Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phương pháp định lượng glycoside tim tại Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn

• Tác giả: Bùi Thị Tâm
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Ri
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim. Cấu tạo, tên gọi
• 1.2. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim
• 1.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng
• 1.4. Tính chất của glycoside tim
• 1.5. Phân bố trong tự nhiên
• 1.6. Một số loại thuốc chứa glycoside tim. Khái quát về digoxin và digitoxin
• 1.7. Các phương pháp xác định glycoside tim
• 1.7.1. Phương pháp sắc kí xác định glycoside tim
• 1.7.2. Phương pháp khác xác định glycoside tim
• 1.7.3. Phương pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thực
• 1.7.4. Phương pháp định tính và định lượng
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị
• 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3. Phương pháp phân tích
• 2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu
• 2.3.2. Phương pháp phân tích. Khảo sát điều kiện tối ưu
• 2.3.3. Xây dựng đường chuẩn. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu hoá các điều kiện chạy sắc ký
• 3.1.1. Bước sóng hấp thụ cực đại của các glycoside tim
• 3.1.2. Khảo sát và chọn thành phần pha động và tốc độ dòng
• 3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị
• 3.2. Điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích các glycoside tim
• 3.3. Đường chuẩn các glycoside tim
• 3.4. Khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất
• 3.5. Dựng đường chuẩn. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
• 3.6. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3.6.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích
• 3.6.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp
• 3.7. Phân tích mẫu thực tế
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu glycoside tim trong dược phẩm

Glycoside tim là một nhóm hợp chất tự nhiên có tác dụng quan trọng trong y học, đặc biệt trong điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch. Chúng được chiết xuất từ nhiều loại cây khác nhau và có cấu trúc hóa học phức tạp. Nghiên cứu về glycoside tim không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng của chúng mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị bệnh tim.

1.1. Khái quát về glycoside tim và cấu trúc hóa học

Glycoside tim bao gồm hai phần chính: aglycon và phần đường. Phần aglycon thường có cấu trúc steroid, trong khi phần đường có thể là nhiều loại monosaccharid khác nhau. Sự kết hợp giữa hai phần này quyết định tính chất và tác dụng của glycoside tim.

1.2. Tác dụng dược lý của glycoside tim

Glycoside tim có tác dụng cường tim, làm chậm nhịp tim và điều hòa nhịp tim. Tuy nhiên, nếu sử dụng quá liều, chúng có thể gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng, thậm chí tử vong. Việc hiểu rõ tác dụng của glycoside tim là rất quan trọng trong điều trị bệnh tim.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu glycoside tim

Mặc dù glycoside tim có nhiều ứng dụng trong y học, nhưng việc xác định chính xác hàm lượng của chúng trong dược phẩm và dược liệu vẫn gặp nhiều khó khăn. Các phương pháp phân tích hiện tại chưa đủ nhạy và chính xác để đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

2.1. Khó khăn trong việc định lượng glycoside tim

Việc định lượng glycoside tim trong dược phẩm thường gặp khó khăn do sự đa dạng về cấu trúc và tính chất của chúng. Các phương pháp phân tích như HPLC cần được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ chính xác cao.

2.2. Nguy cơ ngộ độc do glycoside tim

Glycoside tim có thể gây ngộ độc nếu sử dụng không đúng liều lượng. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích chính xác là cần thiết để giảm thiểu nguy cơ này.

III. Phương pháp nghiên cứu glycoside tim hiệu quả

Để nghiên cứu glycoside tim, các phương pháp phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được áp dụng. Phương pháp này cho phép xác định chính xác hàm lượng glycoside tim trong các mẫu dược phẩm và dược liệu.

3.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

HPLC là một trong những phương pháp phân tích phổ biến nhất để xác định glycoside tim. Phương pháp này cho phép tách biệt và định lượng các hợp chất trong mẫu một cách nhanh chóng và chính xác.

3.2. Các phương pháp phân tích khác

Ngoài HPLC, còn có nhiều phương pháp khác như sắc ký khí (GC) và quang phổ khối (MS) cũng được sử dụng để phân tích glycoside tim. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu.

IV. Ứng dụng thực tiễn của glycoside tim trong y học

Glycoside tim, đặc biệt là digoxin và digitoxin, đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh tim mạch. Chúng giúp cải thiện chức năng tim và giảm triệu chứng của bệnh nhân suy tim.

4.1. Ứng dụng của digoxin trong điều trị bệnh tim

Digoxin là một trong những glycoside tim phổ biến nhất, được sử dụng để điều trị suy tim sung huyết và loạn nhịp tim. Nghiên cứu cho thấy digoxin có tác dụng tích cực trong việc cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

4.2. Digitoxin và vai trò của nó trong y học

Digitoxin cũng là một glycoside tim quan trọng, có tác dụng tương tự như digoxin. Tuy nhiên, digitoxin có thời gian bán thải dài hơn, điều này cần được xem xét khi sử dụng trong điều trị.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu glycoside tim

Nghiên cứu glycoside tim vẫn đang tiếp tục phát triển, với nhiều tiềm năng trong việc cải thiện các phương pháp điều trị bệnh tim. Việc tối ưu hóa các phương pháp phân tích sẽ giúp đảm bảo an toàn và hiệu quả cho người sử dụng.

5.1. Tương lai của glycoside tim trong y học

Với sự phát triển của công nghệ phân tích, glycoside tim có thể được nghiên cứu sâu hơn để phát triển các loại thuốc mới, an toàn và hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

5.2. Nhu cầu nghiên cứu thêm về glycoside tim

Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của glycoside tim trong điều trị bệnh tim.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Glycoside tim là nhóm hợp chất steroid có tác dụng sinh học quan trọng trong điều trị các bệnh lý tim mạch như suy tim sung huyết và loạn nhịp tim. Theo ước tính, digoxin và digitoxin là hai glycoside tim được sử dụng phổ biến nhất trong y học hiện đại, với liều điều trị digoxin từ 0,5 đến 3,0 ng/lít và thời gian bán thải từ 20 đến 60 giờ. Tuy nhiên, các glycoside tim có tính độc cao, nếu sử dụng vượt quá liều cho phép có thể gây ngộ độc nghiêm trọng, thậm chí tử vong. Do đó, việc phát triển phương pháp định lượng chính xác các glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu là rất cần thiết để đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị.

Luận văn tập trung nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo kết hợp detector PDA để định lượng digoxin và digitoxin trong các mẫu dược phẩm và dược liệu. Phạm vi nghiên cứu bao gồm các mẫu thuốc chứa digoxin và digitoxin được thu thập tại Hà Nội, cùng với dược liệu lá trúc anh đào thu hái tại khu đô thị Đại Kim, Hà Nội vào năm 2015. Mục tiêu chính là xây dựng và tối ưu hóa quy trình phân tích nhằm đạt độ nhạy, độ chính xác cao, đồng thời khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu cho việc tách và định lượng các glycoside tim.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chất lượng kiểm soát dược phẩm chứa glycoside tim tại Việt Nam, góp phần đảm bảo an toàn cho người sử dụng và hỗ trợ phát triển nguồn dược liệu trong nước. Các chỉ số hiệu quả như giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại và hiệu suất thu hồi được đánh giá kỹ lưỡng để đảm bảo tính ứng dụng thực tiễn của phương pháp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc hóa học glycoside tim: Glycoside tim gồm hai phần chính là aglycon (nhân steroid và vòng lacton) và phần đường nối vào vị trí C-3 của aglycon. Phần aglycon quyết định tác dụng sinh học, trong khi phần đường ảnh hưởng đến tính hòa tan và dược động học. Digoxin và digitoxin thuộc nhóm cardenolid với vòng lacton 4 carbon không bão hòa.

• Tác dụng sinh học và độc tính: Glycoside tim có tác dụng cường tim, điều hòa nhịp tim theo quy tắc 3R (Renforcer - cường, Regulariser - điều hòa). Tuy nhiên, liều vượt ngưỡng có thể gây ngộ độc nghiêm trọng.

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): RP-HPLC với cột pha đảo C18 được sử dụng để tách và định lượng glycoside tim nhờ khả năng chọn lọc cao, độ nhạy tốt và hiệu quả tách cao. Detector PDA cho phép phát hiện ở nhiều bước sóng, tăng độ chính xác nhận diện.

• Phương pháp xử lý mẫu: Chiết xuất glycoside tim từ dược phẩm và dược liệu bằng dung môi thích hợp (etanol, acetonitril), kết hợp siêu âm và lọc qua màng lọc 0,45 µm để chuẩn bị mẫu phân tích.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu dược phẩm gồm 3 loại thuốc chứa digoxin và digitoxin mua tại các hiệu thuốc Hà Nội. Mẫu dược liệu là lá trúc anh đào thu hái tại khu đô thị Đại Kim, Hà Nội năm 2015.

• Phương pháp phân tích: Sử dụng hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA SPD-M10Avp, cột C18 inertsil ODS-3 (250 mm × 2,1 mm × 5 µm). Pha động gồm nước cất và acetonitril với tỷ lệ thay đổi tùy theo glycoside phân tích. Bước sóng phát hiện chọn 225 nm.

• Xử lý mẫu: Mẫu thuốc nghiền mịn, cân chính xác, chiết bằng etanol và acetonitril 50%, siêu âm 30 phút, lọc qua màng 0,45 µm. Mẫu dược liệu ngâm cồn 25%, chiết bằng cloroform, cô khô, hòa tan trong acetonitril 55%.

• Khảo sát điều kiện sắc ký: Tối ưu tỷ lệ pha động ACN/H2O, tốc độ dòng pha động (0,5 - 1 ml/phút), nhiệt độ cột (30°C), thể tích vòng bơm mẫu (20 µl) để đạt hiệu quả tách tốt nhất.

• Xây dựng đường chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn digoxin và digitoxin với nồng độ từ 5 đến 100 ppm, xác định mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ.

• Đánh giá phương pháp: Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại (%RSD dưới 1% cho diện tích pic và thời gian lưu), hiệu suất thu hồi mẫu thêm chuẩn.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và chuẩn bị mẫu trong tháng đầu, khảo sát và tối ưu điều kiện sắc ký trong 2 tháng tiếp theo, xây dựng đường chuẩn và đánh giá phương pháp trong tháng thứ 4, phân tích mẫu thực và hoàn thiện luận văn trong tháng cuối.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện sắc ký tối ưu cho digoxin: Tỷ lệ pha động ACN/H2O = 50/50, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, nhiệt độ cột 30°C, bước sóng phát hiện 225 nm. Thời gian lưu trung bình 4,77 phút với độ lặp lại thời gian lưu 0,07% RSD và diện tích pic 0,7% RSD.

2. Điều kiện sắc ký tối ưu cho digitoxin: Tỷ lệ pha động ACN/H2O = 60/40, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, nhiệt độ cột 30°C, bước sóng 225 nm. Thời gian lưu trung bình 7,52 phút, độ lặp lại thời gian lưu 0,07% RSD và diện tích pic 0,5% RSD.

3. Tách hỗn hợp digoxin và digitoxin: Tỷ lệ pha động ACN/H2O = 55/45, tốc độ dòng 0,7 ml/phút cho phép tách rõ ràng hai chất với khoảng cách thời gian lưu 4,84 phút, sắc đồ sắc nét, pic không bị chẻ hoặc chen lấn.

4. Đường chuẩn tuyến tính: Mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ digoxin, digitoxin tuyến tính trong khoảng 5-100 ppm với hệ số tương quan R² > 0,999, đảm bảo độ chính xác định lượng.

5. Giới hạn phát hiện và định lượng: LOD của phương pháp khoảng 0,5 ppm, LOQ khoảng 1,65 ppm, phù hợp với yêu cầu phân tích dược phẩm.

6. Hiệu suất thu hồi: Mẫu thêm chuẩn cho hiệu suất thu hồi từ 98% đến 102%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác và độ tin cậy cao.

Thảo luận kết quả

Kết quả tối ưu hóa điều kiện sắc ký cho thấy tỷ lệ pha động và tốc độ dòng pha động ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian lưu và độ phân giải của các glycoside tim. Việc lựa chọn tỷ lệ ACN/H2O phù hợp giúp cân bằng giữa thời gian phân tích và độ sắc nét của pic, tránh hiện tượng pic chẻ hoặc chen lấn. Độ lặp lại thấp (%RSD dưới 1%) chứng tỏ hệ thống sắc ký và quy trình xử lý mẫu ổn định, phù hợp cho phân tích định lượng chính xác.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, phương pháp RP-HPLC với detector PDA được đánh giá cao về độ nhạy và chọn lọc, phù hợp với việc phân tích các hợp chất glycoside tim phức tạp trong dược phẩm và dược liệu. Giới hạn phát hiện và định lượng đạt mức thấp giúp phát hiện chính xác hàm lượng glycoside tim trong mẫu, đảm bảo an toàn khi sử dụng thuốc.

Việc áp dụng quy trình xử lý mẫu bằng siêu âm và chiết xuất dung môi phù hợp giúp thu hồi cao và loại bỏ tạp chất hiệu quả, góp phần nâng cao độ chính xác của phương pháp. Kết quả phân tích mẫu thực tế từ các thuốc và dược liệu cho thấy hàm lượng digoxin và digitoxin nằm trong giới hạn cho phép, phù hợp với tiêu chuẩn dược điển.

Biểu đồ sắc ký và bảng số liệu được trình bày chi tiết trong luận văn giúp minh họa rõ ràng hiệu quả tách và độ chính xác của phương pháp, hỗ trợ việc đánh giá và ứng dụng trong kiểm soát chất lượng dược phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng phương pháp RP-HPLC-PDA trong kiểm soát chất lượng dược phẩm chứa glycoside tim: Các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm thuốc nên triển khai phương pháp này để đảm bảo hàm lượng hoạt chất chính xác, tránh ngộ độc do quá liều. Thời gian thực hiện: trong 6 tháng tới.

2. Phát triển nguồn dược liệu trong nước: Khuyến khích nghiên cứu và khai thác dược liệu chứa glycoside tim như lá trúc anh đào tại các vùng có điều kiện sinh thái phù hợp, nhằm giảm phụ thuộc nhập khẩu. Chủ thể thực hiện: Viện nghiên cứu dược liệu, các trường đại học. Thời gian: 1-2 năm.

3. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ phân tích: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao và xử lý mẫu để nâng cao năng lực phân tích trong các phòng kiểm nghiệm dược phẩm. Thời gian: 3-6 tháng.

4. Xây dựng tiêu chuẩn phân tích glycoside tim trong dược điển Việt Nam: Cập nhật và hoàn thiện các quy trình phân tích chính thức dựa trên kết quả nghiên cứu để làm cơ sở pháp lý cho kiểm soát chất lượng thuốc. Chủ thể: Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Thời gian: 1 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu dược học và hóa phân tích: Luận văn cung cấp cơ sở lý thuyết và phương pháp phân tích hiện đại, giúp phát triển nghiên cứu về glycoside tim và các hợp chất dược liệu khác.

2. Phòng kiểm nghiệm dược phẩm: Hướng dẫn chi tiết quy trình xử lý mẫu và phân tích bằng HPLC-PDA, giúp nâng cao chất lượng kiểm soát thuốc chứa glycoside tim.

3. Cơ sở sản xuất dược phẩm: Tham khảo để xây dựng quy trình kiểm soát chất lượng nguyên liệu và thành phẩm, đảm bảo an toàn và hiệu quả thuốc.

4. Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành hóa phân tích, dược học: Tài liệu tham khảo thực tiễn về ứng dụng sắc ký lỏng trong phân tích dược liệu và dược phẩm, hỗ trợ học tập và nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp HPLC-PDA có ưu điểm gì trong phân tích glycoside tim?
   Phương pháp này có độ nhạy cao, khả năng chọn lọc tốt nhờ detector PDA theo dõi nhiều bước sóng cùng lúc, giúp nhận diện chính xác các glycoside tim trong mẫu phức tạp. Ví dụ, bước sóng 225 nm được chọn để giảm nhiễu nền và tăng độ ổn định tín hiệu.

2. Làm thế nào để xử lý mẫu dược liệu chứa glycoside tim trước khi phân tích?
   Mẫu dược liệu được ngâm cồn 25%, chiết bằng cloroform, cô khô và hòa tan trong acetonitril 55%, sau đó lọc qua màng 0,45 µm. Quy trình này giúp chiết xuất hiệu quả glycoside tim và loại bỏ tạp chất gây nhiễu.

3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là bao nhiêu?
   LOD khoảng 0,5 ppm và LOQ khoảng 1,65 ppm, đủ nhạy để phát hiện hàm lượng glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu theo tiêu chuẩn an toàn.

4. Phương pháp có thể áp dụng cho các glycoside tim khác ngoài digoxin và digitoxin không?
   Có thể áp dụng với điều kiện tối ưu hóa riêng cho từng glycoside, do cấu trúc và tính chất hóa học khác nhau ảnh hưởng đến thời gian lưu và độ phân giải sắc ký.

5. Tại sao chọn bước sóng 225 nm thay vì 220 nm để phát hiện glycoside tim?
   Mặc dù cả hai bước sóng cho diện tích pic tương đương, bước sóng 225 nm cho tín hiệu ổn định hơn, ít nhiễu nền và pic nền nhỏ hơn, giúp tăng độ chính xác và độ tin cậy của phép đo.

Kết luận

• Đã xây dựng và tối ưu hóa thành công phương pháp RP-HPLC-PDA để định lượng digoxin và digitoxin trong dược phẩm và dược liệu với độ nhạy và độ chính xác cao.
• Điều kiện sắc ký tối ưu gồm cột C18, pha động ACN/H2O tỷ lệ 50/50 cho digoxin, 60/40 cho digitoxin, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, bước sóng phát hiện 225 nm.
• Phương pháp có độ lặp lại tốt (%RSD dưới 1%), hiệu suất thu hồi đạt 98-102%, giới hạn phát hiện và định lượng phù hợp với yêu cầu kiểm soát chất lượng.
• Kết quả phân tích mẫu thực tế cho thấy hàm lượng glycoside tim trong thuốc và dược liệu phù hợp tiêu chuẩn, đảm bảo an toàn cho người sử dụng.
• Đề xuất áp dụng phương pháp trong kiểm soát chất lượng dược phẩm, phát triển nguồn dược liệu trong nước và đào tạo nhân lực phân tích.

Các cơ sở kiểm nghiệm và sản xuất dược phẩm nên triển khai phương pháp này để nâng cao chất lượng sản phẩm. Đồng thời, nghiên cứu mở rộng áp dụng cho các glycoside tim khác và các hợp chất dược liệu có cấu trúc tương tự.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ra đời từ rất sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào cuối thế kỉ 20. Vào những năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh và đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc các hỗn hợp các chất cực kì giống nhau nhƣ các nguyên tố đất hiếm, các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu. Ngày nay rất nhiều cải tiến đã đƣợc thực hiện để nâng cao độ nhạy của phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao. HPLC (sắc kí lỏng hiệu năng cao) là một kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích để quản lí một mảng các chất phân tích mà phƣơng pháp khác không thể đáp ứng đƣợc.

Với việc áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ không phân cực nhƣ: các chất thơm PAHs, các axit béo, các dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), các mẫu sinh học trong phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline,.) đến phân cực nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao và hiệu quả tách cao, pic cân đối. Thêm vào đó pha động thƣờng là hỗn hợp của nƣớc và các dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế. Đây là một phƣơng pháp rất thành công [6,7]. Glycoside tim là một nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng trong y học bởi bác sĩ ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, và hiện nay glycoside tim có một vị trí quan trọng trong thuốc điều trị bệnh tim.

Trong số rất nhiều loại glycoside tim có trong tự nhiên thì digoxin và digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên các các chất glycoside tim thƣờng rất độc, nếu sử dụng quá hàm lƣợng cho phép dẫn đến ngộ độc, thậm chí dẫn tử vong cho con ngƣời [18]. Chính vì thế cần xác định chính xác hàm lƣợng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt hiệu quả cao không sử dụng quá liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đang rất đƣợc chú trọng. 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Yêu cầu đặt ra là phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng các glycoside tim trong dƣợc liệu, dƣợc phẩm một cách nhanh chóng và chính xác nhất.

Việc ứng dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc và dƣợc phẩm đã đƣợc làm nhiều trên thế giới nhƣng ở Việt Nam vẫn còn tƣơng đối mới mẻ và chƣa có nhiều công trình về lĩnh vực này. Chính vì lí do trên chúng tôi xin lựa chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu”. Trong đề tài này tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng một số glycoside tim trong dƣợc phẩm và dƣợc liệu. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.

Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim. Cấu tạo, tên gọi. Glycoiside tim cũng nhƣ các glycosid khác, cấu trúc hóa học gồm 2 phần: aglycon và phần đƣờng [9]. a) Phần aglycon: có thể chia làm 2 phần: Nhân hydrocarbon và mạch nhánh (vòng lacton).

* Nhân hydrocarbon Nhân hydrocarbon có cấu trúc steran: 10, 13-dimethyl cyclopentanoper hydrophenanthren. Đính vào nhân này có các nhóm chức oxy. 18 12 17 11 19 16 13 1 D C 2 9 14 15 10 8 3 A B 7 5 4 6 Ở C-3 luôn luôn có đính nhóm OH, hầu hết các chất có trong cây đều hƣớng β, trừ một vài chất ví dụ carpogenin, carpogenol, epidigitoxigenin có OH C-3 hƣớng α. Ở C-14 của hầu hết các glycosid tim có tác dụng sinh học đều có nhóm OH hƣớng β.

Một vài chất không có nhóm OH này do trong quá trình thủy phân hoặc do sắc ký cột có xẩy ra sự dehydrat hóa tạo thành nối đôi ở C 14-15. Tuy nhiên, có 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm một số chất do bản chất tự nhiên không có nhóm OH này nhƣ các chất diffugenin, strophanthilin A, β-anhydro-uzarigenin. Sự oxy hóa (gắn nhóm OH hoặc carbonyl) còn có thể xảy ra thêm ở các vị trí nhƣ 1, 5, 11, 12, 16, 19. Mức độ oxy hóa ở C-19 có thể là CH2OH, CHO, COOH.

Các chất có mức độ oxy hóa khác nhau này thƣờng cùng tồn tại trong cùng một cây. Chất G-strophanthidin có đến 6 OH trong phần aglycon. Nhóm OH có thể bị acyl hóa ví dụ oleandrigenin, gitalixigenin. Có trƣờng hợp các nhóm OH gần nhau tƣơng tác với nhau để tạo nhóm chức epoxy, ví dụ adynerin.

Nhóm OH ở C-11 có thể tác dụng với COOH ở C-19 để tạo thành vòng lacton ví dụ chất sarmentosigenin E có trong Strophanthus sarmentosus. * Vòng lacton Phần glycon của glycosid tim ngoài khung hydrocarbon nói trên, đặc biệt còn có một vòng lacton nối vào vị trí C-17 của khung. Vòng lacton này đƣợc coi là mạch nhánh. Hầu hết các chất có tác dụng sinh học đều có vòng lacton ở hƣớng β.

Một số ít ở hƣớng α do enzym epimerase có mặt trong cây chuyển hóa mà thành. Có hai loại vòng lacton: loại thứ nhất có 4 carbon với một nối đôi ở vị trí α-β, những aglycon nào có vòng lacton này thì có 23 carbon và đƣợc xếp vào nhóm 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm “cardenolid”. Loại thứ hai có 5 carbon có 2 nối đôi (vòng γ-pyron hay coumalin), những aglycon nào có vòng lacton này thì có 24 carbon và đƣợc xếp vào nhóm “bufadienolid” (do chữ bufo = cóc, dien = 2 nối đôi. Trong nhựa cóc có các chất có cấu trúc hoàn toàn giống nhƣ aglycon của nhóm này, ví dụ bufotalin).

Các glycosid tim trong thiên nhiên thƣờng là loại cardenolid; một số ít thuộc loại bufadienolid nhƣ scillaren A có trong Hành biển (Urginea martima L.) hellebrin có trong cây Helleborus niger L. b) Phần đƣờng Phần đƣờng trong glycosid tim nối vào OH ở C-3 của aglycon. Cho đến nay ngƣời ta biết khoảng 40 loại đƣờng monosaccharid khác nhau trong các glycosid tim. Ngoài những đƣờng thông thƣờng nhƣ D-glucose.

L-rhamnose, D-xylose, D- fucose có gặp trong những nhóm glycosid khác, còn lại là những đƣờng đặc biệt của glycosid tim. Trong các đƣờng này, đáng chú ý là các đƣờng 2,6-desoxy. Dƣới đây là một số đƣờng 2,6-desoxy làm ví dụ. Các đƣờng 2,6-desoxy có những đặc tính sau: dễ bị thủy phân, cho phản ứng màu với thuốc thử Keller-Kiliani và thuốc thử xanthydrol.

Mạch đƣờng có thể là monosaccharid hoặc oligosaccharid. Gitoxin cellobiosid trong Digitalis tía có mạch đƣờng với 5 đơn vị đƣờng đơn: Gitoxincellobiosid = Gitoxigenin + (digitoxose)3 + (glucose)2 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Ngƣời ta nhận thấy rằng ở glycosid tim glucose bao giờ cũng ở cuối mạch (xa aglycon) [9]. Dƣới đây là tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21] M TT Tên gọi Công thức cấu tạo (g/mol) 584 1 G -strophathin K- 872 2 strophanthoside 550 3 Convallatoxin 4 K- trophanthin- 405 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 5 Oleandrin 576 6 Cymarin 548 7 Digoxin 780 8 Digitoxin 969 9 Lanatoside A 985 10 Lanatoside B 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 985 11 Lanatoside C 12 Gitoxin 780 806 13 Acetyldigitoxin 823 14 Acetyldigoxin 15 Neriantin 873 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 1. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim Glycosid tim là những glycosid steroid có tác dụng đặc biệt lên tim, đặc biệt là digoxin và digitoxin.

Ở liều điều trị có tác dụng cƣờng tim, làm chậm nhịp tim và điều hòa nhịp tim. Các tác dụng trên đƣợc gọi là tác dụng theo quy tắc 3R của Potair: Renforcer = cƣờng. Regulariser = điều hoà. Nếu quá liều sẽ gây nôn làm chảy nƣớc bọt, mờ mắt, tiêu chảy, yếu các cơ, loạn nhịp tim, và có thể gây tử vong.

Glycoside tim còn đƣợc gọi là glycoisid digital vì glyciside của lá cây Digitalis đƣợc dùng đầu tiên trên lâm sàng để chữa bệnh tim [9]. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng Phần quyết định tác dụng lên tim của glycosid tim là phần aglycon bao gồm nhân steroid và vòng lacton chƣa bão hòa. Cả hai phần đều quan trọng: - Nếu vẫn giữ vòng lacton nhƣng thay nhân steroid bằng nhân benzen, naphtalen… tác dụng lên tim sẽ mất. - Nếu vẫn giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton nhƣ: bão hòa nối đôi, mở vòng, thay vòng lacton bằng vòng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất nhiều.

Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng, ruột, phụ thuộc vào số lƣợng nhóm OH của phần aglycon, nói cách khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó. Digitoxin dễ hấp thu qua đƣờng tiêu hóa, tái hấp thu qua thận, gan và có tính tích lũy trong cơ thể vì aglycon (digitoxigenin) chỉ có 2 nhóm OH. Ouabain có nhiều nhóm OH tự do trong phần aglycon nên khó hấp thu qua đƣờng tiêu hóa (nên phải dùng qua đƣờng tiêm tĩnh mạch) và thải trừ nhanh. 9 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Nhóm OH ở C-14 rất quan trọng, thiếu nhóm này tác dụng trên tim sẽ giảm đi rất nhiều.

Nhóm OH ở C-3 hƣớng α cũng làm giảm tác dụng. Qua quá trình chuyển hóa trong cơ thể, β-OH ở vị trí C-3 bị epimer hóa sang α-OH để thải ra ngoài. Thí nghiệm trên súc vật cho thấy một số cardenolid khi đƣa vào cơ thể sẽ đƣợc gắn thêm OH ở C-12 chuyển thành chất có tính phân cực hơn để dễ thải ra ngoài. Dung hợp giữa các vòng của nhân steroid cũng ảnh hƣởng đến tác dụng của glycosid tim: C/D cấu hình cis có tác dụng quyết định lên tim.

A/B trans giảm tác dụng 10 lần so với dẫn chất cis tƣơng ứng. Vòng lacton hƣớng α cũng giảm tác dụng lên tim. Ở dạng aglycon, hoạt tính của nhóm bufadienolid mạnh hơn dẫn chất cardenolid tƣơng ứng. Trong hai nhóm cardenolid và bufadienolid thì nhóm đầu đƣợc sử dụng nhiều hơn.

Nhóm bufadienolid hay gây tác dụng phụ. Phần đƣờng ít có ảnh hƣởng đến tác dụng của glycosid tim, chủ yếu là ảnh hƣởng đến độ hòa tan, hấp thu và thải trừ của glycosid tim [9,21]. Tính chất của glycoside tim * Tính chất vật lí Glycosid tim là những chất kết tinh đƣợc, một số ở dạng vô định hình hoặc lỏng sánh. Đa số không mầu, một số có màu (anthraglycosid đỏ, da cam flavonoid glycosid màu vàng).

Chúng có vị đắng, có năng suất quay cực.