Nghiên cứu gene độc tố BoNT/E và tối ưu Real-time PCR trong thực phẩm Việt Nam

Nghiên cứu phát hiện gene BoNT/E gây ngộ độc từ thực phẩm tại Việt Nam. Tối ưu phương pháp Real-time PCR giúp xác định nhanh và chính xác.

• Tác giả: Bùi Thị Thanh Thảo
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bảo Yên
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố thần kinh BoNT/E từ mẫu thực phẩm thu thập tại Việt Nam và tối ưu phương pháp Real – time PCR xác định sự có mặt của gene
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium botulinum và độc tố BoNT E

Vi khuẩn Clostridium botulinum là một loại vi khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, có khả năng sản sinh độc tố botulinum - một trong những chất độc mạnh nhất được biết đến. Gene BoNT/E mã hóa chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh, đặc biệt nguy hiểm trong các sản phẩm thực phẩm. Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong môi trường, đặc biệt là ở các khu vực có điều kiện khí hậu ẩm ướt như Việt Nam. Các chủng C. botulinum được phân loại thành các serotype khác nhau (A-G), trong đó serotype E có liên quan chặt chẽ đến các vụ ngộ độc thực phẩm. Hiểu rõ về đặc tính và phân bố của vi khuẩn này là nền tảng quan trọng để phát triển các phương pháp phát hiện hiệu quả, đặc biệt là phương pháp Real-time PCR hiện đại.

1.1. Đặc điểm và phân loại vi khuẩn C. botulinum

C. botulinum là vi khuẩn kỵ khí, tạo bào tử và có khả năng sinh sản mạnh mẽ trong điều kiện thiếu oxy. Vi khuẩn này được phân loại thành các serotype (A-G) dựa trên tính chất huyết thanh của độc tố. Serotype BoNT/E thường gây ngộ độc từ cá và các sản phẩm thủy hải sản lên men. Các chủng khác nhau có vùng gene mã hóa độc tố riêng biệt, cho phép sử dụng các mồi PCR đặc hiệu để phát hiện.

1.2. Vi khuẩn C. botulinum serotype E và độc tố BoNT E

BoNT/E là một độc tố thần kinh neurotoxin độc lực cao, được sản sinh bởi chủng E của C. botulinum. Độc tố này hoạt động bằng cách phá vỡ các protein SNARE, gây liệt cơ và các triệu chứng botulinum nguy hiểm. Gene mã hóa chuỗi nhẹ BoNT/E là vùng đích lý tưởng cho phát hiện bằng Real-time PCR do tính đặc hiệu cao và khả năng phát hiện nhạy cảm.

II. Ngộ độc botulinum Nguyên nhân triệu chứng và nguy hiểm

Ngộ độc botulinum là một bệnh neurotoxic hiếm gặp nhưng rất nguy hiểm do cơ thể tiếp xúc với độc tố từ thực phẩm bị nhiễm C. botulinum. Bệnh biểu hiện qua các triệu chứng như liệt cơ, suy hô hấp, và trong các trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong. Tại Việt Nam, ngộ độc botulinum chủ yếu liên quan đến việc sử dụng các sản phẩm thủy hải sản lên men, xá xị, mắm tôm chế biến không đúng vệ sinh. Phát hiện sớm gene BoNT/E trong mẫu thực phẩm là chìa khóa để ngăn ngừa các vụ ngộ độc tập thể. Phương pháp Real-time PCR tối ưu cho phép phát hiện gen này nhanh chóng, chính xác, hỗ trợ công tác kiểm dịch và bảo vệ sức khỏe cộng đồng hiệu quả.

2.1. Cơ chế gây ngộ độc và biểu hiện lâm sàng

Độc tố botulinum hoạt động tại khớp thần kinh-cơ bằng cách ức chế giải phóng acetylcholine, gây liệt cơ từng bước. Ngộ độc BoNT/E thường bắt đầu với các triệu chứng như mờ mắt, khô miệng, khó nuốt, sau đó tiến triển thành liệt cơ hạn chế và có thể liệt hô hấp. Thời gian ủ bệnh từ vài giờ đến vài ngày tùy liều lượng độc tố tiếp xúc.

2.2. Thực trạng ngộ độc botulinum tại Việt Nam

Các vụ ngộ độc botulinum được ghi nhận chủ yếu từ sản phẩm thủy hải sản lên men và các thực phẩm chế biến truyền thống. Việc phát hiện gene BoNT/E bằng Real-time PCR giúp xác định nguồn gốc và ngăn chặn sớm các vụ ngộ độc, góp phần bảo vệ an toàn thực phẩm quốc gia.

III. Phương pháp Real time PCR phát hiện gene BoNT E trong thực phẩm

Real-time PCR (còn gọi qPCR) là phương pháp phân tử hiện đại cho phép phát hiện và định lượng gene BoNT/E trong mẫu thực phẩm một cách nhạy cảm và chính xác. Phương pháp này dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA đích trong thời gian thực, sử dụng các chất báo hiệu huỳnh quang để theo dõi sự gia tăng sản phẩm PCR. Để tối ưu hóa Real-time PCR phát hiện BoNT/E, cần thiết kế mồi cụ thể, tối ưu chu trình nhiệt, nồng độ mồi và các thông số kỹ thuật khác. Việc sử dụng vector nhân dòng pLUG chứa đoạn gene mã hóa chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E làm mẫu đối chứng giúp xác thực tính đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp. Phương pháp Real-time PCR tối ưu mang lại kết quả nhanh chóng, có độ tin cậy cao, phù hợp cho công tác kiểm soát chất lượng thực phẩm.

3.1. Thiết kế mồi và tối ưu điều kiện PCR

Thiết kế cặp mồi bont/EB3 và bont/EF3 cần đảm bảo độ đặc hiệu cao với gene BoNT/E, tránh tự bắt cặp và tạo dimer. Cần kiểm tra chi tiết bằng phần mềm in silico PCR để xác nhận khả năng khuếch đại đúng đoạn gene. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ hoạt hóa, nồng độ mồi, nồng độ Mg2+, số chu trình PCR để đạt hiệu suất khuếch đại tối đa.

3.2. Sử dụng vector pLUG làm đối chứng dương

Vector pLUG nhân dòng đoạn gene mã hóa chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E (202bp) đóng vai trò là mẫu đối chứng dương. Plasmid này được biến nạp vào vi khuẩn, nhân lên và kiểm chứng trình tự để đảm bảo chính xác. Sử dụng đối chứng này giúp xác thực tính nhạy cảm, độ chính xác và độ tin cậy của Real-time PCR trong phát hiện gene BoNT/E.

IV. Ứng dụng thực tế và hướng phát triển nghiên cứu

Nghiên cứu gene BoNT/E bằng Real-time PCR có ứng dụng quan trọng trong công tác kiểm soát an toàn thực phẩm, phòng chống ngộ độc botulinum ở cộng đồng. Phương pháp này cho phép phát hiện sớm C. botulinum serotype E trong các mẫu thực phẩm đáng ngờ, hỗ trợ các cơ quan y tế và kiểm dịch trong việc truy vết nguồn bệnh và ngăn chặn lây lan. Ngoài ra, Real-time PCR tối ưu có thể được ứng dụng trong các phòng thí nghiệm công nghiệp thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm vệ sinh An toàn thực phẩm Quốc gia, và các đơn vị kiểm soát chất lượng. Hướng phát triển tiếp theo bao gồm: mở rộng phát hiện các serotype BoNT khác, kết hợp với các phương pháp phát hiện khác, và xây dựng hệ thống cảnh báo sớm để bảo vệ sức khỏe cộng đồng toàn diện.

4.1. Ứng dụng trong kiểm soát an toàn thực phẩm

Real-time PCR phát hiện BoNT/E là công cụ hữu ích cho các phòng thí nghiệm kiểm dịch thực phẩm. Phương pháp này cho phép kiểm tra nhanh mẫu thực phẩm nghi ngờ, đặc biệt là các sản phẩm thủy hải sản lên men, giúp phát hiện sớm vi khuẩn C. botulinum serotype E trước khi gây ngộ độc. Kết quả phát hiện có thể được sử dụng để đưa ra quyết định thu hồi sản phẩm, cách ly hàng hoá, và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

4.2. Hướng phát triển và cải tiến phương pháp

Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào: phát triển Real-time PCR multiplex để phát hiện đồng thời nhiều serotype BoNT, xây dựng kỹ thuật digital PCR cho độ nhạy cao hơn, tích hợp với công nghệ next-generation sequencing để xác định chủng vi khuẩn chính xác, và phát triển các kit thương mại tiêu chuẩn hóa cho sử dụng đại trà.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là một vấn đề hết sức cấp thiết, có tính thời sự cao trong đời sống xã hội hiện nay, không chỉ đối với các nƣớc kém phát triển, đang phát triển mà còn ở cả những nƣớc phát triển có trình độ khoa học tiên tiến. Việc bảo đảm an toàn thực phẩm là một trong những nhiệm vụ ƣu tiên hàng đầu mà các cơ quan nhà nƣớc quan tâm đặc biệt và coi đây là một vấn đề có ý nghĩa to lớn về kinh tế, an toàn xã hội, bảo vệ môi trƣờng, sức khỏe toàn dân. Vi khuẩn Clostridium botulinum tạo ra độc tố botulinum gây ngộ độc, một ngộ độc hiếm gặp biểu hiện dƣới dạng các hội chứng lâm sàng khác nhau, từ dạng ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng vết thƣơng đến ngộ độc ở trẻ sơ sinh. Botulinum có độc tính mạnh, chỉ một lƣợng rất nhỏ từ 25 ng đến 50 ng chất độc đã có thể gây tử vong ở ngƣời.

Vi khuẩn Clostridium botulinum serotype E mang gene mã hoá độc tố thần kinh BoNT/E đƣợc phân bố rộng rãi trên thế giới, đặc biệt ở các vùng ven biển. Tại Việt Nam, vấn đề ngộ độc thực phẩm do botulinum hiện chƣa đƣợc quan tâm. Các ca bệnh liên quan đến ngộ độc botulinum chƣa đƣợc thống kê đầy đủ do thói quen tự điều trị các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ đau bụng tiêu chảy hay liệt tạm thời. Năm 2020, ngộ độc do ăn phải đồ ăn chứa độc tố của vi khuẩn C.

botulinum đƣợc ghi nhận khiến nhiều ngƣời tử vong. Sau đó, các vụ ngộ độc do C. botulinum tiếp tục đƣợc ghi nhận tại một số tỉnh trên khắp cả nƣớc nhƣ thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dƣơng, Kon Tum. Chùm ca bệnh tại Kon Tum đƣợc ghi nhận do ăn phải măng rừng khiến 6 ngƣời phải nhập viện và 1 ngƣời trong số đó đã tử vong.

Theo kết quả phân tích từ Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn thực phẩm Quốc gia, các mẫu thực phẩm ngƣời dân ăn phải đều có kết quả xét nghiệm đều dƣơng tính với gene mã hoá độc tố BoNT/E. Đây là trƣờng hợp rất hiếm gặp tại Việt Nam, tuy nhiên cũng là một lời cảnh tỉnh cho ngƣời dân về nguy cơ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bị nhiễm độc. Phƣơng pháp đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện độc tố thần kinh BoNT là xét nghiệm thử độc trên chuột đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng. Bên cạnh đó còn có phƣơng pháp sử dụng miễn dịch ELISA và nuôi cấy, song tất cả các phƣơng pháp này đều có nhƣợc điểm chung là thời gian cho kết quả lâu, độ nhạy và độ chính xác không cao dẫn đến điều trị không kịp thời và làm tăng nguy cơ tử vong.

Bên cạnh đó, phƣơng pháp phát hiện DNA dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, real - time PCR, LAMP. cũng đã đƣợc sử dụng nhằm phát hiện vi khuẩn C. botulinum, các phƣơng pháp này có độ nhạy phân tích và độ đặc hiệu cao, thời gian thực hiện ngắn, cho kết quả nhanh và có thể phát hiện đồng thời đƣợc nhiều loại độc tố. Xuất phát từ thực tế, với mong muốn tìm hiểu và đƣa ra phƣơng pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Clostridium botulinum serotype E nhằm giúp ngƣời nhiễm độc độc tố botulinum có thể đƣợc điều trị kịp thời, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố thần kinh BoNT/E từ mẫu thực phẩm thu thập tại Việt Nam và tối ưu phương pháp real – time PCR xác định sự có mặt của gene’’ với mục tiêu cụ thể nhƣ sau: (i) thiết kế đƣợc cặp mồi đặc hiệu và tạo plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa độc tố BoNT/E để làm đối chứng dƣơng cho các phản ứng nhận diện BoNT/E trong tƣơng lai, (ii) lựa chọn đƣợc điều kiện phù hợp cho phản ứng real – time PCR nhằm phát hiện nhanh đoạn gene mã hoá độc tố BoNT/E và thuận tiện cho việc biểu hiện khi cần cấu trúc chuỗi nhẹ độc tố tái tổ hợp.

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Clostridium botulinum 1.1 Đặc điểm vi khuẩn C. botulinum Đặc điểm hình thái Clostridium botulinum (C. botulinum) là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả năng sinh nội bào tử khi môi trƣờng sống bất lợi. Những thay đổi hình thái cần thiết cho quá trình hình thành bào tử vẫn chƣa có nghiên cúu chính xác, nhƣng các nhà khoa học cho là do điều kiện môi trƣờng có hại cho môi trƣờng sống của vi khuẩn chẳng hạn nhƣ nhiệt độ cao, oxy, bức xạ tia cực tím.

đe dọa sự tồn tại của các tế bào không thể duy trì sự tăng trƣởng sinh dƣỡng [71]. botulinum có mặt nhiều nơi trong tự nhiên đặc biệt những nơi nhƣ đất vƣờn, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm hay trong thực phẩm. botulinum đƣợc tìm thấy trong ruột của các vật nuôi trong nhà, trong ruột cá, đôi khi có cả trong ruột ngƣời và vùng nƣớc bị ô nhiễm. Do vi khuẩn có trong tự nhiên nên thực phẩm dễ bị nhiễm trong quá trình sản xuất chế biến, vận chuyển và bảo quản.

botulinum có khả năng lây nhiễm và phát triển mạnh trong các loại thực phẩm nhƣ thịt cá ƣớp muối, ƣớp lạnh, hun khói, đồ hộp, xúc xích, lạp xƣởng, phomat bị đóng kín. Vì các loại thực phẩm này là môi trƣờng thuận lợi về các điều kiện kỵ khí, nhiệt độ, độ pH và có đầy đủ chất dinh dƣỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh trƣởng. botulinum có khả năng sinh độc tố botulinum gây độc trong điều kiện thƣờng hay ở dạng nội bào tử [22]. Botulinum là độc tố thần kinh, gây tê liệt các bó cơ thần kinh và là nguyên nhân gây tử vong cho con ngƣời và nhiều động vật.

Các nhóm thuộc chi Clostridium này bao gồm các chủng gây bệnh đáng chú ý khác nhƣ Clostridium difficile (hiện đƣợc phân loại lại là Clostridioides difficile), Clostridium tetani và Clostridium perfringenes. Những vi khuẩn này lần lƣợt là nguyên nhân gây ra các bệnh nhƣ tiêu chảy mãn tính, uốn ván và hoại tử [20, 44]. Clostridium botulinum có trong thực phẩm có thể có hoặc không có khả năng gây ngộ độc do vi sinh vật không phát triển thì không có độc tố đƣợc tạo ra. Mặc dù 1 nhiều loại thực phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng cho sự phát triển của C.

botulinum nhƣng không phải tất cả đều cung cấp các điều kiện kỵ khí mà vi khuẩn cần thiết. Các biện pháp ngăn sự tăng trƣởng của C. botulinum trong các loại thực phẩm nhƣ chọn kiểu đóng gói phù hợp, sản phẩm đóng hộp có tính axit (độ pH thấp), có hoạt độ nƣớc thấp, nồng độ NaCl cao, hoặc sử dụng thêm chất bảo quản khác hay kết hợp các điều kiện này lại với nhau. Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển và sinh độc tố của các chủng phân giải protein là 35°C, các chủng không phân giải protein là 26°C - 28°C.

botulinum type B, E và F không phân giải protein có thể sinh độc tố ở nhiệt độ thấp (3°C - 4°C). Tuy nhiên việc hạ thấp nhiệt độ để bảo quản sẽ không ngăn chặn đƣợc sự phát triển và hình thành độc tố của các chủng không phân giải protein trừ khi nhiệt độ đƣợc kiểm soát chính xác và giữ ở mức dƣới 3°C. Độc tố của các chất không phân giải protein không biểu hiện độc tính tiềm ẩn tối đa cho đến khi chúng đƣợc kích hoạt bằng trypsin, độc tố của chất phân giải protein thƣờng xuất hiện ở dạng đƣợc kích hoạt hoàn toàn (hoặc gần nhƣ hoàn toàn). Những khác biệt này có ý nghĩa quan trọng trong việc xem xét dịch tễ học và xét nghiệm về sự bùng phát bệnh ngộ độc.

Chẩn đoán lâm sàng bệnh ngộ độc hiệu quả nhất bằng cách xác định lƣợng độc tố botulinum trong máu, phân hoặc dịch nôn của bệnh nhân, khi đó bệnh phẩm phải đƣợc thu thập trƣớc khi bệnh nhân đƣợc tiêm thuốc kháng độc tố botulinum. Đặc điểm cấu trúc C. botulinum là một loại trực khuẩn gram dƣơng, kỵ khí bắt buộc, hình thành nội bào tử [2, 11, 64]. botulinum có thể di động do có tiên mao và lông nhung, hình dáng thẳng, dài 2-10 µm, bào tử hình bầu dục hoặc hình dùi trống (hình 1.1: Vi khuẩn Clostridium botulinum dưới kính hiển vi Nguồn: http://www.com/tagged/clostridium Tác nhân gây bệnh của vi khuẩn C.

botulinum là do chất độc thần kinh botulinum (BoNT) [5, 29]. BoNT là một metalloprotease, có khả năng cắt các thụ thể protein chứa vùng N-Ethylmaleimide (SNARE) hòa tan trong các đầu dây thần kinh sau khớp thần kinh, ngăn chặn sự giải phóng chất dẫn truyền thần kinh và ngăn chặn sự truyền thần kinh đến các cơ tác động [62]. BoNT có kích thƣớc 150-kDa mang hoạt tính kẽm-endopeptidase [50] bao gồm hai tiểu đơn vị: chuỗi nặng 100 kDa chịu trách nhiệm liên kết và dịch chuyển các chất qua màng khớp thần kinh thông qua các thụ thể cụ thể, chuỗi nhẹ 50 kDa có nhiệm vụ phân cắt các protein liên quan đến túi acetylcholine, lắp ghép và hợp nhất với màng trƣớc synap [49].2: Cấu trúc độc tố botulinum Nguồn: Botulinum Toxin Therapy pp 11–33 BoNT đƣợc sản sinh từ vi khuẩn C. botulinum dƣới dạng độc tố tiền thân gồm phần chất độc thần kinh và phần không gây độc, phần không gây độc này bảo vệ chất độc thần kinh ở điều kiện môi trƣờng tự nhiên, hỗ trợ hấp thu chất độc thần 3 kinh khi độc tố đi vào cơ thể [17] và độc tố gây độc khi tiểu đơn vị đƣợc giải phóng.

Điều này đƣợc cho là có liên quan đến sự phân cắt của phân tử độc tố [8, 51].2 Phân loại vi khuẩn C. botulinum Dựa vào đặc điểm huyết thanh, BoNT đƣợc chia thành 7 loại huyết thanh độc tố từ A đến G (hình 1.3) với các biến thể phân nhóm đƣợc chỉ định trong mỗi loại độc tố có cấu trúc tƣơng tự nhau nhƣng khác nhau về mặt kháng nguyên [25]. Họ chất độc thần kinh này có liều gây chết ở ngƣời ƣớc tính từ 1 đến 3 ng/kg. Do BoNT độc tính cao, dễ sản xuất và trong lịch sử đã đƣợc sử dụng làm vũ khí sinh học nên BoNT đã đƣợc Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) chỉ định là tác nhân đe dọa loại A (các tác nhân loại A đƣợc CDC định nghĩa là những tác nhân dẫn đến tỷ lệ tử vong cao và có khả năng tác động lớn đến sức khỏe, có thể gây hoang mang trong cộng đồng, cần có hành động đặc biệt để chuẩn bị cho sức khỏe mọi ngƣời).

Mặc dù hiện tại có 7 loại huyết thanh kháng nguyên đƣợc biết đến của BoNT nhƣng chỉ có 3 loại huyết thanh là A, B và E liên quan chủ yếu đến tình trạng nhiễm độc ở ngƣời. Các loại kháng nguyên của C.