Luận văn: Tách dòng và đánh giá khoáng hóa xương cá Medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP

Nghiên cứu chi tiết về mức độ khoáng hóa xương trên mô hình cá medaka chuyển gen. Luận văn cung cấp phương pháp tách dòng và đánh giá khoa học.

• Tác giả: Phạm Thị Thanh
• Người hướng dẫn: TS. Tô Thanh Thúy
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Tách dòng và đánh giá mức độ khoáng hóa xương của cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu khoáng hóa xương trên cá Medaka chuyển gen

Nghiên cứu khoáng hóa xương trên cá Medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP là một lĩnh vực khoa học tiên tiến trong sinh học thực nghiệm. Cá Medaka được sử dụng làm mô hình động vật để nghiên cứu các cơ chế liên quan đến bệnh loãng xương và tái tạo xương. Dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP mang gen RANKL được điều khiển bởi promoter HSE, cho phép theo dõi sự biểu hiện huỳnh quang CFP tại các vị trí có hoạt động xương cao. Công trình nghiên cứu này, được hoàn thành tại Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2016, nhằm tách dòng và đánh giá mức độ khoáng hóa xương ở các dòng cá đồng nhất về di truyền. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc sử dụng mô hình cá Medaka để hiểu rõ hơn về các quá trình sinh lý liên quan đến xương.

1.1. Cá Medaka làm mô hình nghiên cứu bệnh loãng xương

Cá Medaka là một mô hình động vật lý tưởng cho nghiên cứu bệnh loãng xương do có nhiều ưu điểm so với các mô hình khác. Xương của cá Medaka có cấu trúc tương tự với xương động vật có xương sống khác, cho phép áp dụng kết quả nghiên cứu vào y sinh. Chu kỳ phát triển nhanh, kích thước nhỏ gọn, và khả năng tái tạo xương tốt làm cho cá Medaka trở thành công cụ nghiên cứu hiệu quả. Sự minh bạch của cơ thể ấu trùng cho phép theo dõi quá trình khoáng hóa xương mà không cần can thiệp xâm lấn.

1.2. Gen rankl và vai trò trong quá trình khoáng hóa xương

Gen RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor kappa-B Ligand) đóng vai trò quan trọng trong biệt hóa tế bào hủy xương và cân bằng xương. RANKL kích thích hình thành và hoạt động của osteoclast, những tế bào chịu trách nhiệm hủy xương. Sự điều khiển mức độ biểu hiện RANKL ảnh hưởng trực tiếp đến mật độ xương và tính chất khoáng hóa. Trong dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP, sự biểu hiện CFP phản ánh hoạt động của gen RANKL, cho phép các nhà khoa học quan sát quá trình khoáng hóa một cách trực quan.

II. Phương pháp tách dòng cá Medaka chuyển gen đồng nhất về di truyền

Phương pháp tách dòng cá là quá trình quan trọng để tạo các dòng cá đồng nhất về kiểu hình và kiểu gen. Các cá thể chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu là dị hợp tử với một đoạn chèn, có mức độ tổn thương xương không đồng nhất. Bằng cách tiến hành lai ngoại phối và lai phân tích qua nhiều thế hệ (F1, F2, F3), các nhà nghiên cứu có thể xác định và phân lập các cá dị hợp tử mang đúng một đoạn chèn với gen chuyển. Quá trình này đòi hỏi kỹ thuật lai cá tinh xảo và phân tích di truyền chi tiết để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

2.1. Quy trình lai ngoại phối và lai phân tích

Quy trình lai ngoại phối bắt đầu bằng việc lai các cá chuyển gen rankl:HSE:CFP thế hệ F0 với cá hoang dã để tạo thế hệ F1. Tiếp theo, lai phân tích được thực hiện giữa cá F1 và cá hoang dã để xác định các kiểu gen. Lai ngoại phối lặp lại giúp xác nhận các cá thể dị hợp tử và loại bỏ những cá mang nhiều đoạn chèn. Đặt tên cá theo hệ thống chuẩn giúp theo dõi các phép lai và kết quả di truyền một cách rõ ràng.

2.2. Sử dụng sốc nhiệt để tạo cá đồng hợp tử

Phương pháp sốc nhiệt là kỹ thuật hiện đại để tạo cá đồng hợp tử từ các cá dị hợp tử. Bằng cách tác động độ nhiệt cao vào các ấu trùng ở giai đoạn phát triển sớm, có thể kích hoạt trứng và tạo các cá thể đồng hợp tử. Phương pháp này giúp tăng tốc độ tạo dòng và giảm số thế hệ cần thiết để thu được cá đồng nhất về di truyền.

III. Kỹ thuật đánh giá mức độ khoáng hóa xương ở cá Medaka

Đánh giá mức độ khoáng hóa xương là một bước quan trọng trong nghiên cứu bệnh loãng xương và hiệu quả của chất chống loãng xương. Các kỹ thuật hiện đại cho phép đo lường mật độ xương và tính chất khoáng hóa một cách chính xác. Nhuộm xương ấu trùng cá với các chất nhuộm đặc biệt giúp làm nổi bật cấu trúc xương và mức độ khoáng hóa. Chụp ảnh huỳnh quang cho phép quan sát sự biểu hiện CFP và xác định các vị trí có hoạt động RANKL cao. Kết hợp xử lý hình ảnh với phần mềm chuyên dụng, các nhà khoa học có thể định lượng mật độ xương và so sánh giữa các dòng cá.

3.1. Phương pháp nhuộm xương và chụp ảnh huỳnh quang

Phương pháp nhuộm xương sử dụng các chất nhuộm an toàn để tô màu các cấu trúc xương, giúp phân biệt xương với các mô mềm khác. Ấu trùng cá được xử lý theo quy trình chuẩn để bảo vệ tính toàn vẹn của mô xương. Chụp ảnh huỳnh quang được thực hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang để ghi lại biểu hiện CFP từ gen RANKL. Các hình ảnh được lưu trữ kỹ thuật số để phân tích chi tiết.

3.2. Xử lý hình ảnh và phân tích thống kê

Xử lý hình ảnh sử dụng phần mềm chuyên dụng để đo lường mật độ huỳnh quang và diện tích xương. Các thông số hình thái học được trích xuất tự động từ các hình ảnh được chuẩn hóa. Phân tích thống kê giúp so sánh các nhóm cá và xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các dòng chuyển gen và cá đối chứng.

IV. Kết quả và ứng dụng của nghiên cứu khoáng hóa xương cá Medaka

Nghiên cứu tách dòng và đánh giá mức độ khoáng hóa xương trên cá Medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP đã thu được kết quả đáng kể. Bốn dòng cá c7, c9d1, d1 và d4d1 được tạo thành công với kiểu hình loãng xương rõ rệt. Sự biểu hiện huỳnh quang CFP tương quan với mức độ xương mỏng và lỗi xương, xác nhận vai trò của RANKL trong quá trình khoáng hóa. Các dòng cá này có thể được sử dụng làm mô hình cho kiểm tra thuốc và hoạt chất chống loãng xương. Ứng dụng của nghiên cứu này hỗ trợ phát triển thuốc mới và hiểu rõ cơ chế bệnh loãng xương, góp phần cải thiện sức khỏe con người.

4.1. Các dòng cá được tạo thành công và đặc điểm kiểu hình

Bốn dòng cá c7, c9d1, d1 và d4d1 được xác định chính xác là dòng dị hợp tử mang một đoạn chèn của gen chuyển rankl:HSE:CFP. Các dòng cá này biểu hiện kiểu hình loãng xương với mật độ xương thấp và tổn thương xương đặc trưng. Biểu hiện huỳnh quang CFP rõ ràng tại các vị trí có hoạt động RANKL cao, cho phép theo dõi trực tiếp quá trình khoáng hóa xương trong cơ thể sống.

4.2. Ứng dụng trong phát triển thuốc chống loãng xương

Mô hình cá Medaka chuyển gen này là công cụ quý giá cho nghiên cứu thuốc mới. Các chất chống loãng xương có thể được kiểm tra trên các dòng cá để đánh giá hiệu quả và an toàn sinh học. Quan sát trực tiếp sự biến đổi mức độ huỳnh quang CFP giúp đánh giá phản ứng của xương với can thiệp điều trị. Kết quả từ mô hình cá Medaka có thể dự đoán hiệu quả ở con người, tăng cơ hội thành công trong phát triển lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Loãng xƣơng là bệnh về xƣơng phổ biến, là hậu quả của sự rối loạn quá trình chuyển hóa xƣơng dẫn đến mất chất khoáng trong xƣơng, làm giảm mật độ xƣơng, suy thoái cấu trúc xƣơng, do đó tăng nguy cơ gãy xƣơng [5, 60]. Có nhiều nguyên nhân gây loãng xƣơng nhƣ: lối sống ít vận động, hút thuốc [15], uống nhiều bia rƣợu [26], lạm dụng thuốc có chứa corticoid [25, 83]… Tuy nhiên, nguyên nhân hay gặp nhất là sự giảm estrogen ở phụ nữ sau mãn kinh [27, 60]. Loãng xƣơng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng và bất lợi cho cuộc sống của ngƣời bệnh, gia đình và cộng đồng, thậm chí nó có thể gây tử vong [13, 76]. Số ngƣời mắc bệnh loãng xƣơng ngày càng tăng do dân số đang già hóa và lối sống công nghiệp [61], vì thế bệnh loãng xƣơng đang là vấn đề cho các xã hội hiện đại.

Bình thƣờng, mô xƣơng luôn đƣợc thay đổi, làm mới và duy trì sự phát triển cân bằng nhờ quá trình tái tạo xƣơng (bone remodeling) gồm hai hoạt động tƣơng tác chặt chẽ với nhau là hoạt động tạo xƣơng do tế bào tạo xƣơng thực hiện và hoạt động hủy xƣơng thực hiện bởi tế bào hủy xƣơng [31, 62]. Hoạt động hủy xƣơng lấn át hoạt động tạo xƣơng sẽ gây mất cân bằng nội mô xƣơng dẫn đến loãng xƣơng [68, 69]. Nhiều nghiên cứu về loãng xƣơng vẫn đang tập trung tìm hiểu các yếu tố và cơ chế liên quan tới chuyển hóa xƣơng, nhằm tìm ra thuốc và liệu pháp chữa trị bệnh hiệu quả hơn [28]. Các nghiên cứu này chủ yếu dùng động vật có vú làm mô hình thí nghiệm nhƣng việc sử dụng chúng còn có một số hạn chế [79].

Gần đây, cá medaka (Oryzias latipes) đã đƣợc chứng tỏ là mô hình tốt, có thể bổ sung cho các mô hình động vật có vú trong nghiên cứu về xƣơng [63-65, 75, 77, 78]. Hơn hết, nó có cơ chế sinh học phân tử và tế bào về xƣơng tƣơng tự nhƣ ở ngƣời [19, 64, 65, 75, 78] và những ƣu điểm của động vật mô hình mà động vật có vú không có [56, 86]. Đặc biệt, mô hình cá medaka cho phép dễ dàng biến đổi gen và ghi lại các quá trình sinh học in vivo sinh động bằng các kĩ thuật hình ảnh [64, 75, 78]. Đại học Quốc gia Singapo đã tạo ra cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP mang cấu trúc gen chuyển bao gồm một promoter cảm ứng nhiệt điều khiển hai chiều đồng thời gen rankl và gen mã hóa cho protein chỉ thị huỳnh quang CFP làm mô hình nghiên cứu bệnh loãng xƣơng.

Ấu trùng cá này khi bị sốc nhiệt biểu hiện Rankl ngoại sinh làm tế bào hủy xƣơng hình thành và hoạt động, gây ra sự phá hủy mô xƣơng đang đƣợc khoáng hóa tạo ra kiểu hình giống loãng xƣơng ở giai đoạn phát triển rất sớm [78]. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi muốn sử dụng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP nhận từ Đại học Quốc gia Singapo làm mô hình để sàng lọc hoạt chất chống loãng xƣơng. Tuy nhiên, do hạn chế của phƣơng pháp chuyển gen bằng kĩ thuật meganuclease và cách dòng cá này đƣợc duy trì (bằng cách nội phối qua nhiều thế hệ) nên các cá thể cá rankl:HSE:CFP ban đầu chúng tôi nhận đƣợc không có sự đồng đều về di truyền với gen chuyển rankl, dẫn đến các mức độ tổn thƣơng xƣơng khác nhau, gây khó khăn cho việc đánh giá tác dụng của hoạt chất. Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lai phân tách dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu thành một số dòng cá có sự đồng đều về di truyền với gen chuyển và đồng đều về mức độ tổn thƣơng xƣơng của các cá thể trong mỗi dòng.

Hơn nữa, để sử dụng đƣợc các dòng cá này cho nghiên cứu, chúng tôi cũng cần phải xây dựng đƣợc phƣơng pháp đánh giá mức độ khoáng hóa của ấu trùng cá để qua đó có thể đánh giá mức độ tổn thƣơng mô xƣơng của ấu trùng và tác dụng của hoạt chất, vì các phƣơng pháp xác định mật độ xƣơng trên ngƣời và động vật có vú không thể áp dụng trên ấu trùng cá với kích thƣớc nhỏ. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng và đánh giá mức độ khoáng hóa xƣơng của cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP” để hoàn thiện mô hình cá này sử dụng cho các nghiên cứu bệnh loãng xƣơng. 2 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. RANKL VÀ BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1.

Cân bằng nội mô xƣơng và quá trình tái tạo xƣơng Xƣơng là mô liên kết đƣợc chuyên hóa đặc biệt [20], nó gồm hai thành phần chính là thành phần vô cơ và hữu cơ [11]. Trong đó, phần vô cơ chủ yếu là hydroxyapatit chiếm khoảng 70% khối lƣợng xƣơng, giúp xƣơng cứng và rắn chắc. Phần hữu cơ chiếm khoảng 30% khối lƣợng xƣơng, gồm các tế bào xƣơng nhƣ: tế bào tạo xƣơng (osteoclasts), tế bào hủy xƣơng (osteoclasts), tế bào xƣơng (osteocytes) và collagen (chiếm 90%) làm cho xƣơng có tính đàn hồi, mềm dẻo [11, 14]. Do vậy, xƣơng vừa rắn chắc, vừa mềm dẻo, linh hoạt để có thể đảm nhận nhiều vai trò quan trọng: làm bộ khung cho cơ thể, nâng đỡ và bảo vệ các cơ quan bên trong; cùng với hệ cơ và gân tạo ra chuyển động của cơ thể; dự trữ canxi [ 20].

Xƣơng rất cứng chắc và có vẻ ít thay đổi nhƣng thực tế nó lại liên tục đƣợc sửa chữa và làm mới nhờ quá trình tái tạo xƣơng (bone remodeling) (Hình 1. Quá trình này gồm hai hoạt động hủy xƣơng và tạo xƣơng đƣợc thực hiện tƣơng ứng bởi tế bào hủy xƣơng và tế bào tạo xƣơng phối hợp chặt chẽ, tƣơng tác và điều khiển lẫn nhau giúp mô xƣơng đƣợc phát triển cân bằng [31, 62]. Tế bào tạo xƣơng có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi trung bì [12], nó tổng hợp và tiết ra thành phần hữu cơ của xƣơng (gọi là osteoid) trƣớc khi khoáng hóa osteoid bằng hydroxyapatit và các muối vô cơ để hoàn tất quá trình tạo xƣơng [12, 48]. Tế bào hủy xƣơng là tế bào đa nhân, kích thƣớc lớn và có cùng nguồn gốc với đại thực bào; nó đƣợc biệt hóa từ tế bào gốc tạo máu (hemopoietic stem cell) ở tủy xƣơng.

Nó có thể tạo ra môi trƣờng a-xít để hòa tan các thành phần vô cơ của xƣơng, sau đó tiết ra các enzyme phân giải osteoid [74, 82]. Quá trình tái tạo xƣơng bắt đầu bằng hoạt động hủy xƣơng của tế bào hủy xƣơng phá hủy phần xƣơng già, hỏng hay cần đƣợc thay thế, tiếp sau đó là hoạt 3 động của tế bào tạo xƣơng tạo xƣơng mới thay cho xƣơng đã bị phá hủy (Hình 1.1: Quá trình tái tạo xƣơng với 4 giai đoạn: hoạt hóa (activation), hủy xƣơng (resorption), trung gian (reversal), tạo xƣơng (bone formation) và khoáng hóa (mineralization) [21] Quá trình tái tạo xương được bắt đầu khi tế bào hủy xương (osteoclasts) được biệt hóa và hoạt động, loại bỏ xương già, hỏng. Sau đó, tế bào tạo xương tổng hợp các thành phần hữu cơ và vô cơ của xương thay thế phần xương đã được loại bỏ. Quá trình tái tạo xƣơng kéo dài suốt đời, giúp làm mới và sửa chữa xƣơng.

Để mô xƣơng phát triển ổn định, hoạt động hủy xƣơng và tạo xƣơng luôn phải cân bằng nhau, phù hợp với yêu cầu hoạt động và phát triển của cơ thể trong từng thời điểm. Nếu sự cân bằng này bị mất đi sẽ dẫn đến những rối loạn về xƣơng, trong đó có hai trƣờng hợp rất phổ biến là bệnh loãng xƣơng (osteoporosis) và xƣơng đá (osteopetrosis). Loãng xƣơng thƣờng xảy ra khi quá trình hủy xƣơng lấn át quá trình tạo xƣơng [60, 84], ngƣợc lại, khi tạo xƣơng nhiều hơn hủy xƣơng sẽ dẫn tới hiện tƣợng xƣơng đá [72, 77]. Bệnh loãng xƣơng Loãng xƣơng là bệnh về xƣơng rất phổ biến và đang trở thành mối quan tâm về vấn đề sức khỏe trên thế giới, đặc biệt khi dân số toàn cầu đang già hóa.

Đặc trƣng của bệnh là sự giảm mật độ và khối lƣợng của xƣơng, mất chất khoáng trong xƣơng, các vi cấu trúc xƣơng bị phá hủy, mô xƣơng bị tổn thƣơng dẫn tới tăng nguy cơ gãy xƣơng [5, 60]. Gãy xƣơng là hậu quả nghiêm trọng nhất của bệnh loãng xƣơng, gây đau đớn kéo dài làm ảnh hƣởng tới cuộc sống sinh hoạt bình thƣờng của bệnh nhân và thậm chí dẫn tới tử vong [13, 76]. Theo số liệu thống kê của tổ chức sức khỏe thế giới, năm 1994 có hơn 75 triệu ngƣời ở Mỹ, Nhật, Châu Âu bị loãng xƣơng [58]. Loãng xƣơng gây ra hơn 1,5 triệu trƣờng hợp gãy xƣơng mỗi năm, trong đó, 300 nghìn ca gãy xƣơng hông, 700 nghìn ca gãy xƣơng cột sống, 250 nghìn ca gãy xƣơng tay và 300 nghìn ca gãy xƣơng những vị trí khác [52].

Phụ nữ có nguy cơ mắc loãng xƣơng cao hơn nam giới, đặc biệt là phụ nữ lớn tuổi [ 38]. Ở Châu Âu, 40% phụ nữ mắc loãng xƣơng, trong khi nam giới là 13%, tỉ lệ mắc loãng xƣơng của những phụ nữ trên 50 tuổi so với nam giới là 2:1 [24]. Loãng xƣơng là một căn bệnh có diễn biến âm thầm, không gây triệu chứng đặc hiệu cho đến khi xƣơng bị gãy, do đó, nghiên cứu về liệu pháp điều trị bệnh này rất phức tạp và mất nhiều thời gian [22, 45, 59]. Hậu quả mà loãng xƣơng gây ra không chỉ dừng lại ở mức ảnh hƣởng tới cuộc sống sinh hoạt, đe dọa sức khỏe của bệnh nhân, tạo gánh nặng cho gia đình bệnh nhân và xã hội mà hơn thế nữa, điều trị loãng xƣơng không hề dễ dàng và cực kỳ tốn kém.

Theo thống kê, chi phí điều trị gãy xƣơng do loãng xƣơng mỗi năm ở nƣớc Anh khoảng 1,7 tỉ ơ-rô [88]; nƣớc Mỹ chi khoảng 20 tỉ đô-la [53]. Bệnh loãng xƣơng có thể là hậu quả của rất nhiều yếu tố: các sai hỏng về di truyền, lối sống thiếu lành mạnh (dinh dƣỡng không cân bằng, ít vận động, hút thuốc lá, lạm dụng đồ uống có cồn…), lạm dụng thuốc corticoid hay sự suy giảm hormon. Tuy nhiên, loãng xƣơng xảy ra phổ biến nhất là với phụ nữ sau mãn kinh, khi lƣợng hormon estrogen trong cơ thể suy giảm rõ rệt [27, 66]. RANKL kích thích sự hình thành, biệt hóa và hoạt động của tế bào hủy xƣơng Ở ngƣời và động vật có vú, RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor kappa-β ligand) là một protein đƣợc mã hóa bởi gen RANKL.

Protein này đƣợc sản xuất bởi tế bào tạo xƣơng và đóng vai trò nhƣ một chất truyền tin tế bào với nhiều đích tác động khác nhau. Một trong những tác động đã đƣợc biết đến rất rõ của protein này là nó kích thích quá trình hủy xƣơng (Hình 1. RANKL có thụ thể là RANK (Receptor Activator of Nuclear Factor kappa-β) nằm trên tiền tế bào hủy xƣơng.