MỞ ĐẦU Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là một vấn đề hết sức cấp thiết, có tính thời sự cao trong đời sống xã hội hiện nay, không chỉ đối với các nƣớc kém phát triển, đang phát triển mà còn ở cả những nƣớc phát triển có trình độ khoa học tiên tiến. Việc bảo đảm an toàn thực phẩm là một trong những nhiệm vụ ƣu tiên hàng đầu mà các cơ quan nhà nƣớc quan tâm đặc biệt và coi đây là một vấn đề có ý nghĩa to lớn về kinh tế, an toàn xã hội, bảo vệ môi trƣờng, sức khỏe toàn dân. Vi khuẩn Clostridium botulinum tạo ra độc tố botulinum gây ngộ độc, một ngộ độc hiếm gặp biểu hiện dƣới dạng các hội chứng lâm sàng khác nhau, từ dạng ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng vết thƣơng đến ngộ độc ở trẻ sơ sinh. Botulinum có độc tính mạnh, chỉ một lƣợng rất nhỏ từ 25 ng đến 50 ng chất độc đã có thể gây tử vong ở ngƣời.
Vi khuẩn Clostridium botulinum serotype E mang gene mã hoá độc tố thần kinh BoNT/E đƣợc phân bố rộng rãi trên thế giới, đặc biệt ở các vùng ven biển. Tại Việt Nam, vấn đề ngộ độc thực phẩm do botulinum hiện chƣa đƣợc quan tâm. Các ca bệnh liên quan đến ngộ độc botulinum chƣa đƣợc thống kê đầy đủ do thói quen tự điều trị các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ đau bụng tiêu chảy hay liệt tạm thời. Năm 2020, ngộ độc do ăn phải đồ ăn chứa độc tố của vi khuẩn C.
botulinum đƣợc ghi nhận khiến nhiều ngƣời tử vong. Sau đó, các vụ ngộ độc do C. botulinum tiếp tục đƣợc ghi nhận tại một số tỉnh trên khắp cả nƣớc nhƣ thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dƣơng, Kon Tum. Chùm ca bệnh tại Kon Tum đƣợc ghi nhận do ăn phải măng rừng khiến 6 ngƣời phải nhập viện và 1 ngƣời trong số đó đã tử vong.
Theo kết quả phân tích từ Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn thực phẩm Quốc gia, các mẫu thực phẩm ngƣời dân ăn phải đều có kết quả xét nghiệm đều dƣơng tính với gene mã hoá độc tố BoNT/E. Đây là trƣờng hợp rất hiếm gặp tại Việt Nam, tuy nhiên cũng là một lời cảnh tỉnh cho ngƣời dân về nguy cơ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bị nhiễm độc. Phƣơng pháp đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện độc tố thần kinh BoNT là xét nghiệm thử độc trên chuột đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng. Bên cạnh đó còn có phƣơng pháp sử dụng miễn dịch ELISA và nuôi cấy, song tất cả các phƣơng pháp này đều có nhƣợc điểm chung là thời gian cho kết quả lâu, độ nhạy và độ chính xác không cao dẫn đến điều trị không kịp thời và làm tăng nguy cơ tử vong.
Bên cạnh đó, phƣơng pháp phát hiện DNA dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, real - time PCR, LAMP. cũng đã đƣợc sử dụng nhằm phát hiện vi khuẩn C. botulinum, các phƣơng pháp này có độ nhạy phân tích và độ đặc hiệu cao, thời gian thực hiện ngắn, cho kết quả nhanh và có thể phát hiện đồng thời đƣợc nhiều loại độc tố. Xuất phát từ thực tế, với mong muốn tìm hiểu và đƣa ra phƣơng pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Clostridium botulinum serotype E nhằm giúp ngƣời nhiễm độc độc tố botulinum có thể đƣợc điều trị kịp thời, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố thần kinh BoNT/E từ mẫu thực phẩm thu thập tại Việt Nam và tối ưu phương pháp real – time PCR xác định sự có mặt của gene’’ với mục tiêu cụ thể nhƣ sau: (i) thiết kế đƣợc cặp mồi đặc hiệu và tạo plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa độc tố BoNT/E để làm đối chứng dƣơng cho các phản ứng nhận diện BoNT/E trong tƣơng lai, (ii) lựa chọn đƣợc điều kiện phù hợp cho phản ứng real – time PCR nhằm phát hiện nhanh đoạn gene mã hoá độc tố BoNT/E và thuận tiện cho việc biểu hiện khi cần cấu trúc chuỗi nhẹ độc tố tái tổ hợp.
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Clostridium botulinum 1.1 Đặc điểm vi khuẩn C. botulinum Đặc điểm hình thái Clostridium botulinum (C. botulinum) là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả năng sinh nội bào tử khi môi trƣờng sống bất lợi. Những thay đổi hình thái cần thiết cho quá trình hình thành bào tử vẫn chƣa có nghiên cúu chính xác, nhƣng các nhà khoa học cho là do điều kiện môi trƣờng có hại cho môi trƣờng sống của vi khuẩn chẳng hạn nhƣ nhiệt độ cao, oxy, bức xạ tia cực tím.
đe dọa sự tồn tại của các tế bào không thể duy trì sự tăng trƣởng sinh dƣỡng [71]. botulinum có mặt nhiều nơi trong tự nhiên đặc biệt những nơi nhƣ đất vƣờn, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm hay trong thực phẩm. botulinum đƣợc tìm thấy trong ruột của các vật nuôi trong nhà, trong ruột cá, đôi khi có cả trong ruột ngƣời và vùng nƣớc bị ô nhiễm. Do vi khuẩn có trong tự nhiên nên thực phẩm dễ bị nhiễm trong quá trình sản xuất chế biến, vận chuyển và bảo quản.
botulinum có khả năng lây nhiễm và phát triển mạnh trong các loại thực phẩm nhƣ thịt cá ƣớp muối, ƣớp lạnh, hun khói, đồ hộp, xúc xích, lạp xƣởng, phomat bị đóng kín. Vì các loại thực phẩm này là môi trƣờng thuận lợi về các điều kiện kỵ khí, nhiệt độ, độ pH và có đầy đủ chất dinh dƣỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh trƣởng. botulinum có khả năng sinh độc tố botulinum gây độc trong điều kiện thƣờng hay ở dạng nội bào tử [22]. Botulinum là độc tố thần kinh, gây tê liệt các bó cơ thần kinh và là nguyên nhân gây tử vong cho con ngƣời và nhiều động vật.
Các nhóm thuộc chi Clostridium này bao gồm các chủng gây bệnh đáng chú ý khác nhƣ Clostridium difficile (hiện đƣợc phân loại lại là Clostridioides difficile), Clostridium tetani và Clostridium perfringenes. Những vi khuẩn này lần lƣợt là nguyên nhân gây ra các bệnh nhƣ tiêu chảy mãn tính, uốn ván và hoại tử [20, 44]. Clostridium botulinum có trong thực phẩm có thể có hoặc không có khả năng gây ngộ độc do vi sinh vật không phát triển thì không có độc tố đƣợc tạo ra. Mặc dù 1 nhiều loại thực phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng cho sự phát triển của C.
botulinum nhƣng không phải tất cả đều cung cấp các điều kiện kỵ khí mà vi khuẩn cần thiết. Các biện pháp ngăn sự tăng trƣởng của C. botulinum trong các loại thực phẩm nhƣ chọn kiểu đóng gói phù hợp, sản phẩm đóng hộp có tính axit (độ pH thấp), có hoạt độ nƣớc thấp, nồng độ NaCl cao, hoặc sử dụng thêm chất bảo quản khác hay kết hợp các điều kiện này lại với nhau. Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển và sinh độc tố của các chủng phân giải protein là 35°C, các chủng không phân giải protein là 26°C - 28°C.
botulinum type B, E và F không phân giải protein có thể sinh độc tố ở nhiệt độ thấp (3°C - 4°C). Tuy nhiên việc hạ thấp nhiệt độ để bảo quản sẽ không ngăn chặn đƣợc sự phát triển và hình thành độc tố của các chủng không phân giải protein trừ khi nhiệt độ đƣợc kiểm soát chính xác và giữ ở mức dƣới 3°C. Độc tố của các chất không phân giải protein không biểu hiện độc tính tiềm ẩn tối đa cho đến khi chúng đƣợc kích hoạt bằng trypsin, độc tố của chất phân giải protein thƣờng xuất hiện ở dạng đƣợc kích hoạt hoàn toàn (hoặc gần nhƣ hoàn toàn). Những khác biệt này có ý nghĩa quan trọng trong việc xem xét dịch tễ học và xét nghiệm về sự bùng phát bệnh ngộ độc.
Chẩn đoán lâm sàng bệnh ngộ độc hiệu quả nhất bằng cách xác định lƣợng độc tố botulinum trong máu, phân hoặc dịch nôn của bệnh nhân, khi đó bệnh phẩm phải đƣợc thu thập trƣớc khi bệnh nhân đƣợc tiêm thuốc kháng độc tố botulinum. Đặc điểm cấu trúc C. botulinum là một loại trực khuẩn gram dƣơng, kỵ khí bắt buộc, hình thành nội bào tử [2, 11, 64]. botulinum có thể di động do có tiên mao và lông nhung, hình dáng thẳng, dài 2-10 µm, bào tử hình bầu dục hoặc hình dùi trống (hình 1.1: Vi khuẩn Clostridium botulinum dưới kính hiển vi Nguồn: http://www.com/tagged/clostridium Tác nhân gây bệnh của vi khuẩn C.
botulinum là do chất độc thần kinh botulinum (BoNT) [5, 29]. BoNT là một metalloprotease, có khả năng cắt các thụ thể protein chứa vùng N-Ethylmaleimide (SNARE) hòa tan trong các đầu dây thần kinh sau khớp thần kinh, ngăn chặn sự giải phóng chất dẫn truyền thần kinh và ngăn chặn sự truyền thần kinh đến các cơ tác động [62]. BoNT có kích thƣớc 150-kDa mang hoạt tính kẽm-endopeptidase [50] bao gồm hai tiểu đơn vị: chuỗi nặng 100 kDa chịu trách nhiệm liên kết và dịch chuyển các chất qua màng khớp thần kinh thông qua các thụ thể cụ thể, chuỗi nhẹ 50 kDa có nhiệm vụ phân cắt các protein liên quan đến túi acetylcholine, lắp ghép và hợp nhất với màng trƣớc synap [49].2: Cấu trúc độc tố botulinum Nguồn: Botulinum Toxin Therapy pp 11–33 BoNT đƣợc sản sinh từ vi khuẩn C. botulinum dƣới dạng độc tố tiền thân gồm phần chất độc thần kinh và phần không gây độc, phần không gây độc này bảo vệ chất độc thần kinh ở điều kiện môi trƣờng tự nhiên, hỗ trợ hấp thu chất độc thần 3 kinh khi độc tố đi vào cơ thể [17] và độc tố gây độc khi tiểu đơn vị đƣợc giải phóng.
Điều này đƣợc cho là có liên quan đến sự phân cắt của phân tử độc tố [8, 51].2 Phân loại vi khuẩn C. botulinum Dựa vào đặc điểm huyết thanh, BoNT đƣợc chia thành 7 loại huyết thanh độc tố từ A đến G (hình 1.3) với các biến thể phân nhóm đƣợc chỉ định trong mỗi loại độc tố có cấu trúc tƣơng tự nhau nhƣng khác nhau về mặt kháng nguyên [25]. Họ chất độc thần kinh này có liều gây chết ở ngƣời ƣớc tính từ 1 đến 3 ng/kg. Do BoNT độc tính cao, dễ sản xuất và trong lịch sử đã đƣợc sử dụng làm vũ khí sinh học nên BoNT đã đƣợc Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) chỉ định là tác nhân đe dọa loại A (các tác nhân loại A đƣợc CDC định nghĩa là những tác nhân dẫn đến tỷ lệ tử vong cao và có khả năng tác động lớn đến sức khỏe, có thể gây hoang mang trong cộng đồng, cần có hành động đặc biệt để chuẩn bị cho sức khỏe mọi ngƣời).
Mặc dù hiện tại có 7 loại huyết thanh kháng nguyên đƣợc biết đến của BoNT nhƣng chỉ có 3 loại huyết thanh là A, B và E liên quan chủ yếu đến tình trạng nhiễm độc ở ngƣời. Các loại kháng nguyên của C.