MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Công nghệ sinh học đã và đang làm thay đổi thế giới, chính vì vậy mà nhiều tổ chức và chuyên gia trên thế giới đã khẳng định thế kỷ XXI là thế kỷ của Công nghệ sinh học. Cùng với sự phát triển của xã hội, trong những năm gần đây, lĩnh vực công nghệ sinh học ngày một khẳng định vai trò của mình, Công nghệ sinh học đã thực sự trở thành công cụ không thể thiếu, đóng góp thiết thực và hiệu quả trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y – dược, vật liệu… với việc tạo ra các giống cây trồng, vật nuôi mới cho năng suất, chất lượng với hiệu quả kinh tế cao, các loại enzyme đã tạo ra những sinh phẩm phục vụ điều trị bệnh, và những chế phẩm vi sinh ứng dụng trong xử lý môi trường. Với tốc độ ô nhiễm môi trường đang gia tăng do việc thải các chất thải vào môi trường không kiểm soát như hiện nay, sử dụng các phương pháp hóa học và sinh học thông thường ngày càng khó đạt được mức độ cần thiết để loại bỏ các chất ô nhiễm.
Do đó, việc triển khai những phương pháp xử lí hiệu quả và không gây ô nhiễm thứ cấp là điều cấp thiết. Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh được enzyme có nhiều khả năng và triển vọng trong giải quyết vấn đề xử lí ô nhiễm môi trường. Enzyme có thể hoạt động trên các chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lí để loại chúng bằng cách kết tủa, chuyển hóa, phân hủy các chất ô nhiễm thành dạng khác. Ngoài ra, enzyme còn có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải đưa chúng về dạng dễ xử lí hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn.
Phương pháp xử lí bằng enzyme có những ưu điểm sau: được áp dụng với những chất sinh học khó xử lí, tác dụng cả ở vùng nồng độ chất ô nhiễm môi trường cao, một số enzyme riêng biệt có tác dụng trên phạm vi rộng pH, nhiệt độ,…mà không gây ra những biến đổi bất thường, không gây ra các cản trở phá vỡ cân bằng sinh thái. Như đã biết, các chất độc hại trong môi trường thường là các chất hữu cơ có vòng thơm như các hợp chất phenol, amine vòng hoặc các hợp chất phosphorus, để đạt được mục đích xử lí môi trường cần phải phá hủy hoặc loại bỏ các chất độc đó. Trong các loại enzyme, thì enzyme phản ứng oxy 1 hóa khử thuộc lớp 1 (oxydoreductase) và các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân thuộc lớp 3 (hydrolase) có khả năng phân hủy các hợp chất được nêu trên rất cao.2, p-diphenol oxidase) là một enzyme đặc biệt phổ biến và linh hoạt được sản xuất rộng rãi và đa dạng trong tự nhiên như từ thực vật, nấm, vi khuẩn và côn trùng, thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là phenol oxidase, xúc tác quá trình oxy hóa nhiều hợp chất hữu cơ bao gồm diphenol, polyphenol, diamine, amine thơm, benzenethiol và một số hợp chất vô cơ như iodine,… Laccase có tính oxy hóa mạnh, có phổ cơ chất đa dạng và sử dụng oxygen phân tử làm chất nhận điện tử nên enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, trong xử lý phụ phẩm công - nông nghiệp và nguồn nước thải ô nhiễm. Bên cạnh đó, laccase cũng là enzyme thân thiện với môi trường do trong phản ứng laccase chỉ cần lấy oxygen từ không khí và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sau phản ứng là nước.
Với những ứng dụng quan trọng và những lợi thế ưu việt như vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tạo laccase tái tổ hợp và thử nghiệm khả năng khử màu một số thuốc nhuộm công nghiệp” nhằm mục đích tạo được laccase tái tổ hợp để phân giải các hợp chất hữu cơ khó phân hủy gây ô nhiễm môi trường. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu lí thuyết - Tuyển chọn được chủng vi sinh vật mới có khả năng phân giải laccase mạnh. - Nghiên cứu biểu hiện laccase của Fusarium oxysporum trong Pichia pastoris nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp. - Phân hủy thành công một số thuốc nhuộm tổng hợp bằng laccase tái tổ hợp.
Mục tiêu thực nghiệm: tạo được laccase tái tổ hợp để phân giải các hợp chất hữu cơ khó phân hủy gây ô nhiễm môi trường. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp laccase; - Tạo dòng gen laccase vào hệ thống vector biểu hiện cho P. pastoris; - Sinh tổng hợp laccase trong P. pastoris; - Tinh sạch và xác định đặc tính laccase tái tổ hợp; 2 - Khảo sát khả năng phân hủy các hợp chất màu hữu cơ (khó phân hủy) của laccase tái tổ hợp.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Phân lập được chủng F. oxysporum HUIB02 có khả năng sinh tổng hợp laccase ngoại bào mạnh. Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về laccase từ F. - Tạo dòng và giải trình tự thành công 04 gen mã hóa laccase từ DNA và cDNA của chủng F.
Các gen có độ tương đồng cao với nhóm gen laccase của các chủng F. oxysporum phân lập từ các vùng khác trên thế giới cho thấy có sự bảo thủ cao về nhóm gen mã hóa laccase ở nấm nói chung và F. - Biểu hiện tái tổ hợp thành công gen mã hóa laccase từ cDNA của chủng F. oxysporum HUIB02 trong P.
Gen được ký hiệu ký hiệu Folac1, đây là nghiên cứu đầu tiên trên thế giới về biểu hiện tái tổ hợp thành công Folac1 trong vật chủ. - Laccase tự nhiên và laccase tái tổ hợp có khả năng phân hủy màu của nhiều loại thuốc nhuộm tổng hợp với hiệu suất hơn 90%. Kết quả chứng minh tính ứng dụng cao của laccase tái tổ hợp trong xử lý các hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Giới thiệu chung về laccase Laccase (Lacc, EC 1.2) thuộc nhóm polyphenol oxidase, là protein có chứa đồng (Cu) trong cấu trúc, với các tính năng đặc trưng là oxy hoá các hợp chất vòng thơm và đòi hỏi oxygen phân tử cho hoạt tính. Laccase còn được biết đến như một enzyme thân thiện với môi trường do trong phản ứng laccase chỉ cần lấy oxygen từ không khí và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sau phản ứng là nước [80]. Laccase là một trong số ít các enzyme đã được nghiên cứu từ thế kỷ XIX. Yoshida mô tả laccase đầu tiên vào năm 1883 khi ông chiết xuất từ các dịch tiết của cây sơn mài Nhật Bản (Rhus vernicifera).
Năm 1893, Gabriel Bertrand đã phân lập được enzyme này từ R. succedanea và các chủng khác của họ Anacardiaceae: Mangifera indica, Schinus molle, Pistacia palaestina, Pleiogynium timoriense. Laccase là enzyme thuộc nhóm protein nhân Cu, một số enzyme khác trong nhóm nhân Cu gồm enzyme cytochrome oxidase ở thực vật và enzyme ceruloplasmin trong huyết tương động vật có vú. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau có sự khác biệt về mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và động học enzyme [43].
Cấu tạo của laccase 1. Khối lượng phân tử Phân tử laccase thường là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbohydrate chiếm khoảng 10 – 25% [24]. Cấu trúc không gian Laccase được phân loại như là protein nhân Cu với bốn nguyên tử Cu trong ba trạng thái oxy hóa khử khác nhau.
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B, C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B 4 và C, trung tâm một nguyên tử Cu nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử Cu nằm ở bề mặt chung của vùng A và C (hình 1. Cấu trúc không gian của laccase từ Melanocarpus albomyces. Tiểu phần A, B, C được kí hiệu đỏ, vàng và xanh lá cây [13].1, trung tâm Cu một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử Cu T1, liên kết với một đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cysteine.
Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cysteine là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng. Trung tâm hoạt động của laccase được mô hình hóa bởi Sergio [10]. 5 Tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử Cu. Những nguyên tử Cu này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử.
Các nguyên tử Cu T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử Cu T3 không tạo phổ hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [43], [60], [80]. Cấu trúc trung tâm hoạt động của laccase [60]. Trung tâm Cu có 3 nguyên tử gồm một nguyên tử Cu T2 và một cặp nguyên tử Cu T3. Nguyên tử Cu T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử Cu T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ [60].
Cơ chế xúc tác của laccase Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxygen phân tử làm chất nhận điện tử. Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 V- 0,8 V [132]. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme như hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa [10]. Trung tâm Cu một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất.
Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử Cu T1, biến nguyên tử Cu T1 (Cu2+) trở thành 6 dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử Cu đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 điện tử từ nguyên tử Cu T1 sang cụm nguyên tử Cu T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxygen sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxidase cuối cùng bị khử thành nước [10], [43]. Ngoài ra, sự xúc tác của laccase có thể xảy ra theo cơ chế sau.
Đầu tiên cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử Cu đảm nhiệm.