Luận văn thạc sĩ về kháng thể đa dòng kháng B. anthracis tại Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu về việc tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B anthracis, góp phần vào y học.

• Tác giả: Nguyễn Thành Đạt
• Người hướng dẫn: GS. Đỗ Ngọc Liên
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B. anthracis
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn than)
• 1.2. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B.
• 1.3. Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than
• 1.4. BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định sự có mặt của vi khuẩn than
• 1.5. Đại cương về kháng thể
• 1.5.1. Kháng thể
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
• 2.2. Thiết bị nghiên cứu
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
• 2.3.2. Kỹ thuật ELISA
• 2.3.3. Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột
• 2.3.4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.3.5. Điện di protein trên gel polyacrylamid 12,5%
• 2.3.6. Kỹ thuật Western Blot
• 2.3.7. Phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trước khi gây đáp ứng miễn dịch
• 3.2. Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch
• 3.3. Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột
• 3.4. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng kỹ thuật tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch
• 3.5. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng phương pháp Western blot
• 3.6. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn B. subtilis trên que thử dạng sắc ký miễn dịch
• KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B. anthracis là một lĩnh vực quan trọng trong y học và công nghệ sinh học. Vi khuẩn B. anthracis, nguyên nhân gây bệnh than, có khả năng gây ra các bệnh lý nghiêm trọng cho con người và động vật. Việc phát triển kháng thể đa dòng giúp tăng cường khả năng phát hiện và điều trị bệnh. Kháng thể đa dòng có thể được sử dụng trong các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả, giúp phát hiện sớm sự có mặt của vi khuẩn này trong môi trường và trong cơ thể vật chủ.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn B. anthracis và bào tử

B. anthracis là vi khuẩn Gram dương, có khả năng hình thành bào tử, giúp nó tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Bào tử của vi khuẩn này có thể sống sót trong nhiều năm và là yếu tố chính gây bệnh. Đặc điểm này làm cho việc phát hiện và kiểm soát vi khuẩn trở nên khó khăn hơn.

1.2. Tầm quan trọng của kháng thể trong nghiên cứu

Kháng thể đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và điều trị bệnh. Chúng có khả năng nhận diện và liên kết với kháng nguyên, từ đó kích thích hệ miễn dịch. Nghiên cứu kháng thể đa dòng giúp phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả hơn cho bệnh than.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu kháng thể đa dòng

Mặc dù nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B. anthracis đã đạt được nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là khả năng phát hiện chính xác và nhanh chóng vi khuẩn trong môi trường. Các phương pháp hiện tại như PCR và ELISA thường mất nhiều thời gian và không phải lúc nào cũng cho kết quả chính xác. Do đó, cần phát triển các phương pháp mới, hiệu quả hơn để phát hiện vi khuẩn này.

2.1. Khó khăn trong việc phát hiện B. anthracis

Việc phát hiện B. anthracis trong môi trường và trong cơ thể vật chủ gặp nhiều khó khăn do tính chất của bào tử. Bào tử có thể tồn tại lâu dài và không hoạt động, làm cho việc phát hiện trở nên phức tạp.

2.2. Thách thức trong việc phát triển kháng thể hiệu quả

Phát triển kháng thể đa dòng hiệu quả đòi hỏi phải hiểu rõ cấu trúc và chức năng của các kháng nguyên trên bề mặt bào tử. Việc này cần nhiều nghiên cứu và thử nghiệm để đảm bảo kháng thể có khả năng nhận diện chính xác và mạnh mẽ.

III. Phương pháp nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B. anthracis thường sử dụng các phương pháp như gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELISA, và điện di protein. Những phương pháp này giúp xác định khả năng phản ứng của kháng thể với kháng nguyên và đánh giá hiệu quả của chúng trong việc phát hiện vi khuẩn.

3.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột

Phương pháp này bao gồm việc tiêm kháng nguyên vào chuột để kích thích hệ miễn dịch sản xuất kháng thể. Sau đó, huyết thanh được thu thập và phân tích để xác định sự hiện diện của kháng thể đa dòng.

3.2. Kỹ thuật ELISA trong nghiên cứu kháng thể

Kỹ thuật ELISA được sử dụng để phát hiện và định lượng kháng thể trong huyết thanh. Phương pháp này cho phép đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể với kháng nguyên B. anthracis một cách nhanh chóng và chính xác.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kháng thể đa dòng kháng B

Kháng thể đa dòng kháng B. anthracis có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học và công nghệ sinh học. Chúng có thể được sử dụng trong các bộ kit chẩn đoán nhanh, giúp phát hiện sớm sự có mặt của vi khuẩn trong môi trường và trong cơ thể. Ngoài ra, kháng thể cũng có thể được sử dụng trong nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh than.

4.1. Ứng dụng trong chẩn đoán nhanh

Kháng thể đa dòng có thể được sử dụng trong các bộ kit chẩn đoán nhanh, giúp phát hiện B. anthracis trong thời gian ngắn. Điều này rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

4.2. Tiềm năng trong phát triển vaccine

Kháng thể đa dòng cũng có thể được nghiên cứu để phát triển vaccine phòng bệnh than. Việc này giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho con người và động vật, giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu kháng thể đa dòng

Nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B. anthracis là một lĩnh vực đầy tiềm năng và cần được tiếp tục phát triển. Các phương pháp mới và công nghệ tiên tiến sẽ giúp cải thiện khả năng phát hiện và điều trị bệnh than. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu kháng thể

Nghiên cứu kháng thể đa dòng sẽ tiếp tục được mở rộng với sự phát triển của công nghệ sinh học. Các phương pháp mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và điều trị bệnh.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất kháng thể và phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao khả năng kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Vi khuẩn Bacillus anthracis (B. anthracis) là tác nhân gây bệnh than, có khả năng tồn tại lâu dài dưới dạng bào tử trong môi trường khắc nghiệt, chịu nhiệt độ lên đến 160°C trong 5 phút và nước sôi trong 10 phút. Bệnh than có thể lây nhiễm qua da, đường tiêu hóa và đường hô hấp, với tỷ lệ tử vong cao khi nhiễm qua đường hô hấp. Việc phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn này là rất cần thiết, đặc biệt trong bối cảnh vi khuẩn than có thể được sử dụng làm vũ khí sinh học. Hiện nay, các phương pháp phát hiện phổ biến tại Việt Nam như PCR và ELISA tuy chính xác nhưng mất nhiều thời gian, trong khi các test nhanh dạng sắc ký miễn dịch thương mại có giá thành cao và thời gian nhập khẩu lâu.

Luận văn tập trung nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis, cụ thể là protein BclA – một glycoprotein đặc trưng trên lớp lông ngoài cùng của vỏ bào tử. Mục tiêu chính là tạo kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp và kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể này với protein BclA tự nhiên trên vỏ bào tử vi khuẩn than. Nghiên cứu được thực hiện trên chuột chủng Swiss Mus musculus, với quy trình gây miễn dịch và kiểm tra đáp ứng miễn dịch trong khoảng thời gian 4-5 tuần. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các công cụ phát hiện nhanh, chính xác và chi phí hợp lý cho vi khuẩn than, góp phần nâng cao năng lực phòng chống dịch bệnh và an ninh sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết miễn dịch học về kháng thể và kháng nguyên, đặc biệt tập trung vào:

• Kháng thể đa dòng (Polyclonal antibodies): Là tập hợp các kháng thể nhận diện nhiều epitope khác nhau trên cùng một kháng nguyên, được tạo ra bằng cách tiêm kháng nguyên vào động vật và thu huyết thanh chứa kháng thể.
• Protein BclA: Glycoprotein đặc hiệu trên lớp lông của vỏ bào tử B. anthracis, có cấu trúc xoắn ba, chứa các vùng lặp lại glycine-proline-threonine (GPT), đóng vai trò quan trọng trong nhận diện miễn dịch.
• Phương pháp ELISA và Western blot: Kỹ thuật sinh học phân tử dùng để phát hiện và định lượng kháng thể hoặc kháng nguyên dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể.
• Sắc ký miễn dịch dạng que thử nhanh: Phương pháp phát hiện nhanh dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên, sử dụng hạt vàng nano làm chất chỉ thị.

Các khái niệm chính bao gồm: domain hằng định và biến thiên của kháng thể, tá dược Freund trong gây miễn dịch, kỹ thuật tinh sạch IgG bằng cột sắc ký ái lực Protein G, và nguyên lý tạo kháng thể đa dòng.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Protein BclA tái tổ hợp được tinh sạch từ cột Talon (Niken), chuột Swiss Mus musculus làm vật chủ gây miễn dịch, và các chủng vi khuẩn B. anthracis, B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis để lấy dịch phá vỏ bào tử.
• Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch: Tiêm dưới da chuột với kháng nguyên BclA tái tổ hợp phối hợp tá dược Freund (toàn phần lần đầu, không toàn phần lần nhắc lại), liều 50-100 µg/lần, tiêm nhắc lại sau 2-3 tuần.
• Phân tích đáp ứng miễn dịch: Thu huyết thanh chuột theo từng tuần, định lượng IgG bằng ELISA, kiểm tra khả năng nhận diện kháng nguyên bằng que thử sắc ký miễn dịch và Western blot.
• Tinh sạch kháng thể: Sử dụng cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP để tách IgG từ huyết thanh, xác định độ tinh sạch bằng SDS-PAGE.
• Kiểm tra phản ứng chéo: Đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn khác để xác định tính đặc hiệu.
• Timeline nghiên cứu: Quá trình gây miễn dịch và thu mẫu kéo dài khoảng 5 tuần, các bước phân tích và kiểm tra thực hiện song song và tiếp nối.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Độ tinh sạch protein BclA tái tổ hợp: Qua điện di SDS-PAGE, protein BclA tinh sạch có trọng lượng khoảng 35 kDa, xuất hiện băng duy nhất rõ rệt, đảm bảo chất lượng kháng nguyên cho gây miễn dịch.

2. Khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột: ELISA cho thấy nồng độ IgG trong huyết thanh chuột tăng dần theo tuần, đặc biệt tăng mạnh sau lần tiêm nhắc lại với tá dược không toàn phần, đạt mức ổn định từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 5.

3. Kháng thể đa dòng nhận diện đặc hiệu protein BclA: Que thử sắc ký miễn dịch cho thấy kháng thể đa dòng trong huyết thanh chuột có khả năng nhận diện protein BclA tái tổ hợp và protein BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. anthracis, thể hiện qua vạch màu hồng rõ ràng tại vị trí kháng nguyên.

4. Tính đặc hiệu của kháng thể: Kháng thể đa dòng không phản ứng chéo với các protein khác như BSA, và không nhận diện dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn không có protein BclA như B. subtilis, chứng tỏ tính đặc hiệu cao.

5. Tinh sạch kháng thể đa dòng: Sau tinh sạch bằng cột Protein G, kháng thể thu được có hai băng protein đặc trưng chuỗi nặng (53 kDa) và chuỗi nhẹ (25 kDa), nồng độ đạt khoảng 1 mg/ml, đảm bảo cho các ứng dụng tiếp theo.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy việc sử dụng protein BclA tái tổ hợp làm kháng nguyên để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột là hiệu quả, tạo ra kháng thể đa dòng đặc hiệu với protein BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. anthracis. Sự tăng nồng độ IgG sau tiêm nhắc lại phù hợp với cơ chế miễn dịch học, khi lần tiêm đầu tiên kích thích sản xuất IgM và IgG thấp, các lần sau tăng cường IgG đặc hiệu.

Kháng thể đa dòng thu được có tính đặc hiệu cao, không phản ứng chéo với các protein khác, điều này được minh chứng qua que thử sắc ký miễn dịch và Western blot. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu miễn dịch học khác về kháng thể đa dòng kháng protein đặc hiệu trên bào tử vi khuẩn.

Việc tinh sạch kháng thể bằng cột Protein G giúp loại bỏ các protein không mong muốn, nâng cao độ tinh khiết và hiệu quả sử dụng trong các kỹ thuật miễn dịch. Các phương pháp phân tích như ELISA, Western blot và que thử sắc ký miễn dịch được sử dụng đồng bộ giúp đánh giá toàn diện chất lượng và đặc tính của kháng thể.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ ELISA thể hiện sự tăng nồng độ IgG theo tuần, hình ảnh gel SDS-PAGE minh họa độ tinh sạch protein và kháng thể, cùng hình ảnh que thử sắc ký miễn dịch thể hiện kết quả nhận diện kháng nguyên.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển bộ kit test nhanh dựa trên kháng thể đa dòng kháng BclA: Sử dụng kháng thể đa dòng tinh sạch để chế tạo que thử sắc ký miễn dịch, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn than trong môi trường và mẫu bệnh phẩm, giảm thời gian chẩn đoán từ ngày xuống còn vài phút. Thời gian thực hiện: 12-18 tháng. Chủ thể thực hiện: Viện Kỹ thuật Hóa sinh và các đơn vị nghiên cứu liên quan.

2. Mở rộng nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng: Dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp BclA, phát triển kháng thể đơn dòng có độ đặc hiệu và ái lực cao hơn, phục vụ cho các ứng dụng chẩn đoán và điều trị. Thời gian: 18-24 tháng. Chủ thể: Viện nghiên cứu miễn dịch và công nghệ sinh học.

3. Đánh giá khả năng ứng dụng kháng thể trong các phương pháp chẩn đoán hiện đại: Kết hợp kháng thể đa dòng với kỹ thuật PCR, ELISA để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu, đồng thời giảm chi phí và thời gian xét nghiệm. Thời gian: 6-12 tháng. Chủ thể: Các phòng thí nghiệm y sinh và bệnh viện.

4. Nghiên cứu mở rộng tính đặc hiệu của kháng thể với các chủng vi khuẩn khác: Kiểm tra phản ứng chéo với các chủng Bacillus khác và các vi sinh vật liên quan để đảm bảo tính an toàn và chính xác trong ứng dụng thực tế. Thời gian: 6 tháng. Chủ thể: Trung tâm kiểm nghiệm vi sinh vật.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học phân tử, Miễn dịch học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật tạo kháng thể đa dòng, phương pháp tinh sạch và ứng dụng trong phát hiện vi khuẩn than, hỗ trợ nghiên cứu và học tập.

2. Chuyên gia phát triển sản phẩm sinh học và kit chẩn đoán: Thông tin về protein BclA và quy trình tạo kháng thể đa dòng giúp phát triển các sản phẩm test nhanh, nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

3. Cơ quan y tế và phòng chống dịch bệnh: Kết quả nghiên cứu hỗ trợ xây dựng các công cụ phát hiện nhanh vi khuẩn than, góp phần nâng cao năng lực giám sát và phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm.

4. Đơn vị an ninh sinh học và phòng chống vũ khí sinh học: Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát hiện sớm và kiểm soát các tác nhân sinh học nguy hiểm, phục vụ công tác an ninh quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng thể đa dòng khác gì so với kháng thể đơn dòng?
   Kháng thể đa dòng là tập hợp các kháng thể nhận diện nhiều epitope khác nhau trên cùng một kháng nguyên, trong khi kháng thể đơn dòng chỉ nhận diện một epitope duy nhất. Kháng thể đa dòng dễ tạo và có khả năng nhận diện rộng hơn, phù hợp cho các ứng dụng phát hiện tổng quát.

2. Tại sao chọn protein BclA làm kháng nguyên?
   BclA là glycoprotein đặc hiệu trên lớp lông của vỏ bào tử B. anthracis, có tính đặc hiệu cao và là mục tiêu lý tưởng để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn than. Protein này cũng có cấu trúc ổn định và dễ tái tổ hợp.

3. Phương pháp ELISA được sử dụng để làm gì trong nghiên cứu này?
   ELISA được dùng để định lượng nồng độ kháng thể IgG trong huyết thanh chuột sau khi gây miễn dịch, giúp đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch và thời điểm thu mẫu huyết thanh phù hợp.

4. Kháng thể đa dòng có thể phản ứng chéo với các vi khuẩn khác không?
   Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng thể đa dòng kháng BclA không phản ứng chéo với các protein của các chủng Bacillus không có BclA như B. subtilis, chứng tỏ tính đặc hiệu cao và ít khả năng phản ứng chéo.

5. Que thử sắc ký miễn dịch hoạt động như thế nào?
   Que thử sử dụng kháng thể đa dòng gắn hạt vàng nano để nhận diện kháng nguyên đặc hiệu. Khi mẫu chứa kháng nguyên đi qua que, kháng thể gắn hạt vàng sẽ liên kết và tạo vạch màu hồng dễ quan sát, cho kết quả nhanh chóng trong vòng 5 phút.

Kết luận

• Đã thành công trong việc tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột Swiss Mus musculus với nồng độ IgG tăng rõ rệt sau tiêm nhắc lại.
• Kháng thể đa dòng thu được có độ tinh sạch cao, đặc hiệu nhận diện protein BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. anthracis, không phản ứng chéo với các chủng vi khuẩn khác.
• Phương pháp ELISA, Western blot và que thử sắc ký miễn dịch được áp dụng hiệu quả để đánh giá chất lượng và đặc tính kháng thể.
• Kết quả nghiên cứu mở ra hướng phát triển các bộ kit test nhanh, chi phí thấp, thời gian phản ứng nhanh phục vụ phát hiện vi khuẩn than.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu phát triển kháng thể đơn dòng và ứng dụng trong các kỹ thuật chẩn đoán hiện đại, đồng thời mở rộng đánh giá tính đặc hiệu và an toàn trong thực tế.

Triển khai nghiên cứu phát triển bộ kit test nhanh dựa trên kháng thể đa dòng, phối hợp với các đơn vị y tế và an ninh sinh học để ứng dụng thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi khuẩn gây bệnh.

Koch đã nuôi vi khuẩn này dưới dạng chủng thuần khiết, chứng minh được khả năng hình thành bào tử của nó và gây được bệnh than thực nghiệm bằng cách cấy nó vào cơ thể động vật. Vi khuẩn than thuộc loài Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus là các trực khuẩn Gram dương, có bào tử, kỵ khí tuỳ tiện. Các vi khuẩn này gồm nhiều loài, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (B.

cereus), một số có lợi cho con người (B. anthracis có đặc điểm khác biệt với 3 loài trực khuẩn hiếu khí có bào tử trên là ở tính có độc lực của nó. anthracis có plasmids pXO1; pXO2 và plasmid mã hoá capsule, vỏ chỉ hình thành trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, hoặc được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng 0,7% Natri bicarbonat, ở nhiệt độ 37C trong điều kiện giàu CO2 (20%). Ở điều kiện ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn hình thành bào tử, nằm giữa thân và không làm thay đổi hình thể vi khuẩn.

Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt vi khuẩn có vỏ. Trong môi trường lỏng vi khuẩn không di động. anthracis Bào tử vi khuẩn B. anthracis 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Khuẩn lạc có kích thước lớn, đường kính 0,3 - 0,5 cm.

Màu khuẩn lạc trắng đến trắng ghi. Bề mặt khuẩn lạc ướt, hơi dính, không gây tan huyết trên thạch máu cừu (nhưng trên thạch máu thỏ có thể gây tan huyết). Trong các chương trình về vũ khí sinh học (VKSH) vi khuẩn gây bệnh than B. anthracis được coi là tác nhân sinh học thường đựơc chú ý quan tâm nhiều nhất vì trực khuẩn than có thể tồn tại trong thiên nhiên dưới dạng nha bào (bào tử) trong thời gian hơn 10 năm, có khả năng chịu nhiệt 160 độ C trong vòng 5 phút, chịu nước sôi đến 10 phút.

Người bị nhiễm bệnh than qua 3 con đường: qua da, đường tiêu hoá và đường thở. Bào tử than khi bị hít thở qua mũi chúng có khả năng vào tới các phế nang để gây bệnh than thể hô hấp và cư trú ở các phế bào của phế nang, qua hệ thống mạch bạch huyết chuyển tới hạch lympho của trung thất. Tại đó các vi khuẩn gây bệnh than này sinh trưởng và xâm nhập theo đường máu gây nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn nhiều nơi trong cơ thể, gây tỷ lệ tử vong rất cao [3]. Độc tố của vi khuẩn than có sự tham gia của 3 yếu tố cấu thành: kháng nguyên bảo vệ (Protective Antigen-PA), giúp hai cấu tử khác là yếu tố gây phù nề (Edema Factor -EF) và yếu tố gây chết (Lethal Factor -LF) xâm nhập được vào tế bào của vật chủ và gây độc.

Về bản chất đây là 3 peptid do bản thân vi khuẩn sinh ra. Yếu tố gây phù nề làm bất hoạt tế bào bạch cầu trung tính của vật chủ làm cho các tế bào này không có khả năng thực bào để tiêu diệt vi khuẩn. Các nhà nghiên cứu cho rằng yếu tố gây chết của vi khuẩn than kích thích các đại thực bào sản sinh TNF-alpha và interleukin-1-beta (cả hai yếu tố này là thành phần của hệ miễn dịch có tác dụng trong phản ứng viêm và sốc phản vệ) và yếu tố này có thể gây chết vật chủ. Đây cũng là yếu tố khác biệt chủ yếu của B.

anthracis so với các chủng tương tự như B. cereus…[9,10] 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 1: Nguyên lý gây bệnh than của vi khuẩn B. anthracis [3 ] Trước đây việc chẩn đoán xác định B. anthracis trong phòng thí nghiệm chủ yếu dựa vào việc phát hiện hình thái học và đặc điểm sinh học.

Các kỹ thuật DNA gần đây đáp ứng được yêu cầu phát hiện chính xác, cho phép phân biệt B. anthracis với các loại trực khuẩn khác trong “nhóm B.Đó là dựa vào sự có mặt của hai plasmids lớn (pXO1; pXO2) của trực khuẩn than chứa gen độc lực. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B. Bào tử vi khuẩn B.

anthracis được hình thành trong môi trường thiếu các chất dinh dưỡng thiết yếu. Trong quá trình hình thành này sẽ có một sự phân chia không đối xứng của tế bào sinh dưỡng tạo ra một phần lớn và một phần nhỏ tương ứng là tế bào mẹ (mother cell) và tiền bào tử (forespore). Các tế bào mẹ sau đó bao lấy phần tiền bào tử, các lớp của bào tử dần được hình thành. Do đó bào tử của B.

anthracis bao gồm các lớp chính sau: lõi (spore core), vỏ lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium). Cuối cùng tế bào mẹ phân giải tạo nên các bào tử trưởng thành, các bào tử này không hoạt động nhưng có khả năng sống sót trong môi trường khắc nghiệt qua nhiều năm [10]. 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 2: Quá trình hình thành bào tử vi khuẩn than B. subtilis , lớp áo (coat) là lớp ngoài cùng của bào tử thì ở vi khuẩn B.

cereus có vỏ bào tử là lớp ngoài cùng. Cả áo bào tử và vỏ bào tử đều có cấu trúc linh hoạt, khả năng đàn hồi tốt. Mặt khác trên áo và vỏ bào tử tập trung một số enzyme có tác dụng bảo vệ. Hình 3: Cấu tạo bào tử quan sát dưới kính hiển vi điện tử [3,5 ] 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Ở hình 3a, là cấu tạo bào tử của vi khuẩn B.

subtilis , có lớp ngoài cùng là áo bào tử (Oc: outer coat layer). Ở lớp này tập trung chủ yếu các protein (chiếm khoảng 30% protein bào tử). Ước tính có khoảng 70 protein trên lớp áo bào tử, phần lớn các protein này là đặc hiệu cho chủng B. subtilis , người ta thường dựa vào các protein đó để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn này.

Khác với vi khuẩn B. subtilis có lớp áo bào tử dày với lớp bên trong sáng và lớp bên ngoài tối, vi khuẩn than có áo bào tử mỏng. Lớp này được phân cách với lớp ngoài cùng bởi khoảng giữa (Is: interspace). Đối với các chủng B.

mycoides và một số thuộc nhóm Clostridia thì lớp ngoài cùng là vỏ bào tử. Hình 3b và hình 4 mô tả cấu tạo bào tử của vi khuẩn than. Hình 4: Cấu tạo các lớp của bào tử vi khuẩn than [3,5] Cấu tạo lớp ngoài cùng của bào tử gồm 2 lớp sau: lớp cơ bản (Bl: basal layer) và một phần bên ngoài giống như các sợi lông (Hn: hair-like nap). Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử và dùng nhiễu xạ X-quang, người ta thấy lớp cơ bản dày khoảng 190A0 được hình thành từ các lớp mỏng hơn.

Lớp cơ bản gồm 4 tấm kết tinh, mỗi tấm có cấu trúc lỗ có hình lục giác. anthracis thì lớp cơ bản dày khoảng 20- 30nm. Phần lông bao quanh bên ngoài là một glycoprotein gọi là BclA (Bacillus collagen-like protein of anthracis). Phần cấu trúc của BclA sẽ được mô tả cụ thể ở phần 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học sau.

Vỏ bào tử chiếm khoảng 2% khối lượng của bào tử và có khoảng 50% protein, 20% lipid , 20% polysaccharides trung tính, và 10% là các thành phần khác. Chức năng chính của vỏ bào tử là chống lại các tác nhân môi trường, do bề mặt kỵ nước nên làm tăng khả năng kết dính của bào tử. Mặt khác trên vỏ bào tử chứa một số enzyme có chức năng hoạt hoá sự hoạt động của bào tử. Vỏ bào tử cũng chính là điểm đầu tiên để bào tử tương tác với tế bào vật chủ của hệ thống miễn dịch [8].

Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than Các protein trên vỏ bào tử B. anthracis là đối tượng thường được sử dụng để phát hiện sự có của vi khuẩn than. Theo thống kê của một số tài liệu [14] thì có khoảng gần 20 protein có mặt trên vỏ bào tử của vi khuẩn này. Có thể kể đến một số protein sau: BclA, Alanine racemase (Alr), Inosine hydrolase (InH), Protein ExsF, Protein CotY, Protein Cot E, Protein Cot H, Protein ExsY, Protein CotB, Protein giả thuyết ExsK, Protein BxpB, Protein BclA, Protein BxpA.

Các protein nhóm D là các enzyme. Các enzyme này có vai trò trong việc bảo vệ bào tử khỏi phản ứng ôxy hoá đồng thời ngăn chặn sự nảy mầm sớm. Người ta đã chứng minh được rằng những enzyme kể trên xuất hiện ở giai đoạn trưởng thành của vỏ bào tử vi khuẩn. Alr chuyển hoá L-alanine thành D-alanine (một chất ức chế sự nảy mầm), InH sẽ phân huỷ inosine ngăn cản quá trình nảy mầm bằng cách giảm tối thiểu lượng inosine [14].

Các protein nhóm E như ExsY, CotY, CotB. Những protein này có thể được đính ở lớp cơ bản hoặc lớp ngoài của áo bào tử. Chúng tham gia trong quá trình lắp ráp của vỏ bào tử. Nhóm các protein bào tử bao gồm các protein có cùng nguồn gốc với các protein của các protein của B.

subtilis có vai trò gắn với lớp áo (coat) hoặc các thành phần phía ngoài áo. 9 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 5: Các protein trên vỏ bào tử của một vài loại vi khuẩn [ 14 ] 10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Protein nhóm F như BclA, ExsB, ExsC, ExsD,BxpB,. là các protein có trọng lượng phân tử cao. Có thể kể đến những đặc điểm cơ bản của một số protein thuộc nhóm này.

BxpB được tìm thấy ở lớp cơ bản nhờ đánh dấu miễn dịch huỳnh quang bằng vàng. Protein này tạo phức liên kết hoá trị mạnh với BclA, các protein khác ở lớp cơ bản và lớp lông bên ngoài gồm ExsY và CotY. Khi BxpB được tách chiết từ bào tử bằng SDS, nó được tách ở cả dạng đơn phân và dạng phức hệ khối lượng phân tử lớn với BclA. BxpB bị đột biến không có khả năng bám với lông bên ngoài, mặc dù BclA vẫn được tổng hợp bình thường.

Thiếu BxpB dẫn đến bào tử nảy mầm nhanh hơn. Một nhóm các protein, như BxpA, BxpB (còn gọi ExsFA), BxpC, ExsC. chỉ được tìm thấy ở các vi sinh vật thuộc B. Điều này cho thấy vỏ bào tử ở các sinh vật khác được gắn với lớp cơ bản bằng một nhóm các protein khác.

Protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn mang tính đặc hiệu thường được dùng như maker chỉ thị sự có mặt của vi khuẩn đó [14].