Đặt vấn đề Trong đời sống và sản xuất, enzyme nói chung và protease nói riêng, được sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua- bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế giới tăng 20-30% mỗi năm. Trước đây, chế phẩm protease được sản xuất chủ yếu từ vi sinh, một số ít từ thực vật, protease thu nhận từ mô động vật rất nhỏ. Gần đây, do những yêu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí kiểm tra chất lượng, giá thành chế phẩm protease từ vi sinh ngày càng cao. Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ mô động vật và thực vật luôn được xem là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại.
Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày càng khan hiếm và không kinh tế do nội tạng thường được làm thực phẩm. Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển nhờ có bở biển trải dài trên 3.000 cây số, khí hậu nhiệt đới là điều kiện đặc biệt thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản. Trong tổng lượng thủy sản, cá là nguyên liệu có vị trí quan trọng hàng đầu. Với 200 loài cá kinh tế, sản lượng 1.000 tấn chiếm 70% tổng sản lượng thủy sản nuôi và khai thác hàng năm, với giá trị dinh dưỡng đặc biệt, cá là nguồn thực phẩm quý không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hàng ngày và nguyên liệu chế biến ra nhiều sản phẩm xuất khẩu, chiếm tỷ trọng ngày càng lớn trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản.
Tuy nhiên, sản lượng cá được sử dụng hữu ích chỉ chiếm khoảng gần 50%. Nghĩa là trong 70.000 tấn phế liệu thì có trên 30.000 tấn nội tạng cá. Theo thói quen, nội tạng cá chỉ được sử dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn bị thải bỏ vào môi trường, vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm. Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học, công nghệ ngành thủy sản là sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng ngày để sản xuất sản phẩm mới, có giá trị cao.
Một trong hướng giải quyết yêu cầu trên là thủy phân nguồn nội tạng cá trên tạo ra sản phẩm mới, có giá SVTH : Nguyễn Anh Tuấn 1 Luận Văn Tốt Nghiệp trị dinh dưỡng, vừa giảm thiểu chất thải, vừa thoải mãn nhu cầu mở rộng mặt hàng thủy sản, nâng cao hiệu quả kinh tế ngành chế biến thủy sản. Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên và sự phân công của bộ môn CNHH tôi đã thực hiện đề tài: Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp. Niger và ứng dụng trong quá trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa dùng chế biến thức ăn gia súc.2 Mục đích đề tài - Nghiên cứu và xây dụng quy trình thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp. - Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease để thủy phân nội tạng cá Ba Sa để sản xuất thức ăn gia súc.3 Nội dung đề tài - Cấy chuyền và thu sinh khối nấm mốc Asp.
- Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp. Niger, tủa bằng cồn lạnh. - Khảo sát các thông số tối ưu ảnh hưởng hoạt động của enzyme protease như nhiệt độ, pH, độ bền nhiệt. - Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel.
- Xác định các thành phần hóa học trong nội tạng cá: Độ ẩm, phospho, canxi, hàm lượng protein, tro, NH3. - Sử dụng enzyme protease để thủy phân nội tạng cá Ba Sa (phế liệu gây ô nhiễm môi trường). Khảo sát nồng độ, pH, nhiệt độ, thời gian tối ưu để quá trình thủy phân xảy ra tốt nhất. - Xác định các thành phần hóa học trong nội tạng cá Ba Sa đã thuỷ phân: Protein theo phương pháp biuret NH3 Đạm amin SVTH : Nguyễn Anh Tuấn 2 Luận Văn Tốt Nghiệp Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Khát quát chung về enzyme 2.1 Sơ lược về lịch sử enzyme Năm 1883, Payen và Persoz đã phân lập được một số chất có trong lúa nảy mầm có khả năng phá vỡ cấu trúc tinh bột thành đường và đặt tên là diastase hiện nay được gọi là amylase. Năm 1867 Wilhelm Kuhne là một nhà vật lý học người Đức lần đầu tiên đề nghị đặt tên “emzyme” thay thế cho từ ferments. Năm 1897 Edward Buchner là một nhà hóa học người Đức đã khám phá ra những tế bào tự do của cao nấm men có khả năng lên men rượu. Năm 1906, Otto Rohm là người đầu tiên nghiên cứu về những việc sử dụng những sản phẩm enzyme vào trong công nghiệp.
Ông đã dùng mô tuyến tụy dể thu nhận trypsin sử dụng trong công nghiệp thuộc da.Summer nhà sinh học của Mỹ đã thành công trong việc tách chiết và kết tinh urease dạng tinh thể từ một loại đậu có tên Jack bean. Northop là nhà sinh hóa học người Mỹ đã thành công trong việc tách chiết và tạo tinh thể pepsin và trypsin. Định nghĩa về enzyme Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (in-vivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (in-vitro).
Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với chất xúc tác hóa học khác. Chính sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do nhiệt độ, áp suất cao, axit mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng SVTH : Nguyễn Anh Tuấn 3 Luận Văn Tốt Nghiệp liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu và nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay axit mạnh. Hiện nay người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt như công nghiệp chế biến thực phẩm (bia, rượu, nước chấm, bánh mì…).3 Tính ưu việt của enzyme Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện “nhẹ nhàng”: nhiệt độ 30 -45oC với áp suất thông thường, pH thường là axit yếu hay trung tính.
Enzyme có tính đặc hiệu cao trên những cơ chất nhất định và xúc tác theo một kiểu phản ứng nhất định. Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể kiểm soát nhẹ nhàng bằng các yếu tố: nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, chất hoạt tính… Enzyme thường có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất trong một thời gian ngắn.4 Nguồn vật liệu để thu nhận enzyme Nguồn nguyên liệu thu nhận thường là tế bào thực vật, mô động vật và vi sinh vật. Từ tuyến tụy và màng dạ dày động vật có thể thu nhận chế phẩm enzyme như: amylase, lipase, proteinase, ribonuclease, đặc biệt là các enzyme như: pepsin, trypsin, chimotrysin. Một số enzyme thu nhận từ thực vật như: papain từ nhựa thân và quả đu đủ, bromelin từ trái dứa hoặc ficin từ các cây quả sung họ ficus.
Tuy nhiên, việc khai thác enzyme từ thực vật và động vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hiện nay phần lớn các enzyme được thu nhận từ tế bào vi sinh vật. So với việc thu nhận enzyme từ các nguồn động vật, thực vật việc sản xuất enzyme từ tế bào vi sinh vật có nhiều ưu điểm như sau: + Vi sinh vật có chu kỳ sinh sản rất ngắn. +Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú. +Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật rất cao.
SVTH : Nguyễn Anh Tuấn 4 Luận Văn Tốt Nghiệp +Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh. +Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme tư vi sinh vật và có thể dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy đề có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất. +Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo qui mô công nghiệp. Những điều kiện cần lưu ý khi quyết định xây dựng hoặc nâng cao năng suất của công nghiệp enzyme như sau: +Giống vi sinh vật: có thể tăng khả năng tổng hợp enzyme bằng nhiều con đường khác nhau.
Trong đó, biện pháp thay đổi yếu tố di truyền (đột biến, tái tổ hợp) đang được quan tâm. + Tối ưu hóa quá trình lên men +Áp dụng những tiến bộ của công nghệ chế tạo máy để tạo ra nhưng thiết bị lên men hiện đại + Áp dụng công nghệ cố định enzyme để sử dụng lặp lại được nhiều lần. Ngày nay, người ta đã tìm được nhiều loại enzyme khác nhau, một số đã được khai thác và sử dụng, trong đó protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong cả đời sống.5 Công nghệ sản xuất enzyme a. Công nghệ sản xuất enzyme Protease ở nước ta Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học.
Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin. sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase.
Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino axit từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu SVTH : Nguyễn Anh Tuấn 5 Luận Văn Tốt Nghiệp bằng enzyme cố định trên cột. Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt- P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc.