Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự phát triển kinh tế và đời sống xã hội ngày càng nâng cao đã thúc đẩy xu hướng tiêu dùng chuyển dịch sang các sản phẩm thực phẩm tự nhiên, lành tính, có giá trị dinh dưỡng cao và hỗ trợ sức khỏe. Bên cạnh sữa tươi và sữa tiệt trùng từ động vật, các dòng sữa thực vật (sữa hạt) dần khẳng định vị thế nhờ nguồn dưỡng chất phong phú từ nông sản và hương vị tự nhiên. Trong nhóm hạt đậu đỗ, hạt đậu xanh (Vigna radiata) là nguồn nguyên liệu nông sản phổ biến, chứa hàm lượng protein, carbohydrate, chất xơ, vitamin cùng các khoáng chất thiết yếu cao, đồng thời theo y học cổ truyền còn có tác dụng thanh nhiệt, giải độc.

Việc lên men sữa hạt bằng các chủng vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB), đặc biệt là chi Lactobacillus mang đặc tính probiotic, giúp bổ sung lợi khuẩn cho hệ vi sinh đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa, tăng cường miễn dịch và chuyển hóa dinh dưỡng. Tuy nhiên, thị trường trong nước chủ yếu lưu hành các sản phẩm sữa chua lên men từ sữa động vật; các nghiên cứu và sản phẩm sữa hạt lên men từ đậu xanh vẫn còn hạn chế. Do đó, khóa luận thực hiện đề tài "Nghiên cứu chọn giống Lactobacillus phục vụ sản xuất sữa đậu xanh lên men" nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc tuyển chọn chủng vi sinh vật phù hợp và xây dựng quy trình chế biến thực phẩm chức năng từ thực vật.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể trong văn bản gồm:

  1. Mục đích: Phân lập và tuyển chọn được giống Lactobacillus có khả năng lên men tốt, hoạt tính sinh học cao để phục vụ sản xuất sữa đậu xanh lên men.
  2. Yêu cầu: Phân lập và tuyển chọn được giống Lactobacillus có khả năng lên men tốt, hoạt tính sinh học cao, rút ngắn thời gian để phục vụ sản xuất sữa hạt lên men.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Giống vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ các nguồn thực phẩm lên men tự nhiên và hạt đậu xanh thương phẩm.
  • Phạm vi không gian: Bộ môn Vi sinh vật – Khoa Môi trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 3/2021 đến tháng 9/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết về vi sinh vật học thực phẩm, sinh lý và hóa sinh của vi khuẩn lactic, kết hợp quy chuẩn đánh giá chất lượng sản phẩm thực phẩm lên men:

  • Khung lý thuyết và phân loại: Đặc điểm sinh học của chi Lactobacillus (thuộc họ Lactobacillaceae), cơ chế lên men lactic đồng hình qua con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) và lên men lactic dị hình qua con đường Pentose-phosphate (PP); khóa định loại vi sinh vật của Bergey (1986).
  • Vật liệu nghiên cứu: Mẫu phân lập gồm cà pháo muối chua, bắp cải muối chua, dưa chua, kim chi, cải củ muối chua, sữa chua lên men thủ công thu mua tại chợ Cửu Việt, thị trấn Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội. Hạt đậu xanh và đường kính trắng thương phẩm.
  • Môi trường nuôi cấy: Môi trường MRS (thạch và lỏng) để phân lập, nuôi cấy, khảo sát đặc tính của Lactobacillus; môi trường Luria-Bertani (LB) để nuôi cấy vi khuẩn kiểm định; môi trường LB bổ sung 1% tinh bột để thử hoạt tính amylase; môi trường LB bổ sung 1% sữa gầy (casein) để thử hoạt tính protease; môi trường thử nghiệm lên men đường bổ sung chỉ thị phenol đỏ.
  • Phương pháp vi sinh và hóa sinh thực nghiệm:
    • Phương pháp phân lập và hình thái học: Pha loãng thập phân mẫu (từ $10^{-1}$ đến $10^{-4}$), cấy trang trên đĩa thạch MRS, ủ ở 37°C trong 1–2 ngày; nhuộm Gram và soi kính hiển vi quang học độ phóng đại 40X.
    • Phương pháp xác định khả năng sinh acid lactic: Chuẩn độ độ acid bằng dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalein, tính toán độ Soxhlet-Henkel/Therner (°T) và hàm lượng acid lactic quy đổi (g/L).
    • Phương pháp thử hoạt tính enzyme: Thử phản ứng catalase bằng dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2\ 3%$; thử hoạt tính amylase bằng dung dịch Lugol 1%; thử hoạt tính protease qua vòng phân giải protein trên đĩa thạch.
    • Phương pháp xác định khả năng di động: Cấy đâm sâu trong ống thạch đứng MRS, ủ ở 30–35°C trong 2 ngày.
    • Phương pháp khảo sát khả năng thích ứng nhiệt độ và pH: Nuôi cấy ở các dải nhiệt độ (28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C) và dải pH (3, 4, 5, 6, 7), đếm mật độ khuẩn lạc ($\text{CFU/mL}$).
    • Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh: Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đo đường kính vòng vô khuẩn đối với các chủng chỉ thị gây bệnh đường ruột: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella.
    • Phương pháp sản xuất chế phẩm và đánh giá chất lượng: Sản xuất chế phẩm sinh học dạng dịch thể theo quy trình của Bộ môn Vi sinh vật; kiểm tra mật độ tế bào theo phương pháp pha loãng Koch.
    • Phương pháp đánh giá cảm quan: Đánh giá theo TCVN 3215-79 trên thang điểm 20 (hệ số trọng lượng: Màu 1,2; Mùi 1,4; Vị 1,4) với hội đồng gồm 10 thành viên; tham chiếu chỉ tiêu cảm quan sữa tươi nguyên liệu theo TCVN 7405:2018.
    • Phương pháp xử lý số liệu: Phân tích và xử lý số liệu thực nghiệm bằng phần mềm Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các dữ liệu khoa học và thực tiễn liên quan đến nguyên liệu đậu xanh, sữa hạt, sữa lên men và vi khuẩn lactic:

  • Đặc tính và giá trị dinh dưỡng của đậu xanh: Cây đậu xanh (Vigna radiata) có chu kỳ sinh trưởng ngắn, rễ chứa nốt sần cố định đạm Rhizobium. Hạt đậu xanh cung cấp khoảng 105 kcal/100g, 7,02g protein, 0,38g lipid, 19,15g carbohydrate, 7,6g chất xơ cùng nhiều khoáng chất (Ca, Fe, Mg, P, K). Giá trị sinh học của protein đậu xanh đạt 40,66% (theo Bressani, 1973).
  • Thực trạng sản xuất và tiêu thụ: Thị trường sữa thực vật toàn cầu tăng trưởng mạnh (dự báo đạt 34 tỷ USD năm 2024 theo Nielsen). Tại Việt Nam, sữa hạt chiếm 12% cơ cấu thị trường sữa nước năm 2018 với tốc độ tăng trưởng kép (CAGR) đạt 18% giai đoạn 2014–2019.
  • Cơ chế lên men lactic và đặc điểm giống Lactobacillus: Chi Lactobacillus gồm các trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí, sinh trưởng tối thích ở 30–40°C. Lên men đồng hình tạo 90–98% acid lactic qua chu trình EMP, trong khi lên men dị hình tạo acid lactic (40%), ethanol (20%), acid acetic (10%) và $\text{CO}_2$ (20%) qua chu trình PP. Nhóm vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế vi sinh vật gây thối và hỗ trợ cân bằng hệ vi sinh đường ruột.

Đối tượng, phạm vi, nội dung và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm từ khâu chuẩn bị vật liệu, hóa chất, thiết bị đến các thao tác nghiên cứu:

  • Thiết lập quy trình phân lập vi sinh vật từ 6 nguồn thực phẩm lên men truyền thống.
  • Chi tiết hóa quy trình sản xuất sữa đậu xanh lên men quy mô phòng thí nghiệm: Đậu xanh $\rightarrow$ Lựa chọn $\rightarrow$ Ngâm $\rightarrow$ Tách vỏ $\rightarrow$ Xay ướt $\rightarrow$ Lọc $\rightarrow$ Thu dịch sữa $\rightarrow$ Đun sôi (100°C trong 2 phút, phối chế 8% đường) $\rightarrow$ Làm nguội (40–45°C) $\rightarrow$ Cấy giống Lactobacillus (tỷ lệ 8%) $\rightarrow$ Rót hũ $\rightarrow$ Lên men (40–45°C trong 8 giờ) $\rightarrow$ Làm lạnh và bảo quản lạnh.
  • Thiết lập hệ thống công thức thử nghiệm gồm 3 công thức với 5 lần lặp lại:
    • CT1: Đối chứng không bổ sung giống Lactobacillus tuyển chọn.
    • CT2: Lên men tự nhiên theo phương pháp truyền thống.
    • CT3: Lên men có bổ sung giống Lactobacillus tuyển chọn.
  • Xây dựng bảng mô tả cảm quan và thang điểm chấm cảm quan theo TCVN 3215-79.

Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình phân lập, tuyển chọn và thử nghiệm ứng dụng:

1. Kết quả phân lập và xác định hình thái

Từ 6 mẫu thực phẩm lên men, đề tài đã phân lập được 11 chủng vi sinh vật ký hiệu từ CP1 đến SC.

STT Ký hiệu Nguồn phân lập Thời gian Kích thước (mm) Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Tế bào Gram
1 CP1 Cà pháo 36h 1–2 Tròn, vàng đục, lồi, trơn láng Que (+)
2 CP2 Cà pháo 36h 1–2 Tròn, trắng sữa, lồi, trơn bóng Que (+)
3 CP3 Cà pháo 36h 1–2 Tròn, trắng sữa, lồi, trơn bóng Que (+)
4 BC1 Bắp cải 36h 1–2 Tròn, trơn, trắng đục, lồi, tâm vàng Que (+)
5 BC2 Bắp cải 36h 1–2 Tròn, trắng sữa, lồi, trơn bóng Que (+)
6 KC Kim chi 36h 1–2 Tròn, trắng sữa, lồi, trơn bóng Que (+)
7 DC1 Dưa chua 36h 1–2 Tròn, trơn, trắng sữa, dẹt Que (+)
8 DC2 Dưa chua 36h 1–2 Tròn, trắng sữa, lồi, trơn bóng Que (+)
9 CC1 Cải củ 36h 1–2 Tròn, trơn, trắng sữa, hơi lồi Que (+)
10 CC2 Cải củ 36h 1–2 Tròn, trắng sữa, lồi, trơn bóng Que (+)
11 SC Sữa chua 36h 1–2 Tròn, trắng sữa, lồi, trơn láng Que (+)

2. Khả năng sinh acid lactic của các chủng phân lập

Kết quả chuẩn độ bằng phương pháp Therner cho thấy cả 11 chủng đều sinh acid lactic, dao động từ 1,26 g/L đến 1,80 g/L.

STT Ký hiệu chủng Thể tích $\text{NaOH}\ 0,1\text{N}$ tiêu tốn ($\text{mL}$) Độ Therner (°T) Hàm lượng acid lactic ($\text{g/L}$)
1 CP1 15,5 155 1,39
2 CP2 14,5 145 1,30
3 CP3 20,0 200 1,80
4 BC1 15,0 150 1,35
5 BC2 19,0 190 1,71
6 KC 14,5 145 1,30
7 DC1 15,5 155 1,39
8 DC2 16,0 160 1,44
9 CC1 14,0 140 1,26
10 CC2 16,0 160 1,44
11 SC 15,5 155 1,39

Hai chủng sinh acid cao nhất là CP3 (1,80 g/L) và BC2 (1,71 g/L) được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng CP3 và BC2

  • Di động: Cả 2 chủng đều không di động, chỉ mọc dọc theo vết cấy đâm sâu trên môi trường thạch đứng MRS, thuộc nhóm hô hấp kỵ khí tùy ý.
  • Hoạt tính enzyme ngoại bào: Cả hai chủng đều âm tính với catalase ($\text{H}_2\text{O}_2$ không sủi bọt), không sinh amylase (không tạo vòng phân giải tinh bột khi thử Lugol) và không sinh protease (không tạo vòng tan casein trên thạch sữa gầy).
  • Phân loại: Đối chiếu với khóa phân loại Bergey (1986), 2 chủng CP3 và BC2 thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus.

4. Khả năng thích ứng nhiệt độ và pH

Kết quả khảo sát mật độ sinh trưởng ($\times 10^8\ \text{CFU/mL}$) của hai chủng ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau:

Điều kiện khảo sát Mức khảo sát Chủng CP3 ($\times 10^8\ \text{CFU/mL}$) Chủng BC2 ($\times 10^8\ \text{CFU/mL}$)
Nhiệt độ 28°C 5,4 4,3
30°C (Tối ưu) 36,0 28,0
32°C 23,0 14,0
34°C 6,3 5,2
36°C 4,7 3,6
Độ pH pH = 3 0,03 0,02
pH = 4 0,71 0,60
pH = 5 3,6 2,2
pH = 6 (Tối ưu) 6,7 4,5
pH = 7 5,3 3,6

Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho cả hai chủng là 30°C và độ pH ban đầu tối ưu là pH = 6.

5. Khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh đường ruột

Hoạt tính ức chế được xác định qua bán kính vòng vô khuẩn $(D-d)/2$ ($\text{mm}$):

Vi sinh vật kiểm định Bệnh lý liên quan Chủng CP3 ($\text{mm}$) Chủng BC2 ($\text{mm}$)
Escherichia coli Viêm ruột, tiêu chảy 2,34 2,08
Pseudomonas aeruginosa Viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp 2,75 2,53
Salmonella Tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn 3,12 0,00 (không kháng)

Chủng CP3 thể hiện phổ ức chế rộng và mạnh hơn chủng BC2, đặc biệt có khả năng đối kháng với Salmonella.

Kết quả và đóng góp

  • Kết quả tuyển chọn: Đề tài đã phân lập thành công 11 chủng vi khuẩn lactic hình que Gram dương và tuyển chọn được 2 chủng ưu việt là Lactobacillus CP3 (nguồn gốc từ cà pháo muối chua) và Lactobacillus BC2 (nguồn gốc từ bắp cải muối chua).
  • Dữ liệu hoạt tính sinh học:
    • Khả năng sinh acid lactic: Chủng CP3 đạt $1,80\ \text{g/L}$ ($200^\circ\text{T}$) và chủng BC2 đạt $1,71\ \text{g/L}$ ($190^\circ\text{T}$).
    • Điều kiện sinh trưởng tối ưu: Nhiệt độ 30°C (mật độ đạt $36\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ đối với CP3 và $28\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ đối với BC2) và pH = 6 (mật độ đạt $6,7\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ đối với CP3 và $4,5\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ đối với BC2).
    • Hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh: Cả hai chủng ức chế được E. coli ($2,08\text{--}2,34\ \text{mm}$) và P. aeruginosa ($2,53\text{--}2,75\ \text{mm}$). Riêng chủng CP3 có khả năng ức chế mạnh Salmonella với đường kính vòng kháng khuẩn $3,12\ \text{mm}$.
  • Quy trình công nghệ đề xuất: Đã bước đầu thiết lập thông số công nghệ sản xuất sữa đậu xanh lên men quy mô phòng thí nghiệm (tỷ lệ phối chế đường 8%, tỷ lệ cấy giống Lactobacillus 8%, chế độ lên men 40–45°C trong 8 giờ).
  • Đóng góp so với các công bố trước: Kết quả nghiên cứu khẳng định các chủng Lactobacillus phân lập từ nguồn rau củ muối chua truyền thống tại Việt Nam có hoạt tính sinh học, khả năng sinh acid và khả năng kháng khuẩn tương đương với các công bố của Nguyễn Thị Minh Hằng và cộng sự, cũng như nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và Phạm Thị Lan Thanh (2011) đối với các chủng phân lập từ đường tiêu hóa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn giếng thạch còn thực hiện thủ công bằng mắt thường và thước đo $\text{mm}$, độ nhạy chưa cao; chưa chuẩn hóa đồng bộ các thông số về bề dày lớp môi trường, nồng độ vi khuẩn kiểm định và thể tích dịch ly tâm cấy vào giếng thạch.
    • Nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm trong phạm vi thời gian 6 tháng (03/2021–09/2021); chưa thực hiện định danh vi khuẩn đến mức loài bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA).
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Hoàn thiện định danh chính xác các chủng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen 16S rRNA.
    • Chuẩn hóa điều kiện thử nghiệm kháng khuẩn và khảo sát thêm các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (bacteriocin, hydrogen peroxide, diacetyl).
    • Tối ưu hóa sâu hơn các thông số công nghệ lên men (nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ phối chế phụ gia ổn định trạng thái) và theo dõi thời hạn bảo quản của sản phẩm sữa đậu xanh lên men ở quy mô pilot.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên: Thuộc các ngành Công nghệ Thực phẩm, Quản lý Chất lượng và An toàn Thực phẩm, Công nghệ Sinh học và Vi sinh vật học ứng dụng khi thực hiện đề tài tốt nghiệp liên quan đến phân lập, tuyển chọn vi sinh vật probiotic và chế biến thực phẩm lên men từ thực vật.
  • Cán bộ nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D): Tham khảo quy trình phân lập vi sinh vật từ thực phẩm lên men truyền thống, phương pháp chuẩn độ độ acid Therner, quy trình công nghệ chế biến dịch sữa hạt và phối chế vi sinh vật lên men.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn phân lập và số lượng chủng vi sinh vật thu nhận trong đề tài là bao nhiêu?

Đề tài thu thập 6 loại mẫu thực phẩm lên men tự nhiên (cà pháo, bắp cải, kim chi, dưa chua, cải củ muối chua và sữa chua thủ công) tại chợ Cửu Việt, Gia Lâm, Hà Nội; qua đó đã phân lập được 11 chủng vi khuẩn lactic hình que Gram dương.

2. Hai chủng vi khuẩn nào được lựa chọn sau bước sàng lọc và dựa trên tiêu chí gì?

Hai chủng được lựa chọn là CP3 (phân lập từ cà pháo) và BC2 (phân lập từ bắp cải). Tiêu chí lựa chọn dựa trên khả năng sinh acid lactic cao nhất trong 11 chủng qua phương pháp chuẩn độ Therner (CP3 đạt $1,80\ \text{g/L}$ và BC2 đạt $1,71\ \text{g/L}$).

3. Điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho sự sinh trưởng của hai chủng CP3 và BC2 là bao nhiêu?

Qua thực nghiệm khảo sát ở các dải nhiệt độ (28–36°C) và dải pH (3–7), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của cả hai chủng là 30°C (mật độ đạt $36\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ với CP3 và $28\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ với BC2) và độ pH ban đầu tối ưu là pH = 6 (mật độ đạt $6,7\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ với CP3 và $4,5\times 10^8\ \text{CFU/mL}$ với BC2).

4. Khả năng đối kháng vi sinh vật kiểm định giữa chủng CP3 và BC2 khác nhau như thế nào?

Cả hai chủng đều có khả năng ức chế vi khuẩn Escherichia coli ($2,08\text{--}2,34\ \text{mm}$) và Pseudomonas aeruginosa ($2,53\text{--}2,75\ \text{mm}$). Tuy nhiên, chủng CP3 có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng hơn khi ức chế mạnh được cả Salmonella với vòng vô khuẩn $3,12\ \text{mm}$, trong khi chủng BC2 không thể hiện hoạt tính ức chế đối với Salmonella ($0\ \text{mm}$).

5. Các thông số chính trong quy trình sản xuất sữa đậu xanh lên men được tác giả đề xuất là gì?

Dịch sữa sau khi lọc được đun sôi ở 100°C trong 2 phút, bổ sung 8% đường kính, làm nguội xuống 40–45°C, cấy 8% giống Lactobacillus tuyển chọn, rót hũ và tiến hành lên men ở nhiệt độ 40–45°C trong thời gian 8 giờ trước khi chuyển sang làm lạnh và bảo quản lạnh.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Ngọc Linh đã hoàn thành việc phân lập 11 chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men tự nhiên và tuyển chọn được 2 chủng trực khuẩn Gram dương triển vọng thuộc chi Lactobacillus là CP3 và BC2. Cả hai chủng đều thể hiện hoạt tính sinh acid lactic tốt, không di động, không sinh catalase, amylase và protease, sinh trưởng tối ưu ở điều kiện 30°C và pH = 6, đồng thời có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đường ruột. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng và định hình quy trình công nghệ cho hướng phát triển các sản phẩm sữa hạt lên men giàu dinh dưỡng tại Việt Nam.