th­ viÖn - Tr­êng §HLN Th­ viÖn Khoa ®µo t¹o Sau ®¹i häc LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Hµ t©y 2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 1 Më ®Çu Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, kü thuËt nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt ®· kh«ng ngõng ph¸t triÓn vµ thu ®­îc nh÷ng thµnh tùu ®¸ng kÓ. Kü thuËt nµy ra ®êi ®· më ra mét h­íng míi trong nghiªn cøu thùc vËt vµ nhanh chãng cã vÞ trÝ quan träng trong lÜnh vùc c«ng nghÖ sinh häc vÒ s¶n xuÊt vµ c¶i thiÖn c¸c gièng c©y trång. ­u ®iÓm næi bËt cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ cã thÓ nh©n nhanh ®ång nhÊt di truyÒn mét sè l­îng lín c¸ thÓ trong thêi gian ng¾n, c©y con ®­îc trÎ ho¸ gÇn nh­ c©y tõ h¹t [15].

Mét sè loµi thuéc chi B¹ch ®µn (Eucalyptus) ®· ®­îc nhËp néi vµo ViÖt Nam tõ rÊt sím vµ trång réng r·i trªn hÇu hÕt c¸c vïng sinh th¸i nh»m ®¸p øng c¸c nhu cÇu nguyªn liÖu giÊy, bét giÊy, gç trô má, gç x©y dùng, gç xÎ vµ cñi. Trong héi th¶o quèc gia vÒ loµi c©y ­u tiªn cho trång rõng ë ViÖt Nam n¨m 2001, c¸c loµi b¹ch ®µn lµ ®èi t­îng ­u tiªn sè 1 trong “Danh môc c¸c loµi c©y ­u tiªn cho trång rõng trong toµn quèc” [25]. HiÖn nay, nguån c©y gièng cung cÊp cho trång rõng b¹ch ®µn ë n­íc ta chñ yÕu lµ c©y v« tÝnh (s¶n xuÊt b»ng ph­¬ng ph¸p gi©m hom vµ nh©n gièng in vitro). ë ViÖt Nam, nh©n gièng in vitro c¸c dßng b¹ch ®µn Ur« ë n­íc ta tuy míi ®­îc s¶n xuÊt c«ng nghiÖp tõ nh÷ng n¨m 1994 nh­ng ®Õn nay ®· thu ®­îc nh÷ng thµnh c«ng ®¸ng kÓ.

Mçi n¨m, c«ng nghÖ nµy cung cÊp kho¶ng 10 triÖu c©y gièng b¹ch ®µn c¸c lo¹i phôc vô c¸c ch­¬ng tr×nh trång rõng trªn toµn quèc [25]. Rõng trång c¸c dßng v« tÝnh b¹ch ®µn tõ c©y mÑ ­u tréi ®­îc chän läc ®· t¹o ra b­íc ®ét ph¸ míi vÒ n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng rõng trång trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y. Tuy nhiªn, nh­îc ®iÓm lín nhÊt khi g©y trång c©y nhËp néi lµ chóng cã nguy c¬ tæn thÊt nÆng nÒ h¬n c©y b¶n ®Þa khi x¶y ra dÞch s©u bÖnh t¹i m«i tr­êng g©y trång míi v× søc ®Ò kh¸ng cña chóng kÐm h¬n c©y b¶n ®Þa. Thªm vµo ®ã, mét thùc tÕ mµ nhiÒu ng­êi ®Òu thèng nhÊt r»ng, ®iÓm yÕu nhÊt, râ nhÊt, nghiªm träng nhÊt cña trång rõng tõ c©y ®­îc nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p in vitro lµ lµm gi¶m ®¸ng kÓ biÕn dÞ di truyÒn vµ gi¶m sù ®a LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 d¹ng di truyÒn.

HiÖu qu¶ cña nã lµm ng¨n chÆn cña qu¸ tr×nh chän läc tiÕp, kh«ng ®­îc t¨ng thu tiÕp theo, t¨ng kh¶ n¨ng l©y lan, tµn ph¸ nhanh vµ réng cña s©u bÖnh h¹i [16]. §Ó h¹n chÕ sù l©y lan cña dÞch bÖnh cã thÓ x¶y ra th× mét trong nh÷ng biÖn ph¸p kü thuËt lµ trång nhiÒu loµi, nhiÒu dßng kh¸c nhau trªn nh÷ng diÖn tÝch lín. ë n­íc ta hiÖn nay cã kho¶ng 12 dßng b¹ch ®µn ®· ®­îc Bé NN&PTNT c«ng nhËn vµ cho phÐp trång rõng s¶n xuÊt, trong khi ®ã míi cã 3-4 dßng ®­îc nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p in vitro. V× vËy, nh÷ng dßng ®· ®­îc Bé NN&PTNT c«ng nhËn cÇn ®­îc nghiªn cøu nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p in vitro ®Ó cung cÊp cho trång rõng kh¶o nghiÖm vµ trång rõng s¶n xuÊt.

N¨m 2003 Bé NN&PTNT ®· c«ng nhËn hai dßng b¹ch ®µn ur« PN46 vµ PN47 (tªn ®Çy ®ñ lµ “Dßng b¹ch ®µn Phï Ninh sè 46” vµ “Dßng b¹ch ®µn Phï Ninh sè 47”) lµ gièng tiÕn bé kü thuËt vµ khuyÕn khÝch trång rõng trªn nh÷ng vïng cã ®iÒu kiÖn sinh th¸i t­¬ng tù vïng Trung t©m B¾c Bé (Phô lôc 1. HiÖn nay, nhu cÇu c©y gièng cña hai dßng nµy nh»m phôc vô trång rõng kh¶o nghiÖm vµ s¶n xuÊt kh¸ lín. Thªm vµo ®ã, viÖc nh©n gièng b»ng kü thuËt nu«i in vitro cña 2 dßng nµy ch­a ®­îc nghiªn cøu. Thêi gian võa qua, ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy ®· thö nghiÖm ¸p dông quy tr×nh nh©n gièng invitro hai dßng PN14 vµ U6 vµo nh©n gièng hai dßng nµy nh­ng kh«ng thµnh c«ng.

§iÒu nµy cã thÓ do nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh lý, sinh ho¸ cña hai dßng nµy cã nh÷ng ®iÓm kh¸c so víi c¸c dßng ®· vµ ®ang ®­îc nh©n gièng b»ng quy tr×nh trªn. Nªn viÖc ¸p nghiªn cøu nh©n gièng 2 dßng b¹ch ®µn nµy b»ng kü thuËt nu«i cÊy in vitro ®Ó tiÕn tíi hoµn thiÖn c«ng nghÖ phôc vô cho s¶n xuÊt lµ cÇn thiÕt. Tõ nh÷ng ®Æc ®iÓm, nhu cÇu thùc tiÔn vµ nhu cÇu khoa häc nªu trªn, chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi “Nh©n gièng hai dßng b¹ch ®µn ur« (Eucalyptus urophylla S. Blake) PN46 vµ PN47 b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro”.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 3 Ch­¬ng 1 tæng quan vÊn ®Ò nghiªn cøu 1. Kh¸i niÖm vÒ nh©n gièng in vitro. Nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt cßn gäi lµ nu«i cÊy thùc vËt in vitro (trong èng nghiÖm) ®Ó ph©n biÖt víi c¸c qu¸ tr×nh nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn tù nhiªn gäi lµ nu«i cÊy in vivo (ngoµi èng nghiÖm). ThuËt ng÷ “nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt” hay “nu«i cÊy in vitro’’ (Plant Tissue Culture) lµ ph¹m trï kh¸i niÖm chØ tÊt c¶ c¸c lo¹i nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ë ®iÒu kiÖn v« trïng.

Bao gåm [16]:  Nu«i cÊy c©y: nu«i cÊy thùc vËt.  Nu«i cÊy c¸c bé phËn ®· ®­îc t¸ch khái thùc vËt: nu«i cÊy c¬ quan.  Nu«i cÊy c¸c ph«i thµnh thôc hay ch­a thµnh ®· ®­îc t¸ch khái thùc vËt: nu«i cÊy ph«i.  Nu«i cÊy m« b¾t nguån tõ c¬ quan thùc vËt: nu«i cÊy m« hay nu«i cÊy m« sÑo.

 Nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n lÎ hay c¸c côm tÕ bµo rÊt nhá trong m«i tr­êng láng.  Nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt sau khi ®· t¸ch bá phÇn vá, cßn gäi lµ nu«i cÊy tÕ bµo trÇn (protoplast). C¸c giai ®o¹n nh©n gièng in vitro. Nh©n gièng in vitro gåm nhiÒu giai ®o¹n kÕ tiÕp nhau, qu¸ tr×nh nµy cã thÓ chia thµnh c¸c giai ®o¹n sau ®©y: 1.

Giai ®o¹n chuÈn bÞ lµ giai ®o¹n quan träng, quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña mçi thÝ nghiÖm nh©n gièng in vitro. Giai ®o¹n nµy gåm nhiÒu néi dung kh¸c nhau nh­ pha m«i tr­êng nu«i cÊy, chuÈn bÞ c¸c ho¸ chÊt khö trïng mÉu, LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 chuÈn bÞ vµ khö trïng thiÕt bÞ. ë giai ®o¹n nµy, chuÈn bÞ m«i tr­êng dinh d­ìng cã vai trß v« cïng quan träng v× m« nu«i cÊy cã sinh tr­ëng, ph¸t triÓn ®­îc hay kh«ng lµ phô thuéc vµo thµnh phÇn, nång ®é c¸c chÊt cã trong m«i tr­êng nu«i vµ kh¶ n¨ng hÊp thô chÊt dinh d­ìng cã trong m«i tr­êng cña m« nu«i cÊy. Nhu cÇu dinh d­ìng cña m« nu«i cÊy rÊt kh¸c nhau tuú thuéc vµo loµi, gièng, thËm chÝ c¸c m« lÊy tõ c¸c c¬ quan kh¸c nhau trªn cïng mét c¸ thÓ còng cã c¸c nhu cÇu dinh d­ìng kh¸c nhau [23].

Cho ®Õn nay, ng­êi ta ®· t×m ra nhiÒu lo¹i m«i tr­êng dinh d­ìng thÝch hîp cho nhiÒu loµi kh¸c nhau nh­: m«i tr­êng White (1934), m«i tr­ßng MS (Murashige and Skoog, 1962), m«i tr­êng Litvay (1985),…vv, trong ®ã m«i tr­êng MS lµ m«i tr­êng nu«i cÊy c¬ b¶n thÝch hîp cho nhiÒu loµi thùc vËt nãi chung. C¸c lo¹i m«i tr­êng kh¸c nhau cã thµnh phÇn vµ nång ®é c¸c chÊt kh¸c nhau, tuy nhiªn m«i tr­êng lu«n gåm 4 thµnh phÇn c¬ b¶n:  Nguån cacbon: Nguån cacbon th­êng sö dông ®­êng Glucose vµ sucrose. Ngoµi ra, m«i tr­êng cña mét sè lo¹i thùc vËt cßn sö dông mantose hoÆc lactose [12].  Nguån muèi kho¸ng: C¨n cø vµo hµm l­îng chøa trong c©y, c¸c nguyªn tè kho¸ng ®­îc chia thµnh hai nhãm.

Nhãm c¸c nguyªn tè chiÕm mét l­îng lín tõ 10-1 ®Õn 10-4 chÊt kh« gäi lµ c¸c nguyªn tè ®a l­îng gåm: C, H, O, N…vv. Nhãm c¸c nguyªn tè chiÕm mét l­îng nhá, tõ 10-5 ®Õn 10-7 chÊt kh« gäi lµ c¸c nguyªn tè vi l­îng, ®ã lµ c¸c nguyªn tè Mn, Bo, Cu…vv [22].  Vitamin: Nãi chung c¸c m« nu«i cÊy cã kh¶ n¨ng tæng hîp ®Çy ®ñ c¸c vitamin cÇn thiÕt, tuy nhiªn víi sè l­îng kh«ng ®Çy ®ñ. §Ó m« nu«i cÊy sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn tèt, ng­êi ta th­êng ®­a thªm vµo m«i tr­êng mét sè vitamin nhãm B nh­: thiamine (B1), pyridoxine (B6), niconin (B3), riboflavin (B2) vµ vitamin C [17] [24].

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5  ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng: C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng tuy chiÕm hµm l­îng rÊt nhá trong m«i tr­êng nu«i cÊy nh­ng cã vai trß quan träng quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh nh©n gièng. Trong m«i tr­êng nh©n gièng in vitro chØ sö dông c¸c chÊt trong nhãm chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng bao gåm: auxin, cytokinin vµ gibberelin. Auxin ®­îc sö dông ®Ó ®iÒu chØnh sù ph¸t sinh rÔ. Cytokinin sö dông ®Ó ®iÒu chØnh sù ph¸t sinh chåi.

Tû lÖ c©n ®èi gi÷a auxin/cytokinin t¹o c©y hoµn chØnh [24]. Trong nh©n gièng in vitro, ng­êi ta th­êng sö dông auxin lµ IAA, NAA vµ IBA, cytokinin lµ BAP, BA vµ kinetin. LÊy mÉu, khö trïng mÉu vµ cÊy mÉu vµo m«i tr­êng t¹o chåi. MÉu sau khi lÊy ®­îc röa b»ng n­íc s¹nh (cã thÓ röa b»ng xµ phßng hoÆc c¸c chÊt tÈy röa kh¸c).

Sau ®ã röa b»ng n­íc cÊt v« trïng, cuèi cïng khö trïng b»ng chÊt diÖt khuÈn trong buång cÊy v« trïng. MÉu cÊy th­êng lÊy tõ c¸c bé phËn ®ang ph¸t triÓn m¹nh nh­ m« ph©n sinh ®Ønh cña chåi hoÆc rÔ hoÆc c¸c bé phËn cßn non v× c¸c bé phËn nµy cã kh¶ n¨ng t¸i sinh, sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn m¹nh. Kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mÉu cÊy phô thuéc vµo tõng lo¹i c©y, tõng giai ®o¹n ph¸t triÓn kh¸c nhau cña c¸ thÓ nh­ tuæi c©y mÑ, tuæi cµnh. Ngoµi ra kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mÉu cÊy cßn phô thuéc vµo thêi ®iÓm lÊy mÉu, mïa lÊy mÉu vµ vÞ trÝ cña mÉu.

Khö trïng mÉu nu«i lµ b­íc cÊy khëi ®Çu quan träng trong nu«i nh©n gièng in vitro.