Luận văn thạc sĩ nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán virus epstein barr

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán virus epstein barr, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Phạm Thị Trà
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Vân Anh
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV)
• 1.1.1. Giới thiệu chung về EBV
• 1.1.2. Vai trò gây ung thư vòm mũi họng của EBV
• 1.1.3. Quá trình nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV
• 1.1.4. Các phương pháp phát hiện EBV
• 1.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO TỪ VÀ ỨNG DỤNG
• 1.2.1. Hạt nano từ
• 1.2.2. Các phương pháp chế tạo hạt nano từ
• 1.2.2.1. Phương pháp nghiền
• 1.2.2.2. Phương pháp đồng kết tủa
• 1.2.2.3. Phương pháp vi nhũ tương
• 1.2.3. Ứng dụng hạt nano từ trong lĩnh vực y sinh
• 1.2.3.1. Phân tách và chọn lọc tế bào
• 1.2.3.2. Dẫn truyền thuốc
• 1.2.3.3. Tăng thân nhiệt cục bộ
• 1.2.3.4. Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ
• 1.3. VAI TRÒ CỦA VIỆC TINH SẠCH AXIT NUCLEIC
• 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH VÀ LÀM GIÀU AXIT NUCLEIC CỦA SINH VẬT
• 1.4.1. Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng dung môi hữu cơ
• 1.4.2. Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng màng xốp silica
• 1.4.3. Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng hạt từ nano bọc silica
• 1.4.4. Điều kiện và cơ chế phân tử ADN hấp thụ lên bề mặt hạt nano từ bọc silica
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ BỌC SILICA TINH SẠCH AXÍT NUCLEIC
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các hóa chất, nguyên liệu khác
• 2.2. Máy móc và thiết bị
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP
• 2.3.1. Tách chiết axit nucleic
• 2.3.2. Tách chiết ADN bằng MinElute Virus Spin Kit
• 2.3.3. Tách chiết ADN bằng kít Dynabead Myone SILANE®
• 2.3.4. Tách chiết ADN bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit
• 2.3.5. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR
• 2.3.6. Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T easy
• 2.3.7. Tinh sạch plasmid theo kít của Qiagen
• 2.3.8. Giải trình trình tự gen đã được nhân dòng
• 2.3.9. Định lượng gen đích bằng kỹ thuật PCR tại thời điểm (Real-time PCR)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN EBNA-2 KÍCH THƯỚC 250 BP ĐẶC HIỆU CHO EBV
• 3.1.1. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập
• 3.1.2. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với một lần PCR và một chu trình nhiệt duy nhất
• 3.1.3. Kết quả nhân dòng đoạn gen EBNA-2/250
• 3.2. KẾT QUẢ NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN MÀNG BNRF1 p143 KHÔNG CHỨA NHÓM GLYCOSYL KÍCH THƯỚC 74 bp (EBV-74)
• 3.2.1. Nhân bản đoạn gen EBV-74
• 3.2.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen EBV-74
• 3.3. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT
• 3.3.1. ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG PCR
• 3.3.2. SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR
• KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV

Nghiên cứu về hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y sinh. Virus Epstein-Barr (EBV) là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến, liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như ung thư vòm họng và lymphoma. Việc ứng dụng công nghệ nano vào chẩn đoán giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện virus này. Hạt từ nano có khả năng tương tác tốt với axit nucleic, từ đó hỗ trợ trong việc tách chiết và phân tích mẫu bệnh phẩm.

1.1. Giới thiệu về virus EBV và tầm quan trọng của nghiên cứu

Virus EBV, thuộc họ Herpesviridae, có khả năng gây nhiễm và tồn tại trong cơ thể người. Nghiên cứu về virus này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả. Việc phát hiện sớm virus EBV có thể giúp cải thiện kết quả điều trị và tiên lượng bệnh.

1.2. Hạt từ nano và ứng dụng trong y sinh

Hạt từ nano là những vật liệu có kích thước nhỏ, thường dưới 100 nm, với tính năng từ tính nổi bật. Chúng được sử dụng trong nhiều ứng dụng y sinh, bao gồm tách chiết axit nucleic và dẫn truyền thuốc. Việc sử dụng hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV giúp tăng cường độ nhạy và độ chính xác của các phương pháp xét nghiệm.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán virus EBV hiện nay

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong công nghệ chẩn đoán, việc phát hiện virus EBV vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống như ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, dẫn đến khó khăn trong việc chẩn đoán sớm. Hơn nữa, sự tồn tại của virus trong trạng thái tiềm tàng làm cho việc phát hiện trở nên phức tạp hơn. Do đó, cần thiết phải phát triển các phương pháp mới, hiệu quả hơn để giải quyết vấn đề này.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như ELISA và PCR thường gặp khó khăn trong việc phát hiện virus ở giai đoạn đầu. Đặc biệt, kháng thể IgM chỉ xuất hiện trong thời gian ngắn sau khi nhiễm, làm giảm khả năng phát hiện sớm. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán thường diễn ra ở giai đoạn muộn, ảnh hưởng đến kết quả điều trị.

2.2. Tình trạng kháng thuốc và sự biến đổi của virus

Virus EBV có khả năng biến đổi gen, dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Điều này làm cho việc phát hiện và điều trị trở nên khó khăn hơn. Nghiên cứu về hạt từ nano có thể giúp phát triển các phương pháp chẩn đoán mới, hiệu quả hơn trong việc phát hiện các biến thể của virus.

III. Phương pháp nghiên cứu hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV

Nghiên cứu này sử dụng các hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt để tách chiết axit nucleic từ mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả tách chiết mà còn giảm thiểu thời gian thao tác. Các hạt từ nano được bọc silica giúp tăng cường khả năng tương tác với axit nucleic, từ đó cải thiện độ nhạy của phương pháp chẩn đoán.

3.1. Quy trình chế tạo hạt từ nano

Quy trình chế tạo hạt từ nano bao gồm các bước như nghiền, đồng kết tủa và vi nhũ tương. Các phương pháp này giúp tạo ra hạt nano đồng nhất, có kích thước nhỏ và tính năng từ tính cao, phù hợp cho ứng dụng trong y sinh.

3.2. Phương pháp tách chiết axit nucleic bằng hạt từ nano

Phương pháp tách chiết axit nucleic sử dụng hạt từ nano bọc silica cho phép thu được axit nucleic tinh sạch từ mẫu bệnh phẩm. Kết quả cho thấy phương pháp này có độ chính xác cao, giúp phát hiện virus EBV hiệu quả hơn so với các phương pháp truyền thống.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của hạt từ nano

Kết quả nghiên cứu cho thấy hạt từ nano có khả năng tách chiết axit nucleic từ virus EBV với độ chính xác cao. Việc ứng dụng hạt từ nano trong chẩn đoán không chỉ giúp phát hiện virus sớm mà còn hỗ trợ trong việc điều trị và tiên lượng bệnh. Các bộ kít tách chiết dựa trên hạt từ nano có thể được phát triển để sử dụng rộng rãi trong các cơ sở y tế.

4.1. Đánh giá hiệu quả của phương pháp tách chiết

Kết quả cho thấy phương pháp tách chiết axit nucleic bằng hạt từ nano có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. So với các bộ kít thương mại, bộ kít tự chế tạo cho thấy hiệu quả tương đương, nhưng với chi phí thấp hơn.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Hạt từ nano không chỉ được sử dụng trong chẩn đoán virus EBV mà còn có thể ứng dụng trong các lĩnh vực khác như dẫn truyền thuốc và điều trị ung thư. Việc phát triển các bộ kít tách chiết dựa trên hạt từ nano sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong y sinh.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu hạt từ nano

Nghiên cứu về hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV đã mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực y sinh. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả hơn sẽ giúp nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện công nghệ và ứng dụng của hạt từ nano trong y học.

5.1. Tương lai của công nghệ nano trong y sinh

Công nghệ nano hứa hẹn sẽ mang lại nhiều đột phá trong y sinh, từ chẩn đoán đến điều trị. Việc nghiên cứu và phát triển các hạt từ nano mới có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình chế tạo hạt từ nano và mở rộng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau. Việc hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và cơ sở y tế sẽ giúp thúc đẩy nhanh chóng ứng dụng công nghệ này trong thực tiễn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Virus Epstein Barr (EBV) là tác nhân gây nhiều bệnh lý nghiêm trọng như ung thư vòm mũi họng, Burkitt lymphoma và các bệnh lý liên quan đến tế bào lympho B. Theo báo cáo của ngành y tế, tỷ lệ nhiễm EBV ở người dân Việt Nam và khu vực Đông Nam Á là khá cao, đặc biệt trong các bệnh nhân ung thư vòm họng. Việc phát hiện và định lượng EBV trong mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp phát hiện truyền thống như ELISA có nhiều hạn chế về độ nhạy và tính đặc hiệu, đặc biệt trong giai đoạn nhiễm muộn.

Trong bối cảnh đó, công nghệ nano từ tính được chức năng hóa bề mặt bằng silica (hạt MagSi nano) đã được nghiên cứu nhằm cải thiện hiệu quả tách chiết axit nucleic của EBV từ mẫu máu bệnh nhân. Nghiên cứu này tập trung xây dựng và thử nghiệm bộ kít Virus Magnet Nano Kit dựa trên hạt nano từ bọc silica để tách chiết ADN EBV, đồng thời phát triển phương pháp phát hiện định tính và định lượng EBV bằng PCR và Real-time PCR. Phạm vi nghiên cứu bao gồm 40 mẫu máu từ bệnh nhân có xét nghiệm dương tính với kháng thể IgG-VCA EBV và bệnh nhân ung thư vòm họng tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội trong giai đoạn 2009-2011.

Mục tiêu chính của nghiên cứu là nâng cao độ nhạy, độ chính xác và tiết kiệm thời gian trong quy trình tách chiết và phát hiện EBV, góp phần hỗ trợ công tác chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan đến virus này. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc phát triển các bộ kít chẩn đoán EBV với chi phí hợp lý, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết và mô hình chính:

1. Lý thuyết về virus Epstein Barr (EBV): EBV thuộc họ Herpesviridae, có hệ gen ADN sợi đôi kích thước khoảng 184 kb, chứa các gen mã hóa protein nhân (EBNA) và protein màng tiềm tàng (LMP). Gen EBNA-2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và biến đổi tế bào lympho B, là mục tiêu ưu tiên trong phát hiện virus. EBV tồn tại ở trạng thái tiềm tàng hoặc hoạt động, gây ra các bệnh lý khác nhau tùy theo điều kiện miễn dịch của người nhiễm.

2. Lý thuyết về hạt nano từ bọc silica trong tách chiết axit nucleic: Hạt nano từ Fe3O4 có kích thước nano (~20 nm) được chức năng hóa bề mặt bằng silica tạo thành hạt MagSi nano. Trong môi trường có nồng độ muối cao và pH < 7, các phân tử ADN liên kết bền vững với bề mặt silica qua lực hút tĩnh điện giữa ion guanidinium và nhóm phosphate của ADN. Việc sử dụng hạt nano từ giúp tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, nâng cao hiệu quả tách chiết, đồng thời cho phép thao tác nhanh chóng và tự động hóa nhờ nam châm từ thay thế cho máy ly tâm.

Các khái niệm chính bao gồm: nested PCR, Real-time PCR, hạt nano từ tính, tách chiết axit nucleic, và phát hiện định lượng virus.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 40 mẫu máu từ bệnh nhân có xét nghiệm dương tính với kháng thể IgG-VCA EBV và bệnh nhân ung thư vòm họng tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội.

• Phương pháp tách chiết axit nucleic: So sánh ba bộ kít tách chiết ADN EBV gồm MinElute® Virus Spin Kit (màng xốp silica), Dynabeads Myone SILANE® (hạt nano từ bọc silica thương mại), và Virus Magnet Nano Kit (bộ kít tự chế tạo sử dụng hạt MagSi nano). Mỗi bộ kít được sử dụng theo quy trình chuẩn của nhà sản xuất hoặc quy trình nghiên cứu.

• Phương pháp phân tích:

  • Nhân bản đoạn gen đặc hiệu EBNA-2/250 bằng nested PCR (hai lần PCR độc lập) và nested PCR một lần (một chu trình nhiệt duy nhất).
  • Nhân bản đoạn gen mã hóa protein màng BNRF1 (EBV-74) bằng PCR.
  • Định lượng gen đích bằng kỹ thuật Real-time PCR sử dụng TaqMan probe đặc hiệu cho đoạn gen EBV-74.
  • Giải trình tự gen nhân dòng để xác nhận tính đặc hiệu của sản phẩm PCR.

• Timeline nghiên cứu: Tiến hành từ năm 2009 đến 2011, bao gồm thu thập mẫu, tách chiết ADN, thực hiện PCR, giải trình tự và phân tích dữ liệu.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: 40 mẫu máu được chọn dựa trên kết quả xét nghiệm IgG-VCA dương tính và chẩn đoán lâm sàng ung thư vòm họng, đảm bảo tính đại diện cho nhóm nghiên cứu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Nhân bản đoạn gen EBNA-2/250 bằng nested PCR hai lần độc lập: Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy băng đặc hiệu kích thước 250 bp xuất hiện rõ ràng ở mẫu bệnh nhân, không có băng ở đối chứng âm tính, chứng tỏ thành công trong nhân bản đoạn gen đặc hiệu EBV. Tỷ lệ thành công đạt khoảng 95% trên tổng số mẫu thử.

2. Chuyển đổi thành công nested PCR một lần chu trình nhiệt duy nhất: Phương pháp này rút ngắn thời gian và giảm chi phí hóa chất so với nested PCR hai lần, vẫn giữ được độ nhạy và đặc hiệu cao, với tỷ lệ phát hiện dương tính tương đương (khoảng 90%).

3. So sánh hiệu quả tách chiết ADN EBV của ba bộ kít: Virus Magnet Nano Kit cho kết quả tách chiết ADN với nồng độ trung bình 15 ng/µl, cao hơn MinElute® (12 ng/µl) và tương đương Dynabeads Myone SILANE® (14 ng/µl). Độ tinh sạch (tỷ lệ A260/A280) của Virus Magnet Nano Kit đạt 1.8, vượt trội so với MinElute® (1.6) và tương đương Dynabeads (1.7).

4. Định lượng Real-time PCR: Số copies ADN EBV trong mẫu tách chiết bằng Virus Magnet Nano Kit trung bình đạt 1.2 x 10^5 copies/ml, cao hơn MinElute® (9.5 x 10^4 copies/ml) và tương đương Dynabeads (1.1 x 10^5 copies/ml), cho thấy hiệu quả tách chiết và phát hiện virus của bộ kít tự chế tạo là rất khả quan.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy hạt nano từ bọc silica (MagSi nano) trong bộ kít Virus Magnet Nano Kit có khả năng tách chiết axit nucleic EBV hiệu quả, tương đương hoặc vượt trội so với các bộ kít thương mại đắt tiền. Nguyên nhân chính là do kích thước hạt nano nhỏ (~20 nm) và diện tích bề mặt lớn giúp tăng khả năng hấp thụ ADN, đồng thời thao tác sử dụng nam châm từ thay cho ly tâm giúp giảm thời gian và tăng tính đồng nhất trong xử lý mẫu.

Phương pháp nested PCR một lần chu trình nhiệt duy nhất được tối ưu hóa giúp giảm chi phí và thời gian xét nghiệm, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm tại Việt Nam. Kết quả định lượng Real-time PCR khẳng định độ nhạy và độ chính xác của phương pháp phát hiện EBV dựa trên bộ kít tự chế tạo.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả này phù hợp với báo cáo của các nhóm nghiên cứu về ứng dụng hạt nano từ trong tách chiết axit nucleic virus, đồng thời mở ra hướng phát triển bộ kít chẩn đoán EBV giá thành thấp, hiệu quả cao.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh nồng độ ADN tách chiết và số copies virus giữa các bộ kít, cũng như bảng tổng hợp kết quả PCR và Real-time PCR.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển và thương mại hóa bộ kít Virus Magnet Nano Kit: Tập trung hoàn thiện quy trình sản xuất hạt MagSi nano và bộ đệm đi kèm, nhằm cung cấp bộ kít tách chiết axit nucleic EBV với chi phí thấp, thời gian thao tác ngắn, phục vụ các phòng xét nghiệm trong nước. Thời gian thực hiện dự kiến 1-2 năm, chủ thể thực hiện là các trung tâm nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

2. Áp dụng phương pháp nested PCR một lần chu trình nhiệt duy nhất trong chẩn đoán lâm sàng: Khuyến khích các phòng xét nghiệm áp dụng kỹ thuật này để nâng cao hiệu quả phát hiện EBV, giảm chi phí và thời gian xét nghiệm. Đào tạo kỹ thuật viên và cập nhật quy trình chuẩn là cần thiết.

3. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng hạt nano từ bọc silica cho các virus khác: Nghiên cứu khả năng tách chiết axit nucleic của các virus như viêm gan B, viêm gan C, HIV bằng bộ kít tương tự để đa dạng hóa sản phẩm và tăng tính ứng dụng. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và trường đại học.

4. Tăng cường hợp tác quốc tế và chuyển giao công nghệ: Hợp tác với các công ty công nghệ sinh học hàng đầu để nâng cao chất lượng hạt nano từ và bộ kít, đồng thời học hỏi kinh nghiệm tự động hóa quy trình tách chiết axit nucleic. Thời gian thực hiện 3-5 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học phân tử, công nghệ nano y sinh: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về ứng dụng hạt nano từ trong tách chiết axit nucleic và phát hiện virus, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển sản phẩm mới.

2. Phòng xét nghiệm y học và bệnh viện: Áp dụng các phương pháp tách chiết và phát hiện EBV hiệu quả, tiết kiệm chi phí, nâng cao chất lượng chẩn đoán bệnh lý liên quan đến EBV.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình chế tạo hạt nano từ bọc silica và phát triển bộ kít tách chiết axit nucleic, từ đó phát triển sản phẩm thương mại phù hợp với thị trường trong nước.

4. Cơ quan quản lý y tế và chính sách: Đánh giá tiềm năng ứng dụng công nghệ nano trong chẩn đoán y học, từ đó xây dựng chính sách hỗ trợ nghiên cứu và ứng dụng công nghệ mới trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Hạt nano từ bọc silica có ưu điểm gì so với phương pháp tách chiết truyền thống?
   Hạt nano từ bọc silica có diện tích bề mặt lớn, giúp tăng hiệu quả hấp thụ axit nucleic, thao tác nhanh chóng nhờ sử dụng nam châm từ thay cho ly tâm, tiết kiệm thời gian và chi phí. Ví dụ, Virus Magnet Nano Kit cho kết quả tách chiết ADN EBV cao hơn 20% so với phương pháp màng xốp silica truyền thống.

2. Phương pháp nested PCR một lần chu trình nhiệt duy nhất có độ nhạy như thế nào?
   Phương pháp này giữ được độ nhạy và đặc hiệu cao tương đương nested PCR hai lần, giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm và giảm chi phí hóa chất, phù hợp cho ứng dụng lâm sàng và nghiên cứu.

3. Bộ kít Virus Magnet Nano Kit có thể áp dụng cho các loại virus khác không?
   Có thể. Nguyên lý tách chiết axit nucleic bằng hạt nano từ bọc silica là phổ quát, do đó bộ kít có thể được điều chỉnh để tách chiết ADN/ARN của các virus khác như HBV, HCV, HIV, giúp mở rộng ứng dụng trong chẩn đoán phân tử.

4. Chi phí sử dụng bộ kít tự chế tạo so với bộ kít thương mại như thế nào?
   Bộ kít tự chế tạo có chi phí thấp hơn đáng kể do sử dụng nguyên liệu trong nước và quy trình đơn giản, giúp giảm chi phí xét nghiệm, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm tại Việt Nam.

5. Làm thế nào để đảm bảo độ chính xác khi sử dụng bộ kít mới?
   Cần thực hiện kiểm định chất lượng nghiêm ngặt, so sánh kết quả với các bộ kít thương mại chuẩn, đào tạo kỹ thuật viên và áp dụng quy trình chuẩn trong phòng xét nghiệm. Ví dụ, nghiên cứu đã so sánh Virus Magnet Nano Kit với MinElute® và Dynabeads Myone SILANE® cho thấy kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công bộ kít Virus Magnet Nano Kit sử dụng hạt nano từ bọc silica để tách chiết axit nucleic EBV với hiệu quả cao, tương đương bộ kít thương mại đắt tiền.
• Phương pháp nested PCR một lần chu trình nhiệt duy nhất được tối ưu hóa giúp phát hiện định tính EBV nhanh chóng, chính xác.
• Kỹ thuật Real-time PCR kết hợp với bộ kít tự chế tạo cho phép định lượng chính xác số lượng virus trong mẫu bệnh phẩm.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển bộ kít chẩn đoán EBV giá thành thấp, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm trong nước.
• Đề xuất tiếp tục hoàn thiện sản phẩm, mở rộng ứng dụng cho các virus khác và hợp tác chuyển giao công nghệ trong 1-3 năm tới.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các phòng xét nghiệm và doanh nghiệp công nghệ sinh học áp dụng và phát triển bộ kít, đồng thời tiến hành các nghiên cứu mở rộng để nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị các bệnh do EBV gây ra.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Công nghệ nano ngày nay đang có những bƣớc tiến rất quan trọng, đặc biệt là vật liệu nano ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi ở mọi lĩnh vực. Một trong những hƣớng đi quan trọng của công nghệ nano là ứng dụng của nó trong Y – sinh bao gồm sử dụng vật liệu nano vào các nghiên cứu, công cụ dẫn thuốc, liệu pháp điều trị, chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh [6, 14, 29, 33] nhằm mục đích cải thiện và nâng cao sức khỏe của con ngƣời. Trong số đó, các hạt nano từ tính đƣợc chức năng hóa bề mặt đã và đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong những năm gần đây, ví dụ nhƣ tách chiết axít nucleic (ADN, ARN), phân tách tế bào, vận chuyển thuốc, liệu pháp trị nhiệt từ và nhiều ứng dụng khác nữa [3, 21, 26, 33]. Việc tinh sạch axít nucleic của vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm là một bƣớc rất quan trọng vì các nghiên cứu, xét nghiệm sinh học phân tử bằng PCR, Real-time PCR đều cần đến nguồn axit nucleic tinh sạch.

Vì vậy, rất nhiều phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch axít nucleic đã đƣợc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng rộng rãi, trong đó phƣơng pháp do René Boom và cộng sự phát minh vào năm 1990 là phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất. Nguyên lý của phƣơng pháp này dựa trên khả năng hình thành liên kết bền vững của hạt silica với axít nucleic thông qua cầu nối cation trong môi trƣờng có nồng độ muối cao [8, 9]. Một cải tiến mang tính đột phá của phƣơng pháp Boom đƣợc nhiều công ty công nghệ sinh học hàng đầu trên thế giới nhƣ Roche, Invitrogen, Promega, phát triển là sử dụng hạt nano từ tính bọc Khoa Sinh häc 4 Khãa 2009 - 2011 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ silica để tinh sạch axít nucleic, giúp nâng cao hiệu quả tách chiết và tiết kiệm thời gian thao tác. Đặc biệt, cải tiến này đã giúp chế tạo đƣợc các máy tự động tách chiết và tinh sạch axít nucleic [27, 39].

Tuy nhiên, giá thành của các bộ kít tinh sạch axít nucleic bằng hạt nano từ bọc silica rất cao. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển bộ kít tách chiết axit dựa trên nguyên lý hạt từ bọc silica có ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tiễn cao giúp cho việc giảm chi phí trong khâu tách chiết, chủ động cung cấp kít tách chiết axit nucleic khi cần. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xử lý hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng silica (Silica-coated magnetic nano-particles) hay còn gọi là hạt Magsi nano do nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên chế tạo và bộ đệm thích hợp (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu phòng Sinh học nano và Ứng dụng) để thử nghiệm khả năng tách chiết axit nucleic của virus Epstein Barr trong các bệnh phẩm của bệnh nhân ghi nhiễm EBV. EBV là virus truyền nhiễm trên ngƣời, lây truyền qua đƣờng ăn uống, tiếp xúc.

EBV liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng nhƣ: ung thƣ vòm họng, Burkitt lymphoma, ung thƣ lymphoma và các trạng thái biến đổi tế bào lympho [1]. ADN tách chiết bởi bộ kít Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt Magsi nano và bộ đệm thích hợp sẽ đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR và Real-time PCR để phát hiện và định lƣợng nồng độ EBV trong máu hay các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm, hỗ trợ trong công tác chẩn đoán, điều trị, tiên lƣợng các bệnh liên quan đến EBV. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr’’ với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện định tính và định lƣợng EBV bằng PCR và Real-time PCR.

Khoa Sinh häc 5 Khãa 2009 - 2011 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ 2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu bằng bộ kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt (cụ thể là hạt từ nano đƣợc bọc silica hay còn ký hiệu MagSi nano) và bộ đệm kèm theo (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng thử nghiệm trên đối tƣợng HBV, HCV). So sánh khả năng tách chiết ADN EBV bằng kỹ thuật PCR, Real-time PCR với nguồn ADN khuôn tách bằng ba bộ kít: MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabead Myone Silane® Kit của hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano Kit trong cùng điều kiện thí nghiệm Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV) 1.

Giới thiệu chung về EBV Hình 1.1: Hình ảnh Epstein Barr Virus dƣới kính hiển vi điện tử [47] Khoa Sinh häc 6 Khãa 2009 - 2011 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ Năm 1958, Burkitt phát hiện ra khối u lympho xƣơng hàm trên ở trẻ em Châu Phi, từ đó bệnh này đƣợc mang tên ông: Burkitt’s Lymphoma (BL). Vào năm 1964 nhóm tác giả Epstein, Barr và Pulvertaft phân lập đƣợc loại virus ở dòng lymphoblastes trong khối u LB (Lympho’s Burkitt) bằng kính hiển vi điện tử [15]. Từ đó virus này đƣợc mang tên là Epstein Barr Virus. Năm 1975, tác giả Nadol và cs phân lập đƣợc các hạt (virion) của EBV trong tế bào biểu mô ung thƣ vòm bằng kính hiển vi điện tử.

Đây là lần đầu ngƣời ta quan sát đƣợc các thể virus thuộc họ Herpesviridae trong tế bào ung thƣ ở ngƣời, do đó EBV bị nghi ngờ là nguyên nhân gây ung thƣ ở ngƣời [1]. EBV thuộc họ virus Herpesviridae, có hệ gen thuộc loại ADN sợi đôi xoắn kép mạch hở, kích thƣớc hệ gen khoảng 184 kb nếu tính cả phần lặp lại ở hai đầu. Hệ gen EBV có 6 tổ hợp gen mã hóa cho các loại protein kháng nguyên nhân (Epstein Barr Virus nuclear antigen), đƣợc ký hiệu là: EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB và 3 gen mã hóa cho protein màng tiềm tàng (latent membral protein), đƣợc ký hiệu là: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B [13]. Vai trò của sáu protein EBNA có liên quan đến quá trình nhân lên của EBV trong tế bào lympho B ở giai đoạn đầu xâm nhiễm còn 3 loại protein LMP có liên quan đến chu kỳ nhân lên của EBV trong tế bào lympho B.

Gen mã hóa cho protein EBNA-2 là một phân đoạn cơ bản trong gen EBNA của hệ gen EBV. EBNA -2 có vai trò biệt hóa tế bào lympho B thành tế bào mầm non hóa để EBV thực hiện quá trình gây ung thƣ. Hơn nữa gen EBNA-2 là gen đƣợc sao chép sớm nhất do vai trò của nó trong quá trình điều tiết sự nhân lên của tế bào bị nhiễm. EBNA-2 điều hòa quá trình sao chép gen và tổng hợp protein của cả virus và tế bào bị nhiễm EBV, protein EBNA-2 đƣợc coi là yếu tố quan trọng trong cảm ứng tăng sinh dòng tế bào lympho B [25].

Khoa Sinh häc 7 Khãa 2009 - 2011 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ Toàn bộ hệ gen EBV đƣợc chứa trong một vỏ capsid. Vỏ capsid này có hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín bảo vệ nhân ADN của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV (kháng nguyên VCA), đƣợc xác định bởi 20 mặt bên, 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng. Vỏ capsid lại đƣợc bao bọc bởi một vỏ bao ngoài khác gọi là vỏ ngoài (envelope) cấu trúc từ thành phần chủ yếu là glycoprotein. Vỏ bao ngoài này cũng đƣợc mã hóa bởi gen virus và cũng mang dấu ấn miễn dịch (hình 1.2: Cấu trúc của EBV [43] Giữa vỏ capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng các protein đệm cấu trúc và các enzyme của virus (Tegument).

Vỏ ngoài của EBV có sự nhạy cảm với các tác động của axit, ether, các dung dịch hòa tan sát khuẩn và đông khô [13]. EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên ngƣời và lây truyền qua đƣờng tiêu hóa, tiếp xúc. Do đó, virus này thƣờng đƣợc phát hiện thấy trong chất thải tế bào và chất tiết ở phần trên của hệ tiêu hóa và hô hấp nhƣ nƣớc bọt, niêm dịch vùng họng. EBV có đặc tính hƣớng bạch huyết hấp phụ lên tế bào lympho B thông qua tƣơng tác của glycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể CR2/CR21 của bổ thể CD3 trên tế bào lympho B của ngƣời (hình 1.

Khoa Sinh häc 8 Khãa 2009 - 2011 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ Hình 1.3: Sự hấp phụ của EBV lên tế bào lympho B qua thụ thể CR21 [46] EBV ở trạng thái tiềm tan, nhiều bản sao ADN của EBV đƣợc tìm thấy trong tế bào chất của những tế bào lympho B bị nhiễm nhƣng chỉ có vài gen đƣợc sao chép. EBV có thể gây nhiễm ở dạng tiềm tan và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh. Nhƣng trong những cơ thể có thể trạng hệ miễn dịch suy yếu thì EBV có thể là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM-infectious mononucleosis), liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thƣ nhƣ tăng lympho B, UTVMH, Burkitt lymphoma. Đặc trƣng của các khối u trong các bệnh ung thƣ này là trong các tế bào của khối u có chứa một lƣợng lớn các bản sao hệ gen EBV và xuất hiện sự biểu hiện nhiều protein có vai trò chuyển hóa khối u từ lành tính thành khối u ác tính [25].

Về mặt sinh bệnh học, sự nhiễm virus xảy ra đầu tiên ở vùng miệng, hầu rồi lan vào máu, tại đây tế bào lympho B bị nhiễm. Sự đáp ứng miễn dịch đầu tiên trong nhiễm EBV là cơ thể sinh kháng thể IgM chống lại kháng nguyên VCA của EBV, đáp ứng kháng thể IgM chỉ xuất hiện trong vài tuần đầu sau khi nhiễm, tiếp theo là kháng thể IgG và kháng thể IgG này tồn tại suối đời ngƣời nhiễm [19]. EBV thƣờng gây ra nhiễm trùng cấp ở vùng miệng họng, có thể hoặc không biểu hiện triệu chứng gì. Sau quá trình nhiễm đó EBV tồn tại tiềm tàng trong các tế bào biểu Khoa Sinh häc 9 Khãa 2009 - 2011 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ mô hoặc lympho B.

Tùy theo hoàn cảnh hoặc tình trạng bệnh lý đặc biệt ở những ngƣời bị suy giảm miễn dịch ví dụ do HIV/ AIDS, bị suy dinh dƣỡng, hay ngƣời phụ nữ nhiễm mà mang thai thì EBV tái hoạt hóa trở lại.