Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào, truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tin nội bào dẫn đến đáp ứng tế bào giúp cơ thể đáp ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường. Để thực hiện được chức năng đó, thụ thể có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hoặc một số phân tử tín hiệu đặc thù được gọi là phối tử (ligand) và phức hệ “ligand – thụ thể” sẽ khởi đầu một quá trình truyền tin nội bào và gây nên đáp ứng tế bào [3]. Có 4 họ thụ thể chính (Hình 1), trong đó thụ thể kết cặp G-protein (viết tắt là GPCR) là họ protein lớn và đa dạng nhất ở người [33].
Thụ thể kết cặp G- protein là nhóm thụ thể xuyên màng sinh chất và hoạt động nhờ sự kết cặp với một loại protein hoạt động bởi liên kết với GTP (tức là G-protein). GPCR dẫn truyền tín hiệu cho nhiều dạng phối tử, bao gồm các hóc môn, peptit thần kinh, các chemokine…Trong cơ thể, các GPCR được biểu hiện trên hầu hết các kiểu tế bào và ước tính có đến 1000 GPCR khác nhau ở người [52]. Bốn họ thụ thể chính (nguồn: Gunnar Schulte, 2008 [18]) Sự thay đổi về mật độ cũng như trạng thái hoạt hóa của các GPCR là nguyên nhân trực tiếp gây nên nhiều bệnh cấp tính và mãn tính như tiểu đường, các bệnh tim, trầm cảm, viêm nhiễm và ung thư [31]. Các GPCR là đích tác động chính của hơn 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng trong điều trị.
3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Riêng năm 2001, nhóm thuốc này đem đến doanh thu trên 30 tỷ USD và ước tính con số hiện nay còn cao hơn [25]. Mặc dù GPCR có ý nghĩa thực tiễn to lớn song có hai trở ngại lớn khi sử dụng các GPCR tự nhiên (native) trong các nghiên cứu dược lý học phân tử và sàng lọc thuốc. Thứ nhất là các GPCR tự nhiên thường chỉ được biểu hiện ở mức độ rất thấp (khoảng vài fmol/mg protein màng tế bào) nên thường không sẵn có để dùng cho các thí nghiệm sàng lọc. Thứ hai là trong các mô hình thử nghiệm ở các động vật thí nghiệm, các GPCR thường đồng thời tồn tại ở nhiều dạng phụ (subtype) khác nhau hoặc các dạng biến thể (variants/polymorphic alleles) khác nhau, dẫn đến có thể có những nhận định nhầm về khả năng tương tác của các “thuốc thử” (test compound) với các thụ thể đích nếu đối tượng thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên không đại diện cho nhóm phổ biến nhất (các alen kiểu dại).
Có thể nhận thấy những khó khăn trên có thể được khắc phục bằng việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện các GPCR tái tổ hợp của người. Các GPCR tái tổ hợp được biểu hiện ở mức độ cao sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính bởi vậy, xây dựng các hệ thống biểu hiện GPCR nhanh và hiệu quả là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng và mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong sàng lọc và nghiên cứu phát triển dược phẩm.2 Các hệ thống vector Ý tưởng về vector mang gen ngoại lai bắt nguồn từ các plasmit vi khuẩn. Vector là phân tử ADN có khả năng tự tái bản, tồn tại độc lập trong tế bào chủ và mang các gen cần chuyển.
Sau khi vector ngoại lai được đưa vào tế bào chủ, chúng sử dụng bộ máy sao chép của tế bào chủ để nhân bản đến số lượng cần thiết và biểu hiện các gen chúng mang [1]. Đến nay, đã có hơn 2600 vector được chia làm 3 nhóm chính là plasmit (nguồn gốc từ vi khuẩn), phagơ (nguồn gốc từ virut) và nhiễm sắc thể nhân tạo [46]. Chuyển gen vào các tế bào động vật có thể tiến hành bằng cách gây nhiễm các phagơ mang gen tái tổ hợp quan tâm hoặc chuyển gen trực tiếp thông qua plasmit. Có rất nhiều vector biểu hiện trên động vật có vú có nguồn gốc từ virut 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học được dùng trong sản xuất protein, liệu pháp gen và phát triển vacxin mới (Phụ lục-1).
Hiệu quả biểu hiện gen đặc biệt là trong các tế bào động vật có vú không đơn thuần thể hiện ở tốc độ sản xuất protein mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như các nhân tố kiểm soát phiên mã và dịch mã, quá trình biên tập và sự ổn định của ARN, số lượng bản sao của gen ngoại lai, khả năng gây độc của các protein tái tổ hợp với tế bào cũng như các đặc tính di truyền của tế bào chủ. Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thuận tiện với mục đích sử dụng. Không có hệ vector nào toàn năng cho chuyển gen và biểu hiện mà cần có sự chọn lựa tùy theo mục đích và kích thước của đoạn gen được tạo dòng [66]. Các vector liên tục được cải tiến thuận lợi cho việc chuyển gen, sản xuất và thu hồi protein ngoại lại một cách hiệu quả.
Dưới đây tóm lược một số xu hướng cải tiến vector phổ biến và ý nghĩa của chúng.1 Tạo các vector ADN từ hệ gen virut có bản chất ARN Nhiều virut có hệ gen ARN có tiềm năng phát triển thành các vector biểu hiện mạnh. Các phiên bản vector ADN của virut ARN được thiết lập là một bước cải tiến lớn đem lại các hệ thống biểu hiện mạnh hơn (đặc biệt ở tế bào động vật có vú), dễ dàng thao tác với các enzym và thuận lợi cho quá trình chèn các đoạn ADN ngoại lai đồng thời hạn chế được các bước xử lý trong điều kiện chuyên biệt dành cho ARN và dịch mã ARN có mũ đầu 5’ trong ống nghiệm [6]. Nhiều nghiên cứu xây dựng vector ADN dựa trên hệ vector ARN gốc đã được tiến hành, chẳng hạn như các hệ vector ADN có nguồn gốc từ ARN hệ gen của virut Sindbis [54].2 Thêm hoặc cải tiến các vùng điều khiển Những hiểu biết ngày càng sâu sắc về các trình tự mã cho các tín hiệu điều khiển quá trình phiên mã, biên tập mARN và dịch mã có thể thêm vào vector giúp chúng ta chủ động điểu khiển hiệu suất biểu hiện theo ý muốn. Trình tự Kozak GCC(A/G) CCATGG ở động vật có xương sống hoặc trình tự tương đương CAAAACATG ở côn trùng bất cứ khi nào xuất hiện đều làm tăng hiệu suất dịch mã ARN [1].
Ngoài ra, đoạn trình tự này còn khuyến 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học khích loại bỏ các vùng có thể ức chế dịch mã nằm ngược dòng ATG hay vùng cấu trúc thứ cấp ở đầu 5’ không mã hóa [15]. Lựa chọn các trình tự tăng cường hay các promoter mạnh có hiệu suất phiên mã cao để thêm hoặc thay thế cho promoter gốc của vector sẽ giúp tắng cường mức độ biểu hiện protein. Bảng 1 trình bày một số promoter có thể thêm vào vector biểu hiện trên động vật có vú. Một số promoter được bổ sung vào các vector biểu hiện (nguồn: Gerstein, 2001 [15]) Promoter Hệ vector gốc Độ mạnh* EF-1α Nhân tố kéo dài 1α ở người 40-160 CMV Cytomegalovirut 4 RSV Virut LTR rous sarcoma 2 SV40 muộn Gen muộn của virut simian 40 1.1 SV40 sớm Gen sớm của virut simian 40 1 * Promoter SV40 sớm được coi là có độ mạnh là 1để so sánh với các promoter khác.
Nhiều tín hiệu kết thúc phiên mã của sinh vật nhân sơ đã được nghiên cứu và được sử dụng rộng rãi trong các vector biểu hiện. Ở sinh vật nhân chuẩn, trình tự ATCAAA(A/T)TAGGAAGA đã được xác định là vùng kết thúc phiên mã của chín gen được nghiên cứu [36]. Đuôi polyadenin – polyA (50-250 phân tử adenyl nối tiếp nhau) thêm sau mARN có vai trò quan trọng giúp ổn định và dịch chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất để dịch mã. Mặc dù trình tự polyA cách xa điểm khởi đầu dịch mã nhưng nó có tác dụng tăng cường sự tái hoạt động của ribosom nên trực tiếp làm tăng cường hiệu suất dịch mã [1].
Có một số tín hiệu polyadenin hóa hiệu quả đã được sử dụng trong vector biểu hiện của động vật có vú có nguồn gốc từ gen mã cho hoóc môn tăng trưởng của bò, β- globin chuột, đơn vị phiên mã sớm của SV40 và gen mã cho thymidine kinase của Herpes simplex. 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.3 Mở rộng và đa dạng hóa các vùng nhân dòng đa điểm Các phiên bản vector đầu tiên dựa trên trình tự nguyên gốc của plasmit hoặc phage có vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site-MCS) rất hạn chế. Các vị trí nhân dòng đa điểm là nơi mà các enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu tái bản để tránh bị cắt nhầm.
Để thuận lợi cho quá trình nhân dòng gen ngoại lai, các vector gốc thường được bổ sung thêm các đoạn nối (linker) mang vị trí nhân dòng đa điểm mới. Các vị trí nhân dòng đa điểm mới phải đảm bảo không có trong trình tự gốc của vector, ưu tiên cho các enzym giới hạn tạo được đầu tương thích với nhiều enzym giới hạn khác [2].4 Thêm các vùng gen giúp sàng lọc thể tái tổ hợp Các gen kháng kháng sinh giúp chọn lọc các dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp thường được thêm vào hầu hết các vector. Các gen kháng kháng sinh hay được sử dụng là gen mã họ kháng sinh penicillin (bao gồm ampicillin) tác động ức chế hình thành thành tế bào vi khuẩn hoặc kanamycin, tetracyclin và chloramphenicol ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn thông qua ức chế sinh tổng hợp protein vi khuẩn. Các gen báo cáo (reporter genes) giúp xác định plasmit có chứa đoạn chèn gen ngoại lai mong muốn cũng có thể được cài vào vector.
Gen lacZ là một gen báo cáo điển hình, mã hóa cho β-galactosidase có khả năng cắt galactose. Vị trí nhân dòng đa điểm nằm trong gen LacZ và nếu đoạn chèn được cài thành công vào vector sẽ làm bất hoạt β-galactosidase. Chính vì vậy, tế bào chứa vetor có đoạn chèn quan tâm có thể được xác định bằng phương pháp chọn khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường chứa X-gal [2].