MỞ ĐẦU. Mục tiêu nghiên cứu. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .1 Đối tượng nghiên cứu .2 Phạm vi nghiên cứu. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài.1 Mô tả về họ Rubiaceae .2 Mô tả về chi Mussaenda .3 Mô tả về loài Bướm bạc đài cong (Mussaenda recurvata) .1 Giới thiệu chung .2 Mô tả thực vật .4 Thành phần hóa học chi Mussaenda .5 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học chi Mussaenda .1 Theo y học cổ truyền .2 Theo nghiên cứu khoa học .3 Mussaenda dona aurora .44 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Hóa chất và thiết bị .2 Phương pháp thực hiện.1 Thu hái và xử lý mẫu .2 Điều chế các loại cao .3 Điều chế các phân đoạn trong cao ethyl acetate .1 Phân lập hợp chất phân đoạn E2 .2 Phân lập hợp chất phân đoạn E6 .4 Phương pháp xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) .54 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1 Hợp chất MR37 .2 Hợp chất MR25 .3 Hợp chất MR57 .4 Hợp chất MR29C .5 Hợp chất MR17 .6 Hợp chất MR27 .7 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào .75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.78 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .79 TÀI LIỆU THAM KHẢO. Kết quả phổ của hợp chất MR37. Kết quả phổ của hợp chất MR25. Kết quả phổ của hợp chất MR57.
Kết quả phổ của hợp chất MR29C. Kết quả phổ của hợp chất MR17. Kết quả phổ của hợp chất MR27.140 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN .152 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.11 Mussaenda recurvata Naiki, Tagane & Yahara.12 Sơ đồ biểu đồ đo lường các bộ phận hoa của Mussaenda recurvata Naiki, Tagane & Yahara .1 Sơ đồ điều chế các loại cao từ loài Bướm bạc đài cong. 2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate .1 Cấu trúc của hợp chất MR37 và tương quan HMBC .2 Cấu trúc của hợp chất MR25 và tương quan HMBC, NOESY .3 Cấu trúc của hợp chất MR57 .4 Cấu trúc của hợp chất MR29C và tương quan HMBC .5 Cấu trúc của hợp chất MR17 và tương quan HMBC .6 Cấu trúc của hợp chất MR27 và tương quan HMBC .72 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các triterpenoid từ chi Mussaenda .2 Các flavonoid từ chi Mussaenda .3 Các phenol từ chi Mussaenda .4 Các iridoid từ chi Mussaenda .5 Các sterol từ chi Mussaenda .6 Hoạt động kháng vi khuẩn của Mussaenda philippica .7 Hoạt động kháng khuẩn của dịch chiết methanol .8 Hoạt động kháng khuẩn của dịch chiết ethyl acetate .9 Hoạt động kháng khuẩn của dịch chiết hexane .10 Hiệu quả độc tế bào các hợp chất (IC50, μM) .11 Hoạt động chống oxy hóa các hợp chất .12 Hiệu quả các dịch chiết rễ Mussaenda erythrophylla trên giun đất .13 Hoạt động kháng vi khuẩn của dịch chiết và các hợp chất .14 Kết quả hoạt động kháng oxy hóa (DPPH) .15 Khả năng thu dọn gốc tự do DPPH .16 Kết quả hoạt tính kháng-HSV-1 và kháng-RSV .17 Hoạt động kháng khuẩn của dịch chiết methanol .18 Hoạt động kháng khuẩn của dịch chiết ethyl acetate .1 Kết quả sắc ký cột silica gel cao ethyl acetate .2 Kết quả sắc ký cột silica gel phân đoạn E2 .3 Kết quả SKC silica gel phân đoạn E2.4 Kết quả sắc ký cột silica gel phân đoạn E2.5 Kết quả sắc ký cột silica gel phân đoạn E6 .6 Kết quả sắc ký cột silica gel phân đoạn E6.7 Kết quả sắc ký cột silica gel phân đoạn E6.1 Dữ liệu phổ NMR của MR37 .2 Dữ liệu phổ NMR của MR25 .3 Dữ liệu phổ NMR của MR57 .4 Dữ liệu phổ NMR của MR29C .5 Dữ liệu phổ NMR của MR17 .6 Dữ liệu phổ NMR của MR27 .7 Khả năng gây độc tế bào các cao chiết .8 Khả năng gây độc tế bào các mẫu chất tinh khiết .76 xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt AAE Ascorbic acid equivalent Tương đương axit ascorbic 2,2’-azino-bis(3- ABTS ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) Ac Acetyl ALP Alkaline phosphatase Butylated hydroxytoluene Tương đương butylated BHTE equivalent hydroxytoluene brs Broad singlet Mũi đơn rộng Khả năng gây chết ấu BSL Brine shrimp lethality trùng tôm BuOH Butanol C Carbon o C Degree Celsius Độ Celsius Dòng tế bào ung thư ruột Caco-2 Colon cancer cell line kết CAT Catalase CC Column chromatography Sắc ký cột Nồng độ gây độc tế bào 50 CC50 50% Cytotoxicity concentration phần trăm CCl4 Carbon tetrachloride CH Methine CH2 Methylene CH2Cl2 Dichloromethane CH2OH Hydroxymethyl CH3 Methyl cm Centimeter 13 Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt C-NMR resonance spectroscopy nhân 13C C=O Carbonyl COOCH2CH3 Ethyl ester COOCH3, COOMe Acetoxyl COOH Acid carboxylic D Dimensional Chiều d Doublet Mũi đôi dd Doublet of doublets Mũi đôi đôi Distortionless enhancement by DEPT polarrization transfer DFMO Difluoromethylornithine DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl xii Ung thư biểu mô cổ EAC Ehrlich ascites carcinoma trướng Ehrlich Nồng độ hiệu quả 50 phần EC50 50% Effective concentration trăm EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol F Fraction Phân đoạn g Gram Gas chromatography-mass GC-MS Sắc ký khí-khối phổ spectrometry Glc, glu β-D-glucopyranosyl GPx Glutathione peroxidase GSH Glutathione reductase H Hydrogen Hydro HCl Hydrochloric acid Ung thư biểu mô của cổ tử HeLa Human carcinoma of uterine cervix cung ở người HepG2 Human liver cancer Ung thư gan ở người Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác hạt nhân HMBC correlation qua nhiều liên kết 1 Hydrogen-1 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt H-NMR resonance spectroscopy nhân 1H H2O Water Nước H2O2 Hydrogen peroxide High performance liquid Sắc ký chất lỏng hiệu năng HPLC chromatography cao High resolution-electrospray Khối phổ ion hóa phun HR-ESI-MS ionization-mass spectrometry điện phân giải cao H2SO4 Sulfuric acid Heteronuclear single quantum Phổ tương tác hạt nhân HSQC coherence qua một liên kết Vi rút đa mụn rộp loại 1 ở HSV-1 Human herpes simplex virus type 1 người Hz Hertz Nồng độ ức chế 50 phần IC50 50% Inhibitory concentration trăm Nồng độ ức chế 90 phần IC90 90% Inhibitory concentration trăm J Coupling constant Hằng số ghép cặp kg Kilogram Ki Inhibition constant Hằng số ức chế l, L Liter L-L Lỏng-lỏng LC50 50% Lethal concentration Nồng độ gây chết 50 phần xiii trăm LPO Lipid peroxidation Sự peroxy hóa lipid m Meter M Molar m Multiplet Mũi đa MCF-7 Breast cancer cell line Dòng tế bào ung thư vú Me Methyl MeOD Deuterated methanol mg Miligram MHz Megahertz MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu ml, mL Milliliter mm Millimeter mM Milimolar MR Mussaenda recurvata Bướm bạc đài cong N Nitrogen Nitơ n Normal Bình thường Viện Ung thư Quốc gia NCI National cancer institute Hoa Kỳ NH Amide Các tế bào nguyên bào sợi NIH3T3 Normal fibroblast cells bình thường nm Nanometer nM Nanomolar Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt NMR spectroscopy nhân NO Nitric oxide Nuclear Overhauser effect Phổ hiệu ứng Overhauser NOESY spectroscopy hạt nhân O Oxygen Oxy OCH2CH3 Ethoxy OCH3, OMe Methoxy OD Optical density Mật độ quang OH Hydroxyl p Para ppm Parts per million Phần triệu Rha α-L-rhamnopyranosyl Rp Reversed phase Pha đảo Virus hợp bào hô hấp ở RSV Human respiratory syncytial virus người s Singlet Mũi đơn SKC Sắc ký cột Serum glutamate oxaloacetate Huyết thanh glutamate SGOT transaminase oxaloacetate transaminase xiv Serum glutamate pyruvate Huyết thanh glutamate SGPT transaminase pyruvate transaminase SI Selective indices Chỉ số chọn lọc SKLM Sắc ký lớp mỏng SMMC-7721 Human hepatoma U gan ở người SOD Superoxide dismutase SRB Sulforhodamine B t Triplet Mũi ba TCA Trichloracetic acid td Triplet of doublets Mũi ba của mũi đôi TK Tham khảo TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane UV Ultraviolet Phổ tử ngoại Vero African green monkey Khỉ xanh Châu Phi Xyl β-D-xylopyranosyl α Alpha β Beta γ Gamma δ Shift Độ dời hóa học λ Lambda μ Micro μg Microgram μL Microliter μM Micromolar xv MỞ ĐẦU 1.
Đặt vấn đề Từ thời xa xưa con người đã biết sử dụng nhiều loài thực vật có sẵn trong tự nhiên không chỉ để làm thực phẩm phục vụ cho nhu cầu đời sống hằng ngày, mà còn sử dụng để làm thuốc điều trị nhiều loại bệnh. Ngày nay khi mà khoa học và công nghệ đã phát triển một cách vượt bậc, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đa dạng trong các loài thực vật khác nhau. Những nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên đã mang lại nhiều đóng góp không nhỏ cho ngành y dược học nói chung mà còn cho ngành hóa học nói riêng. Từ đó cho thấy việc nghiên cứu và xác định rõ cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất thiên nhiên mang một vai trò rất lớn trong việc sử dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên vô giá này.
Song song đó cần có những biện pháp để bảo tồn nhiều loài thực vật có giá trị cao đang có nguy cơ biến mất là điều hết sức cần thiết. Việt Nam nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm với nét đặc trưng thay đổi từ điều kiện khí hậu nhiệt đới điển hình ở những vùng đất thấp phía Nam đến các đặc điểm mang tính chất cận nhiệt đới ở các vùng núi cao phía Bắc [1]. Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên và khí hậu nêu trên, đã tạo nên mức độ đa dạng cao về sinh học ở Việt Nam. Theo những nghiên cứu mới đây của các nhà khoa học, ở Việt Nam có gần 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo.
Trong đó nhiều loài được dùng làm thuốc [1]. Chi Bướm bạc (Mussaenda) là một chi lớn thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) [3]. Khoảng 160 loài phổ biến trong nhiệt đới Châu Phi, Châu Á và Châu Úc [4]. Gồm tới 200 loài ở Cựu lục địa.
Ở nước ta, có 28 loài [2]. 1 Chi Mussaenda chứa các hợp chất triterpenoid, flavonoid, iridoid,…đã được nghiên cứu thử nghiệm và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, bảo vệ gan, kháng nấm,… Bướm bạc đài cong là một loài mới được phát hiện vào năm 2017 tại Khu bảo tồn thiên nhiên Hòa Bình, tỉnh Khánh Hòa. Hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới vẫn chưa có bất kì một công trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Với các hoạt tính sinh học kể trên của chi Mussaenda là tiền đề để nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư của một số hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất của loài Bướm bạc đài cong.
Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài tìm hiểu thành phần hóa học và tiến hành phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc các hợp chất có trong cao ethyl acetate từ loài Bướm bạc đài cong. Tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế sự phát triển trên một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất đã phân lập được. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.