Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu xác định hòa hợp hla giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật pcr sso để định hướng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia

Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật PCR SSO, định hướng ghép tế bào gốc điều trị bệnh thalassemia.

• Tác giả: Lê Xuân Thịnh
• Người hướng dẫn: BS. Trần Ngọc Quế
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật PCR-SSO để định hướng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh Thalassemia
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng nguyên hệ bạch cầu người
• 1.2. Khái niệm human leukocyte antigen
• 1.3. Hệ thống HLA
• 1.4. Chức năng của HLA
• 1.5. Phân bố gen HLA trong cơ thể
• 1.6. Kỹ thuật định danh HLA
• 1.7. Tế bào gốc
• 1.8. Khái niệm tế bào gốc
• 1.9. Tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi
• 1.10. Tế bào gốc từ máu dây rốn
• 1.11. Ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia
• 1.12. Ghép tế bào gốc
• 1.13. Nghiên cứu hòa hợp HLA ở Việt Nam và trên Thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6. Các bước tiến hành nghiên cứu
• 2.7. Chỉ số nghiên cứu
• 2.8. Xử lý số liệu
• 2.9. Đạo đức nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Đặc điểm đối tượng bệnh nhân
• 3.3. Đặc điểm đối tượng người hiến cùng huyết thống
• 3.4. Đặc điểm đối tượng người hiến không cùng huyết thống
• 3.5. Kết quả xác định HLA của bệnh nhân, người hiến
• 3.5.1. Kết quả xác định các alen của locus HLA-A
• 3.5.2. Kết quả xác định các alen của locus HLA-B
• 3.5.3. Kết quả xác định các alen của locus HLA-DRB1
• 3.6. Nhận xét về mức độ hòa hợp HLA bệnh nhân và người hiến
• 3.7. Kết quả tìm kiếm cho bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống
• 3.8. Kết quả tìm kiếm cho bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống từ Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hòa hợp HLA trong điều trị thalassemia

Nghiên cứu hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến tế bào gốc là một lĩnh vực quan trọng trong điều trị bệnh thalassemia. Thalassemia là một bệnh di truyền phổ biến, đặc biệt ở các nước Đông Nam Á. Việc xác định sự hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến tế bào gốc có thể quyết định thành công của phương pháp ghép tế bào gốc. Hệ thống HLA (Human Leukocyte Antigen) đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện và loại bỏ tế bào lạ, từ đó ảnh hưởng đến khả năng thành công của ghép tế bào gốc.

1.1. Khái niệm về HLA và vai trò của nó trong ghép tế bào gốc

HLA là một nhóm các protein trên bề mặt tế bào, giúp hệ miễn dịch nhận diện các tế bào lạ. Việc xác định HLA là cần thiết để đảm bảo sự hòa hợp giữa bệnh nhân và người hiến tế bào gốc, từ đó giảm thiểu nguy cơ thải ghép.

1.2. Tình hình thalassemia tại Việt Nam và nhu cầu ghép tế bào gốc

Tại Việt Nam, thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến nhất. Mỗi năm có hàng ngàn trẻ em sinh ra mắc bệnh này, dẫn đến nhu cầu cấp thiết về các phương pháp điều trị hiệu quả như ghép tế bào gốc.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hòa hợp HLA

Mặc dù nghiên cứu hòa hợp HLA đã đạt được nhiều tiến bộ, nhưng vẫn còn nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn là việc tìm kiếm người hiến tế bào gốc phù hợp với bệnh nhân. Tỷ lệ hòa hợp HLA giữa các thành viên trong gia đình thường cao hơn, nhưng không phải lúc nào cũng có người hiến phù hợp.

2.1. Khó khăn trong việc tìm kiếm người hiến tế bào gốc

Nhiều bệnh nhân không có anh chị em ruột để hiến tế bào gốc, dẫn đến việc tìm kiếm người hiến từ cộng đồng trở nên khó khăn. Điều này làm giảm khả năng thành công của ghép tế bào gốc.

2.2. Tình trạng thiếu ngân hàng tế bào gốc tại Việt Nam

Ngân hàng tế bào gốc tại Việt Nam còn hạn chế, ảnh hưởng đến khả năng tìm kiếm người hiến phù hợp. Việc phát triển ngân hàng tế bào gốc cộng đồng là cần thiết để tăng cường nguồn cung tế bào gốc.

III. Phương pháp nghiên cứu hòa hợp HLA hiệu quả

Để xác định sự hòa hợp HLA, các phương pháp hiện đại như kỹ thuật PCR-SSO được áp dụng. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các alen HLA của bệnh nhân và người hiến tế bào gốc.

3.1. Kỹ thuật PCR SSO trong xác định HLA

Kỹ thuật PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide) là một phương pháp hiệu quả để xác định các alen HLA. Phương pháp này giúp phát hiện nhanh chóng sự hòa hợp giữa bệnh nhân và người hiến.

3.2. Đánh giá mức độ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến

Việc đánh giá mức độ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến là rất quan trọng. Các chỉ số hòa hợp HLA sẽ giúp định hướng cho việc ghép tế bào gốc, từ đó nâng cao tỷ lệ thành công.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu hòa hợp HLA

Nghiên cứu hòa hợp HLA không chỉ có giá trị trong điều trị thalassemia mà còn có thể áp dụng cho nhiều bệnh lý khác. Việc xác định HLA giúp tối ưu hóa quy trình ghép tế bào gốc, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

4.1. Kết quả nghiên cứu hòa hợp HLA tại Việt Nam

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến tế bào gốc có ảnh hưởng lớn đến kết quả ghép. Các nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ thành công của ghép tế bào gốc tăng lên khi có sự hòa hợp HLA cao.

4.2. Tương lai của ghép tế bào gốc trong điều trị thalassemia

Với sự phát triển của công nghệ và nghiên cứu, tương lai của ghép tế bào gốc trong điều trị thalassemia hứa hẹn sẽ có nhiều tiến bộ. Việc mở rộng ngân hàng tế bào gốc và cải thiện kỹ thuật xác định HLA sẽ là những yếu tố quan trọng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu HLA

Nghiên cứu hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến tế bào gốc là một lĩnh vực quan trọng trong điều trị thalassemia. Việc xác định HLA chính xác sẽ giúp nâng cao tỷ lệ thành công của ghép tế bào gốc. Tương lai của nghiên cứu này sẽ phụ thuộc vào sự phát triển của công nghệ và nguồn cung tế bào gốc.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu HLA trong y học hiện đại

Nghiên cứu HLA không chỉ có ý nghĩa trong điều trị thalassemia mà còn trong nhiều lĩnh vực y học khác. Việc hiểu rõ về HLA sẽ giúp cải thiện các phương pháp điều trị và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.2. Định hướng nghiên cứu HLA trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu HLA sẽ tiếp tục được mở rộng với sự phát triển của công nghệ gen và tế bào gốc. Các nghiên cứu mới sẽ giúp tìm ra những phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân thalassemia và các bệnh lý khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi globin và là bệnh di truyền phổ biến nhất Đông Nam Á và trên thế giới [14]. Theo ước tính của Liên đoàn Thalassemia Thế giới, có khoảng 7% dân số mang gen bệnh thalassemia và hàng năm có khoảng 300.000 trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia mức độ nặng [58]. Ở Thái Lan tỷ lệ người mang gen α-thalassemia là 14%, β-thalassemia từ 3-9%, HbE là 13%. Với 1% dân số mang gen thì hàng năm có khoảng 12.000 trẻ sinh ra mắc căn bệnh này [68].

Cũng theo ước tính trên, tại Việt Nam có khoảng 10% dân số mang gen bệnh này và mỗi năm có 20.000 đứa trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia [16]. Người bệnh thalassemia phải điều trị thường xuyên bằng truyền máu, thải sắt và điều trị các biến chứng. Chi phí điều trị bệnh thalassemia lớn làm kinh tế gia đình suy giảm, bệnh nhân trở thành gánh nặng cho xã hội và ảnh hưởng tới chất lượng giống nòi. Hiện nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, tiến bộ của các phương pháp điều trị giúp cải thiện sức khỏe cho bệnh nhân thalassemia.

G ện nay đượ halassemia [76]. Đặc biệt số ca ghép tế bào gốc lấy nguồn từ anh/chị em ruột ngày càng tăng và cho kết quả cải thiện đáng kể trong ba thập kỷ qua [75, 76]. Việc ghép thành công tế bào gốc đòi hỏi cần phải có nguồn cho tế bào gốc hòa hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA-Human leukocyte antigen). Các locus thường sử dụng để xác định sự hòa hợp trong ghép tế bào gốc đồng loài bao gồm các locus quy định HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 và HLA-DQB1, trong đó yêu cầu hòa hợp HLA đối với nguồn tế bào gốc là máu dây rốn chỉ cần tối thiểu 4/6 locus HLA-A, HLA-B, HLA-DR ở độ phân giải cao [39].

Khả năng hòa hợp HLA của người nhận với người cho cùng huyết thống cao hơn so với người trong cộng đồng [75, 76]. Trong gia đình càng có nhiều ngườ ợc người cho hòa hợp ỷ lệ ghép thành công càng lớ Tuy nhiên, đối với những trường hợp bệnh nhân không có anh/chị/em ruột hòa hợp HLA để hiến tế bào gốc thì cơ hội Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học điều trị ghép gần như không còn. Để giải quyết khó khăn này, nhiều trung tâm lớn trên Thế giới cũng như tại Việt Nam, Ngân hàng Tế bào gốc của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã triển khai xây dựng Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng [11]. Nguồn tế bào gốc này có một số ưu điểm nổi bật như sẵn có, thu thập dễ dàng, không ảnh hưởng đến sức khỏe của người hiến và đặc biệt là yêu cầu về hòa hợp HLA giữa người hiến và bệnh nhân không cao.

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và ngƣời hiến bằng kỹ thuật PCR-SSO để định hƣớng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia” với 2 mục tiêu: 1. Xác định được HLA của bệnh nhân thalassemia và người hiến tế bào gốc bằng kỹ thuật RCR-SSO. Đánh giá được mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân thalassemia và người hiến để định hướng ghép tế bào gốc. Nội dung nghiên cứu gồm: ‐ Xác định HLA của bệnh nhân thalassemia có chỉ định ghép tế bào gốc và người hiến cùng huyết thống; ‐ Đánh giá mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống với người hiến và của bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống với các đơn vị máu dây rốn cộng đồng.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng nguyên hệ bạch cầu ngƣời 1. Khái niệm human leukocyte antigen HLA (Human Leucocyte Antigen) là tên gọi tắt quốc tế của kháng nguyên bạch cầu người. Việc khám phá ra phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (Major Histocompatibility Complex - MHC) và vai trò của nó trong thải ghép, đáp ứng miễn dịch và cơ sở di truyền bệnh dẫn đến sự ra đời của một lĩnh vực khoa học mới là di truyền miễn dịch [60].

Đây là lĩnh vực quan trọng không chỉ trong nghiên cứu y sinh học cơ bản mà còn trong y học lâm sàng. Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu ở người là hệ thống kháng nguyên bạch cầu người được quy định bởi vùng gen nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21) [61, 62]. HLA lần đầu tiên được phát hiện trên bề mặt tế bào bạch cầu nhờ vai trò trong thải ghép [71]. Hiện nay khoa học đã chứng minh các protein của hệ thống gen HLA hiện diện trên bề mặt tế bào của đa số động vật có xương sống, kháng nguyên HLA tham gia vào nhiều công đoạn trong nhận diện miễn dịch bao gồm tương tác giữa các tế bào lympho khác nhau cũng như giữa các tế bào lympho với các tế bào trình diện kháng nguyên [60].

Do vậy, việc xác định các kháng nguyên HLA hay định nhóm HLA (HLA typing) còn được gọi là định nhóm mô (tissue typing) [56]. Danh pháp Theo Marsh SG và cộng sự (2010) danh pháp HLA như sau [69]: Tên gen + dấu * + mã số alen + dấu : + mã số protein HLA riêng + dấu : + mã số ADN tương ứng trong vùng mã hóa + dấu : + mã số ADN ngoài vùng mã hóa + Hậu tố: - Hậu tố N: alen không được biểu hiện (Null); - Hậu tố L: alen của protein biểu hiện ở bề mặt tế bào thấp hơn bình thường (Low); - Hậu tố S: alen của protein tan nhanh nhưng không biểu hiện trên bề mặt tế bào (Secret); Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học - Hậu tố C: alen của protein ở trong tế bào chất chứ không ở bề mặt tế bào (Cytoplasm); - Hậu tố A: khi nghi ngờ protein có được biểu hiện không (Aberrant); - Hậu tố Q: alen có đột biến trước đó đã được chứng minh là có ảnh hưởng đến việc biểu hiện trên tế bào nhưng chưa được xác nhận vị trí và vẫn còn nghi vấn (Questionable). Cấu trúc tên HLA [69] Ví dụ: Khi viết alen HLA-A*11:01 thì có nghĩa là: locus HLA-A, alen 11, protetin 01. Hệ thống HLA Dựa trên cấu trúc và chức năng, các kháng nguyên HLA được chia thành hai lớp: HLA lớp I và HLA lớp II (Hình1.

Kích thước tổng thể của hệ thống gen HLA là khoảng 3,5 triệu cặp bazơ niơ [62]. Trong đó, vùng gen HLA lớp I và lớp II chiếm khoảng 1/3 mỗi loại. Phần còn lại là vùng gen HLA lớp III mã hóa bổ thể, hormon, xử lý peptide nội bào và một số chức năng khác. Do đó, vùng gen HLA lớp III không thực sự là một phần của hệ thống HLA, nhưng chúng nằm trong khu vực HLA và có liên quan đến các chức năng của kháng nguyên HLA hoặc có cơ chế kiểm soát tương tự như các gen HLA [60].

Cho tới nay, người ta đã biết khoảng 17330 alen của hệ thống HLA, các alen này tạo ra kháng nguyên và phát hiện được bằng kháng thể đặc hiệu. Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học Bảng 1.1: Số alen HLA phát hiện được (2017) + Loci A có 3997 alen + Loci DR có 2395 alen + Loci B có 4859 alen + Loci DP có 942 alen + Loci C có 3605 alen + Loci DQ có 1152 alen Hệ thống HLA chia làm 3 lớp: Lớp I, II, III (Class I, Class II, Class III). Class I: Có các nhóm (loci): ký hiệu là A, B, C, E, F, G, J… trong đó A, B, C có vai trò quan trọng trong chức năng của lớp I. Class II: Có các nhóm DR, DQ, DN, DN, DP.

Trong đó, DR, DQ có vai trò quan trọng trong chức năng của lớp II. Class III: Vùng của các thành phần tế bào và bổ thể: C2, C4, Bf, TNF α, TNF β. Bản đồ vùng gen mã hoá HLA [69]  HLA lớp I HLA lớp I gồm 3 locus chính là HLA-A, B, C, mã hóa cho các glycopeptide, chúng biểu hiện trên bề mặt của hầu hết các tế bào có nhân của cơ thể. Ngoài ra, chúng được tìm thấy ở dạng hòa tan trong huyết tương và được hấp phụ lên bề mặt của tiểu cầu.

Hồng cầu cũng hấp phụ kháng nguyên HLA lớp I ở mức độ khác nhau tùy thuộc vào đặc trưng (ví dụ như HLA-B7, A28 và B57 được nhận biết trên hồng cầu còn được gọi là kháng nguyên "Bg"). Các nghiên cứu miễn dịch học chỉ ra rằng HLA-B có tính đa hình cao nhất và cũng là locus HLA lớp I có vai trò quan trọng Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học nhất, tiếp theo là HLA-A và sau đó HLA-C. Ngoài ra, HLA lớp I còn có các locus khác như HLA-E, F, G, H, J, K và L nhưng hầu hết trong số này không có vai trò trong "trình diện peptide" [56]. Các kháng nguyên HLA lớp I bao gồm một chuỗi nặng glycopeptide xuyên màng (45 kDa) với ba domain (α1, α2, α3), liên kết không đồng hóa trị với một chuỗi nhẹ ngoại màng β2-microglobulin (12 kDa, mã hóa bởi một gen ngoài hệ thống HLA, không có tính đa hình) đóng một vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ cấu trúc của chuỗi nặng.

Các phân tử HLA lớp I được tổng hợp bên trong tế bào và cuối cùng định vị trên bề mặt tế bào với một phần ở lớp lipid kép của màng tế bào và có một phần đuôi ngắn nằm trong tế bào chất [71]. Về mặt cấu trúc không gian, phân tử HLA lớp I tạo ra một khe có thể chứa được một peptide dài 9 axit amin. Do sự đa hình của các locus lớp I, nhất là vùng mã hóa domain α1 và α2, số peptide có thể tổ hợp được rất đa dạng lên tới 1011 [60]. Phần ngoài màng Hình 1.

Cấu trúc phân tử HLA lớp I và lớp II [69] Trong thực tế, nếu một tế bào bị nhiễm virus, các protein trong tế bào sẽ “cắt xén” virus thành các peptide nhỏ, sau đó những peptide được gắn vào khe liên kết của các phân tử HLA lớp I.