Luận án tiến sĩ về kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis tại Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện kháng nguyên vp28 từ bacillus subtilis, phục vụ chống virus gây bệnh đốm trắng ở tôm.

• Tác giả: Phạm Kiên Cường
• Người hướng dẫn: GS. Phan Tuấn Nghĩa
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis cho tôm
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis cho tôm

Nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis cho tôm là một lĩnh vực quan trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) đã gây ra thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm ở Việt Nam. Việc tìm hiểu và phát triển các phương pháp phòng ngừa, đặc biệt là thông qua việc sử dụng kháng nguyên VP28, là cần thiết để bảo vệ tôm khỏi dịch bệnh này. Bacillus subtilis, một loại vi khuẩn có khả năng tạo bào tử, được xem là một ứng viên tiềm năng trong việc phát triển vaccine phòng bệnh cho tôm.

1.1. Khái niệm về kháng nguyên VP28 và vai trò của nó

Kháng nguyên VP28 là một protein vỏ chính của virus WSSV, có vai trò quan trọng trong việc gắn kết virus với tế bào tôm. Nghiên cứu cho thấy VP28 có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của tôm, giúp tăng cường khả năng phòng ngừa bệnh. Việc nhân dòng và biểu hiện VP28 trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis có thể tạo ra một loại vaccine hiệu quả cho tôm.

1.2. Tầm quan trọng của Bacillus subtilis trong nghiên cứu

Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn gram dương, có khả năng tạo bào tử và chịu được điều kiện môi trường khắc nghiệt. Việc sử dụng Bacillus subtilis để biểu hiện kháng nguyên VP28 không chỉ giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho tôm mà còn tạo ra một sản phẩm probiotic bền nhiệt, có thể sử dụng trong thực tiễn nuôi trồng thủy sản.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu kháng nguyên VP28

Mặc dù nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis đã đạt được nhiều tiến bộ, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là việc hiểu rõ cơ chế lây nhiễm của virus WSSV và cách thức mà tôm phản ứng với virus này. Ngoài ra, việc phát triển vaccine hiệu quả vẫn đang gặp khó khăn do sự đa dạng của các chủng virus.

2.1. Khó khăn trong việc phát triển vaccine hiệu quả

Việc phát triển vaccine phòng bệnh đốm trắng cho tôm gặp nhiều khó khăn do sự biến đổi gen của virus WSSV. Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng vaccine dựa trên kháng nguyên VP28 vẫn chưa đạt được hiệu quả cao trong thực tiễn. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất vaccine.

2.2. Thách thức trong việc ứng dụng thực tiễn

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về kháng nguyên VP28, nhưng việc ứng dụng các sản phẩm này vào thực tiễn nuôi trồng thủy sản vẫn còn hạn chế. Cần có sự hợp tác chặt chẽ giữa các nhà nghiên cứu và nông dân để đảm bảo rằng các sản phẩm được phát triển có thể được áp dụng hiệu quả trong thực tế.

III. Phương pháp nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis

Nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nhân dòng gen, biểu hiện protein và thử nghiệm khả năng phòng bệnh. Các phương pháp này giúp xác định hiệu quả của kháng nguyên VP28 trong việc kích thích hệ thống miễn dịch của tôm.

3.1. Nhân dòng và xác định trình tự gen VP28

Quá trình nhân dòng gen VP28 được thực hiện bằng phương pháp PCR, giúp tạo ra các đoạn gen cần thiết cho việc biểu hiện. Việc xác định trình tự gen VP28 từ các mẫu WSSV thu nhận ở Việt Nam cũng là một bước quan trọng trong nghiên cứu này.

3.2. Biểu hiện kháng nguyên VP28 trên bề mặt bào tử

Sau khi nhân dòng, gen VP28 được đưa vào hệ thống biểu hiện trong Bacillus subtilis. Việc biểu hiện kháng nguyên trên bề mặt bào tử giúp tăng cường khả năng kích thích miễn dịch cho tôm, đồng thời tạo ra một sản phẩm probiotic có thể sử dụng trong thực tiễn.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu kháng nguyên VP28

Kết quả nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis đã cho thấy nhiều triển vọng trong việc phát triển vaccine phòng bệnh đốm trắng cho tôm. Các thử nghiệm cho thấy bào tử Bacillus subtilis biểu hiện VP28 có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của tôm, giúp tăng cường khả năng phòng ngừa bệnh.

4.1. Kết quả thử nghiệm khả năng phòng bệnh

Các thử nghiệm trên tôm thẻ chân trắng cho thấy bào tử Bacillus subtilis biểu hiện VP28 có khả năng bảo vệ tôm khỏi nhiễm virus WSSV với tỷ lệ bảo hộ trên 70%. Kết quả này cho thấy tiềm năng của sản phẩm trong việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất vaccine

Kết quả nghiên cứu là cơ sở để phát triển các chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp, có khả năng tăng cường miễn dịch cho tôm. Điều này không chỉ giúp bảo vệ tôm khỏi bệnh đốm trắng mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển vaccine phòng bệnh do các vi sinh vật khác gây ra.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu kháng nguyên VP28

Nghiên cứu kháng nguyên VP28 từ Bacillus subtilis cho tôm đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển vaccine phòng bệnh đốm trắng. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng thực tiễn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại những giải pháp hiệu quả hơn trong việc kiểm soát dịch bệnh cho ngành nuôi trồng thủy sản.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất vaccine và đánh giá hiệu quả của sản phẩm trong điều kiện thực tế. Cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và nông dân để đảm bảo rằng các sản phẩm được phát triển có thể được áp dụng hiệu quả trong thực tế.

5.2. Tiềm năng phát triển vaccine mới

Nghiên cứu kháng nguyên VP28 không chỉ dừng lại ở việc phát triển vaccine phòng bệnh đốm trắng mà còn mở ra tiềm năng cho việc phát triển các vaccine mới cho các bệnh khác ở tôm. Điều này sẽ góp phần quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nuôi tôm ở Việt Nam đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành một ngành kinh tế quan trọng. Diện tích nuôi tôm cả nƣớc tăng từ 324,1 hecta năm 2000 lên đến 652.612 hecta vào cuối năm 2013. Chỉ tính 6 tháng đầu năm 2014 cả nƣớc đã thả nuôi 638.422,7 hecta với sản lƣợng thu hoạch đạt 258.730 tấn trong đó tôm sú là 113.309 tấn và tôm thẻ chân trắng là 149.507 tấn, đạt giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD, tăng 54,7% so với cùng kỳ năm 2013.

Tuy nhiên, ngành nuôi trồng tôm thƣờng xuyên gặp khó khăn về việc kiểm soát các dịch bệnh, trong đó virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus - WSSV) là một trong những tác nhân gây bệnh chính ở tôm. Tôm mỗi khi bị nhiễm WSSV thì gần nhƣ 100% bị chết sau đó một đến vài tuần. Bệnh đốm trắng có tỷ lệ lây lan nhanh, cho nên khó có thể lƣờng hết các thiệt hại mỗi khi có dịch. Năm 2013, dịch bệnh đốm trắng trên tôm đã xuất hiện tại 280 xã của 94 huyện thuộc 28 tỉnh, thành phố trong phạm vi cả nƣớc.

Tổng diện tích nuôi bị bệnh là 12. Theo báo cáo của Cục Thú y, từ đầu năm 2014 đến 20/7/2014, thiệt hại về nuôi trồng thủy sản là rất lớn, khoảng 25.000 ha diện tích nuôi tôm bị thiệt hại tại 232 xã, của 60 huyện trực thuộc 19 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ƣơng. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đƣợc tiến hành để tìm ra giải pháp chống lại WSSV nhƣng kết quả thu đƣợc còn hạn chế, phần lớn là do chƣa hiểu biết rõ về cơ chế lây nhiễm, nhân lên của virus trong tôm và hệ thống đáp ứng miễn dịch của tôm chống lại virus này. Một hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới hƣớng đến là tạo các vaccine dựa trên protein cấu trúc kháng nguyên vỏ của WSSV nhƣ các protein VP28, VP26 của WSSV để kích thích đáp ứng miễn dịch ở tôm chống lại bệnh đốm trắng.

VP28 là một loại protein vỏ chính của WSSV đƣợc mã hóa bởi gen wsv421 và có khối lƣợng phân tử khoảng 27,5 kDa, đóng vai trò chủ đạo giúp virus gắn đặc hiệu lên tế bào tôm, là bƣớc khởi đầu cho quá trình lây nhiễm. Chính vì vậy, VP28 là protein đƣợc lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đoán WSSV cũng nhƣ tạo vaccine cho tôm phòng bệnh đốm trắng. Tuy nhiên, những kết 11 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] quả nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm trắng do WSSV cũng chỉ mới dừng lại ở mức thử nghiệm nhỏ lẻ, chƣa tạo đƣợc một vaccine chính thức, hiệu quả. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” để tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh virus đốm trắng trên tôm.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Nhân dòng, xác định đƣợc trình tự và một số đặc trƣng của gen VP28 từ các mẫu WSSV thu nhận đƣợc ở các địa bàn nuôi tôm chủ yếu của Việt Nam. - Tạo đƣợc chủng B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử. - Bƣớc đầu đánh giá đƣợc khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng của bào tử B.

subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa protein VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm. Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Nhân dòng, xác định trình tự và một số đặc trƣng của gen vp28 từ các mẫu WSSV thu nhận đƣợc ở Việt Nam - Nghiên cứu biểu hiện gen vp28 trên bề mặt bào tử B. subtilis - Nghiên cứu thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng khi cho tôm ăn thức ăn trộn bào tử B.

subtilis biểu hiện VP28. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Phần thử nghiệm khả năng bảo hộ tôm thẻ chân trắng phòng bệnh virus đốm trắng đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein với sự hỗ trợ, hợp tác của Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I. 12 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Đóng góp mới của đề tài - Đã xác định trình tự và một số đặc trƣng của gen vp28 từ các mẫu WSSV thu nhận đƣợc ở Việt Nam và phát hiện ra 5 sự sai khác về nucleotide (A125G, A183G, A226G, A403G, T517C) so với trình tự gen đã công bố (AY168644). Trong số các sai khác về nucleotide, có 4 sai khác dẫn đến sự sai khác về acid amin. - Đã tạo đƣợc chế phẩm bào tử B. subtilis tái tổ hợp với sự biểu hiện gen mã hóa protein VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử B.

subtilis dƣới dạng các cấu trúc protein dung hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, trong đó, CotB là protein vỏ của B. subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhằm hạn chế cản trở không gian đối với VP28. - Đã tối ƣu đƣợc điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B. subtilis biểu hiện tốt kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử và nghiên cứu các tính chất của bào tử tái tổ hợp B.

subtilis CotB-GST-VP28 trong một số điều kiện môi trƣờng khác nhau. - Đã đánh giá đƣợc sƣ̣ tăng ho ạt độ của các enzyme phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD) có liên quan đến đáp ƣ́ng miễn dịch của tôm và đánh giá khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắ ng với mƣ́c bảo hô ̣ trên 70% của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt. Ứng dụng thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử B.

subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu hiện VP28 trên bền mặt, có khả năng tăng cƣờng miễn dịch và bảo vệ tôm khỏi nhiễm bệnh đốm trắng, giúp góp phần kiểm soát dịch bệnh trên tôm. - Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các vaccine tái tổ hợp dạng bào tử B. subtilis tái tổ hợp có khả năng phòng bệnh do các vi sinh vật khác gây ra ở tôm. 13 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM 1. Vị trí phân loại của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm Dịch bệnh đốm trắng bùng phát đƣợc công bố đầu tiên tại trang trại nuôi tôm P. japonicus ở Nhật Bản vào năm 1993 [41, 71].

Sau đó, có nhiều báo cáo về sự bùng phát của căn bệnh do virus với các tên gọi khác nhau nhƣng đều có những dấu hiệu tƣơng tự gây ra bởi virus hình que đến từ các nơi khác nhau ở châu Á (Bảng 1. Cho đến nay, bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở các hầu hết các nƣớc nuôi tôm trên thế giới. Ở Việt Nam hầu hết các tỉnh nuôi tôm đều bị nhiễm mầm bệnh đốm trắng. Ban đầu, tác nhân gây bệnh đƣợc miêu tả là một virus gây bệnh có vỏ, hình dạng giống bacilli, gọi là RV - PJ (virus có nhân hình que của P.

japonicus), sau đó tác nhân này đƣợc định danh lại thành virus Penaeid có DNA hình que [41]. Virus gây chết các tế bào da và tế bào máu của tôm đƣợc coi là nhân tố gây bùng phát dịch bệnh ở tôm tại Trung Quốc vào năm 1993 - 1994 [15]. Một năm sau đó, virus chính thức đƣợc gọi là baculovirus gây ảnh hƣởng đến hệ thống biểu bì và ngoại bì trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái và thông tin về mô bệnh học của chúng [116]. Virus này đƣợc phân loại vào cùng nhóm với baculovirus, virus gây bệnh đỏ, virus gây bệnh đốm trắng.

Đến nay, virus này đƣợc gọi phổ biến là WSSV. Vào năm 1995, các nhà khoa học đề xuất rằng dựa trên hình thái, kích thƣớc, vị trí lắp ráp, bệnh học phân tử và thành phần nucleic acid, WSSV cần đƣợc xế p vào phân họ Nudibaculovirinae, họ Baculoviridae, với tên chính thức là PmNOBII, giống nhƣ baculovirus thứ 2 không có lỗ hổng đƣợc tìm thấy ở trên một giống tôm sú [117]. Trong cùng năm này, một chủng khác đã đƣợc phân lập và đƣợc coi là virus mới tìm thấy, gọi là PmNOBIII [131]. Các nghiên cứu dựa trên gen mã hóa cho enzyme ribonucleotide reductase (rr1 và rr2), trình từ DNA vp26 và vp28, cùng với việc 14 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] phát hiện các promoter của gene WSSV rr không đƣợc tìm thấy ở các virus baculovirus [103-105] và phân tích về nguồn gốc loài khi so sánh gen protein kinase của WSSV với protein kinase của một số virus và sinh vật nhân chuẩn cuối cùng đã tách WSSV ra khỏi baculovirus.1: Tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng qua từng giai đoạn Địa điểm Tài liệu tham Tên phân lập khảo Rod-shaped virus of Penaeus japomicus (RV- Nhật Bản [95] PJ) Hypodermal and hematopoietic necrosis Trung Quốc [40] baculovirus (HHNBV) Shrimp explosive epidermic disease (SEED) Trung Quốc [15] Systemic ectodermal and mesodermal Thái Lan [116] baculovirus (SEMBV) Penaeus monodon non-occluded Baculovirus II Thái Lan [117] (PmNOII) Penaeus monodon non- occluded Baculovirus Đài Loan [131] III (PMNOIII) Penaeid rod- shaped DNA virus (PRDV) Nhật Bản [41] White spot baculovirus (WSBV) Đài Loan [63] Yellow head disease-like virus Đài Loan [111] China Baculovirus (CBV) Trung Quốc [65] White spot syndrome baculovirus (WSSB) Thái Lan [30] White spot syndrome virus (WSSV) Đài Loan [65] Ngoài ra, dẫn liê ̣u giải trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác trong họ Baculoviridae [107, 123].

Sự khác biệt về genome và phổ vật chủ rộng của WSSV chứng tỏ virus này là đại diện cho một họ mới [32, 104]. Gần đây nhất, tại Hội nghị Virus học Quốc tế lần thứ 12, 15 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] WSSV đã đƣợc xếp vào chi Whispovirus thuộc họ virus mới là Nimaviridae (Hình 1.1: Vị trí của WSSV trong cây phát sinh chủng loại [124] 1. Cấu trúc của WSSV Các thông tin từ trƣớc tới nay cho thấy WSSV đƣợc tạo thành bởi ít nhất 58 protein cấu trúc, một vài trong số này đã đƣợc nghiên cứu cụ thể và là cơ sở để xây dựng hình ảnh toàn diện về cấu trúc chi tiết của WSSV [59].