Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong xu hướng phát triển của xã hội hiện đại, nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng và dược liệu tự nhiên của con người ngày càng gia tăng, đặc biệt chú trọng đến các hợp chất có khả năng kiểm soát nồng độ các gốc tự do (ROS, RNS). Các gốc tự do dư thừa trong cơ thể là tác nhân chính gây ra hiện tượng peroxy hóa lipid màng tế bào, làm biến tính protein, tổn thương ADN, từ đó dẫn đến nhiều bệnh lý nguy hiểm như thoái hóa thần kinh (Alzheimer, Parkinson), tim mạch, viêm khớp và ung thư. Thực vật là nguồn cung cấp dồi dào các chất chống oxy hóa tự nhiên như polyphenol, flavonoid, saponin và phytosterol.

Cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum), hay còn gọi là Sâm đất, Sâm mùng tơi, là loài thực vật nhiệt đới dễ trồng, sinh trưởng mạnh, giá thành thấp và từ lâu đã được nhân dân Việt Nam sử dụng làm rau ăn cũng như vị thuốc dân gian bồi bổ cơ thể. Mặc dù rễ củ của loài này chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự nhân sâm, nhưng các nghiên cứu thực nghiệm tại Việt Nam về đánh giá khả năng chống oxy hóa cũng như xác lập quy trình trích ly tối ưu trên củ Thổ nhân sâm vẫn còn hạn chế. Do đó, tác giả Đinh Quốc Việt đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu và đánh giá khả năng chống oxy hóa trong dịch chiết củ cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)”.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu được văn bản xác định cụ thể như sau:

  1. Mục đích nghiên cứu: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về khả năng chống oxy hóa của củ Thổ nhân sâm, làm sáng tỏ cơ sở khoa học cho các lợi ích sức khỏe của loài cây này, đồng thời tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm và mỹ phẩm.
  2. Yêu cầu/nhiệm vụ nghiên cứu:
    • Xác định hiệu suất chiết cao toàn phần và chỉ số $IC_{50}$ kháng gốc tự do DPPH của dịch chiết củ Thổ nhân sâm.
    • Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ (nồng độ dung môi, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi, nhiệt độ, thời gian trích ly) đến hiệu suất thu nhận chất chống oxy hóa (thông qua hàm lượng TEAC).
    • Xác định bộ thông số kỹ thuật tối ưu cho quy trình trích ly củ Thổ nhân sâm bằng phương pháp ngâm nóng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu củ cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum).
  • Không gian nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam (mẫu củ thu hái trực tiếp tại khuôn viên Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào tháng 7 năm 2021).
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 4/2021 đến tháng 9/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng hệ thống cơ sở lý thuyết bao quát về phân loại thực vật học của loài Talinum paniculatum (đồng danh Portulaca paniculata Jacq., Portulaca patens Jacq.), các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có trong lá và rễ củ (phytosterol như $\beta$-sitosterol, stigmasterol, campesterol; saponin steroid; alkaloid; flavonoid gồm quercetin, rutin, kaempferol; acid gallic...). Bên cạnh đó, đề tài tổng quan các cơ chế phản ứng của gốc tự do và các phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vitro phổ biến (DPPH, MDA, FRAP, TAC phosphomolybdenum, Iron chelating activity, bắt gốc superoxide, khử $H_2O_2$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ gồm các khâu:

  • Xử lý nguyên liệu: Củ Thổ nhân sâm tươi sau thu hái được làm sạch, thái lát, phơi bóng râm 72 giờ và sấy ở 60°C đến khối lượng không đổi, sau đó nghiền thành mảnh vỡ nhỏ và bảo quản trong túi zipper ở -20°C tránh ánh sáng.
  • Phương pháp chiết cao toàn phần: Sử dụng kỹ thuật ngâm nóng. Bột mẫu (10 g) được gói mỏng dẹt trong giấy lọc, ngâm trong ethanol 96% với tỉ lệ 1:20 (g/mL) ở 70°C trong 2,5 giờ. Dịch chiết sau khi để nguội được ly tâm (2.000 vòng/phút trong 5 phút) để loại tạp, bã được chiết lặp lại thêm 2 lần. Gộp toàn bộ dịch chiết và cô đuổi dung môi trên đĩa petri để thu cao toàn phần.
  • Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa: Sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl). Mẫu cao chiết được pha thành dãy nồng độ (125 – 1.000 $\mu$g/mL), phản ứng với dung dịch DPPH 100 $\mu$M trong ethanol, ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ quang (OD) tại bước sóng cực đại 517 nm trên máy quang phổ UV-VIS 752. Chất chuẩn đối chứng dương là Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid). Chỉ số $IC_{50}$ được xác định từ phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn tương quan giữa nồng độ mẫu và tỷ lệ bắt gốc tự do.
  • Phương pháp khảo sát thông số trích ly (thực nghiệm đơn yếu tố): Đánh giá hiệu suất thu nhận hoạt chất chống oxy hóa biểu thị qua hàm lượng đương lượng Trolox TEAC (mgTE/g) dựa trên đường chuẩn Trolox ($y = 0{,}0187x - 0{,}0492$, $R^2 = 0{,}9492$). Các biến số khảo sát gồm:
    • Nồng độ dung môi ethanol: 40%, 60%, 80%, 96% (v/v).
    • Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 (g/mL).
    • Nhiệt độ trích ly: 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C.
    • Thời gian trích ly: 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 giờ.
  • Phương pháp xử lý số liệu: Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử LSD ở mức ý nghĩa $p < 0{,}05$ (độ tin cậy > 95%) bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 và Infostat 2020e.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề và Mục đích, yêu cầu nghiên cứu

Chương mở đầu trình bày tính cấp thiết của việc tìm kiếm các nguồn dược liệu tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa cao, giới thiệu vị trí của cây Thổ nhân sâm trong hệ thực vật Việt Nam và xác định các mục tiêu, nhiệm vụ cụ thể cần giải quyết trong đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

  • Đặc điểm thực vật học và dược tính: Cung cấp khóa phân loại, hình thái thân, rễ củ, cụm hoa, hạt và vùng phân bố của Thổ nhân sâm tại các tỉnh miền núi phía Bắc (Thái Nguyên, Lạng Sơn, Cao Bằng...) và Trung Quốc. Tổng hợp thành phần dinh dưỡng lá khô (protein 18,61%, lipid 6,58%, chất xơ 35,94%) và các hoạt chất hóa học phân tích qua GC/MS trong rễ củ (5 loại phytosterol, 12 acid béo, saponin, polyphenol). Trình bày kinh nghiệm y học cổ truyền sử dụng củ Thổ nhân sâm làm thuốc bổ khí huyết, trị suy nhược, ho lâu ngày, tiêu chảy.
  • Gốc tự do và phương pháp kiểm tra chống oxy hóa: Trình bày chi tiết cơ chế tổn thương tế bào của các dạng oxy hóa hoạt động và nguyên lý hoạt động của các phép thử in vitro (DPPH, MDA, FRAP, phospho-molybdenum).
  • Kỹ thuật trích ly: So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp chiết rắn – lỏng như ngấm kiệt, ngâm dầm (ngâm lạnh, ngâm nóng), chiết Soxhlet và các kỹ thuật chiết hỗ trợ hiện đại.

Chương 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Tác giả mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu củ thu hái tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, hóa chất tinh khiết (Trolox của AK Scientific – Mỹ, DPPH của TCI – Nhật Bản), thiết bị phân tích và các bước bố trí thí nghiệm ngâm nóng, xây dựng đường chuẩn Trolox, công thức tính toán tỷ lệ ức chế $SA_{DPPH} (%)$, hàm lượng TEAC và các thuật toán phân tích thống kê.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung phân tích các dữ liệu thực nghiệm thu được:

  1. Tách chiết cao toàn phần: Thực hiện 3 mẻ chiết 10 g bột mẫu củ khô, thu được khối lượng cao trung bình 0,94 g, tương ứng hiệu suất chiết trung bình đạt 9,4%. Cao có màu nâu vàng, dẻo khi nóng và hóa rắn khi nguội, có mùi thơm đặc trưng giống nhân sâm.
  2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH: Cao toàn phần thể hiện hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ theo phương trình $y = 0{,}0048x + 0{,}0521$ ($R^2 = 0{,}9512$). Giá trị $IC_{50}$ của cao chiết củ Thổ nhân sâm đạt $93{,}312\ \mu\text{g/mL}$, cao hơn 16,4 lần so với chất chuẩn Trolox ($IC_{50} = 5{,}68\ \mu\text{g/mL}$).
  3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol: Nồng độ ethanol thay đổi từ 40% đến 96% ảnh hưởng rõ rệt đến hàm lượng TEAC ($p < 0{,}05$). Hàm lượng TEAC đạt cực đại ở nồng độ ethanol 60% ($5{,}245\ \text{mgTE/g}$), sau đó giảm dần khi nồng độ cồn tăng lên 80% và 96% do sự thay đổi độ phân cực của hệ dung môi.
  4. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: Khi tăng tỉ lệ dung môi từ 1:10 đến 1:30 (g/mL), hàm lượng TEAC tăng từ $4{,}581\ \text{mgTE/g}$ lên $6{,}463\ \text{mgTE/g}$. Tại tỉ lệ 1:40 (g/mL), hiệu suất chiết có xu hướng giảm nhẹ và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, do đó tỉ lệ 1:30 được chọn là tối ưu.
  5. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly: Hàm lượng TEAC tăng nhanh khi nâng nhiệt độ từ 40°C đến 60°C (đạt $6{,}742\ \text{mgTE/g}$). Ở dải nhiệt độ 60°C – 80°C, phân tích ANOVA chỉ ra không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mức nhiệt độ, nhưng tại 80°C hoạt tính giảm nhẹ do một số hợp chất chống oxy hóa kém bền nhiệt bị biến tính. Do đó, 60°C là nhiệt độ thích hợp nhất.
  6. Ảnh hưởng của thời gian trích ly: Kéo dài thời gian từ 2,0 giờ đến 3,0 giờ làm tăng TEAC từ $5{,}846\ \text{mgTE/g}$ lên $7{,}152\ \text{mgTE/g}$. Ở mốc 3,5 giờ, hàm lượng TEAC giảm xuống do hiện tượng oxy hóa và phân hủy hoạt chất sinh học khi tiếp xúc nhiệt độ kéo dài. Mốc thời gian 3,0 giờ được xác định là tối ưu.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp bộ số liệu thực nghiệm đầy đủ về hiệu suất trích ly và hoạt tính chống oxy hóa của củ Thổ nhân sâm, được tóm tắt qua bảng số liệu sau:

Thông số nghiên cứu Mức khảo sát Giá trị tối ưu / Kết quả đo được
Hiệu suất chiết cao toàn phần 3 lần lặp lại (10 g bột mẫu) 9,4% (đạt chuẩn Dược điển VN IV $\ge 8{,}5%$)
Giá trị $IC_{50}$ (DPPH) Dãy nồng độ $125 - 1000\ \mu\text{g/mL}$ $93{,}312\ \mu\text{g/mL}$ (Trolox: $5{,}68\ \mu\text{g/mL}$)
Nồng độ dung môi ethanol 40%, 60%, 80%, 96% 60% (v/v) (TEAC = $5{,}245\ \text{mgTE/g}$)
Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 (g/mL) 1:30 (g/mL) (TEAC = $6{,}463\ \text{mgTE/g}$)
Nhiệt độ trích ly 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C 60°C (TEAC = $6{,}742\ \text{mgTE/g}$)
Thời gian trích ly 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 giờ 3,0 giờ (TEAC đạt cực đại = $7{,}152\ \text{mgTE/g}$)

Đóng góp của nghiên cứu:

  • Chứng minh thực nghiệm củ Thổ nhân sâm trồng tại Việt Nam có hoạt tính chống oxy hóa in vitro tốt, khẳng định giá trị dược liệu của nguồn nguyên liệu bản địa giá rẻ.
  • Xác lập được bộ thông số công nghệ trích ly ngâm nóng tối ưu (Ethanol 60%, tỉ lệ 1:30 g/mL, 60°C, 3 giờ), giúp tiết kiệm dung môi, năng lượng và tối đa hóa lượng chất chống oxy hóa thu nhận được.
  • Đề xuất các kiến nghị cải tiến kỹ thuật chiết xuất (sử dụng enzyme, sóng siêu âm, vi sóng) và định lượng các nhóm chất chuyên sâu ($TPC$, $TFC$) cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện trong phạm vi điều kiện phòng thí nghiệm với một số hạn chế được tác giả nêu rõ:

  • Điều kiện trang thiết bị phân tích và hóa chất thí nghiệm còn hạn chế; thời gian thực hiện đề tài ngắn (5 tháng).
  • Mới chỉ dừng lại ở thử nghiệm in vitro bằng mô hình quét gốc tự do DPPH, chưa tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa sinh học in vivo trên mô hình động vật hoặc tế bào sống.
  • Chưa tiến hành định lượng tổng hàm lượng polyphenol ($TPC$), tổng flavonoid ($TFC$) và chưa phân lập chi tiết các hợp chất đơn lẻ trong phân đoạn cao chiết.

Hướng nghiên cứu mở rộng được tác giả kiến nghị:

  1. Ứng dụng các phương pháp trích ly tiên tiến hơn nhằm nâng cao hiệu suất như trích ly có sự hỗ trợ của enzyme, sóng siêu âm (UAE) hoặc vi sóng (MAE).
  2. Triển khai các thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa sinh học và độc tính tế bào.
  3. Thực hiện định lượng hàm lượng flavonoid và phenolic tổng số để làm rõ tương quan với hoạt tính TEAC.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

  • Sinh viên, học viên ngành Công nghệ sinh học, Dược học, Hóa sinh học và Công nghệ thực phẩm: Cung cấp quy trình chuẩn bị mẫu thực vật, kỹ thuật chiết xuất ngâm dầm hồi lưu nhiệt độ thấp và phương pháp thực nghiệm đo quang bắt gốc tự do DPPH theo đường chuẩn Trolox.
  • Các nhóm nghiên cứu về hợp chất tự nhiên: Cung cấp thông số đối chứng về hoạt tính $IC_{50}$ và hàm lượng TEAC của củ Thổ nhân sâm tại Việt Nam, phục vụ nghiên cứu phát triển các chế phẩm hỗ trợ sức khỏe từ nguồn thảo dược sẵn có.

Câu hỏi thường gặp

1. Giá trị $IC_{50}$ của dịch chiết củ Thổ nhân sâm trong thử nghiệm DPPH là bao nhiêu và tương quan thế nào với chất đối chứng?
Cao toàn phần củ Thổ nhân sâm đạt giá trị $IC_{50} = 93{,}312\ \mu\text{g/mL}$. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao toàn phần thấp hơn khoảng 16,4 lần so với chất chuẩn đối chứng dương Trolox ($IC_{50} = 5{,}68\ \mu\text{g/mL}$). Đây là mức hoạt tính tương đối tốt đối với một mẫu cao chiết thô chứa hỗn hợp nhiều hợp chất.

2. Điều kiện tối ưu để trích ly hoạt chất chống oxy hóa từ củ Thổ nhân sâm bằng phương pháp ngâm nóng là gì?
Bộ thông số tối ưu xác định được từ thực nghiệm gồm: Dung môi ethanol nồng độ 60% (v/v), tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:30 (g/mL), nhiệt độ trích ly 60°C và thời gian trích ly 3,0 giờ. Tại điều kiện này, hàm lượng TEAC thu được đạt giá trị cực đại là $7{,}152\ \text{mgTE/g}$.

3. Vì sao dung môi ethanol 60% lại cho hiệu suất TEAC cao hơn ethanol 96%?
Do nước có hằng số điện môi và giá trị liên kết hydro cao hơn ethanol, khi phối trộn ethanol với nước ở tỉ lệ thích hợp (60% cồn) sẽ tạo ra hệ dung môi có độ phân cực trung bình phù hợp, giúp hòa tan và trích ly đồng thời nhiều nhóm hợp chất chống oxy hóa phân cực và kém phân cực có trong củ Thổ nhân sâm tốt hơn cồn cao độ 96%.

4. Hiệu suất chiết cao toàn phần củ Thổ nhân sâm trong nghiên cứu đạt mức nào?
Hiệu suất chiết cao toàn phần trung bình qua 3 lần lặp lại đạt 9,4% (khối lượng cao thu được trung bình 0,94 g từ 10 g bột củ khô). Kết quả này đáp ứng chỉ số tối thiểu không dưới 8,5% tính theo dược liệu khô kiệt theo quy định của Dược điển Việt Nam IV (2009).

Kết luận

Khóa luận của tác giả Đinh Quốc Việt đã thực hiện thành công việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của củ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) thông qua mô hình thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH với chỉ số $IC_{50}$ đạt $93{,}312\ \mu\text{g/mL}$. Đề tài đã tối ưu hóa thành công quy trình trích ly ngâm nóng tại các thông số: ethanol 60%, tỉ lệ 1:30 (g/mL), nhiệt độ 60°C trong 3 giờ, đạt hàm lượng TEAC tối đa $7{,}152\ \text{mgTE/g}$. Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm vững chắc, chứng minh tiềm năng dược liệu giá trị của cây Thổ nhân sâm trong ứng dụng phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.