Giới thiệu dự án

Ung thư phổi là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu và là nguyên nhân tử vong do ung thư cao nhất trên toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của GLOBOCAN, mỗi năm Việt Nam ghi nhận hơn 20.000 ca mắc mới và trên 17.000 ca tử vong do ung thư phổi. Trong đó, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN - Non-Small Cell Lung Cancer - NSCLC) chiếm tỷ lệ áp đảo từ 80% đến 85%, với thể mô bệnh học chủ yếu là ung thư biểu mô tuyến (Adenocarcinoma).

Vấn đề cốt lõi trong thực hành lâm sàng là đa số bệnh nhân phát hiện bệnh ở giai đoạn tiến triển hoặc di căn xa (Giai đoạn IV). Ở giai đoạn này, phương pháp hóa trị độc tế bào truyền thống mang lại hiệu quả hạn chế, trung vị thời gian sống thêm ngắn và nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng. Sự ra đời của các liệu pháp nhắm trúng đích sử dụng thuốc ức chế Tyrosine Kinase (Tyrosine Kinase Inhibitor - TKI) đã tạo ra bước ngoặt lớn. Tuy nhiên, hiệu quả của thuốc TKI phụ thuộc hoàn toàn vào tình trạng đột biến trên thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR).

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Xác định tỷ lệ và đặc điểm phân bố các dạng đột biến gen EGFR trên 177 bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ giai đoạn IV tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu – Bệnh viện Bạch Mai trong năm 2017.
  2. Phân tích mối tương quan giữa trạng thái đột biến gen EGFR với các yếu tố lâm sàng, cận lâm sàng (tuổi, giới tính, tiền sử hút thuốc, thể mô bệnh học, chỉ số hấp thu phóng xạ cực đại $SUV_{max}$ trên PET/CT và các dấu ấn khối u CEA, Cyfra 21-1).

Phương pháp tiếp cận dựa trên quy trình chuẩn sinh học phân tử: tách chiết DNA từ mẫu mô đúc khối paraffin (FFPE) hoặc dịch màng phổi/màng tim, khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR và phát hiện đột biến thông qua hệ thống lai phân tử đầu dò đặc hiệu (Reverse Hybridization StripAssay).

Hạng mục phạm vi Nội dung chi tiết
Đối tượng nghiên cứu 177 bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV có chỉ định xét nghiệm EGFR
Thời gian thực hiện Từ tháng 01/2017 đến tháng 12/2017
Địa điểm triển khai Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Bệnh viện Bạch Mai
Giới hạn kỹ thuật Khảo sát 30 kiểu đột biến trên 4 exon (18, 19, 20, 21) bằng kit EGFR XL StripAssay

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Hiện nay, việc xác định đột biến EGFR phục vụ chỉ định điều trị đích được thực hiện qua nhiều công nghệ khác nhau với những ưu và nhược điểm riêng biệt.

Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Độ nhạy phát hiện
Giải trình tự Sanger (Direct Sequencing) Phát hiện được mọi đột biến mới, độ đặc hiệu cao Cần hàm lượng tế bào u cao (>20%), tốn thời gian, quy trình phức tạp ~15 - 20%
Real-time PCR (Scorpion ARMS) Độ nhạy rất cao, quy trình khép kín, thời gian nhanh Chi phí cao, chỉ phát hiện các đột biến điểm định trước ~1%
Lai đầu dò ngược (StripAssay) Phân tích đồng thời 30 đột biến trong 1 strip, quy trình chuẩn hóa, chi phí hợp lý Cần kiểm soát nhiệt độ lai nghiêm ngặt ~1 - 2%

Theo mô hình MoSCoW, hệ thống xét nghiệm được thiết kế nhằm đáp ứng:

  • Must-have: Độ nhạy cao với mẫu bệnh phẩm FFPE nghèo tế bào u, bao phủ toàn bộ các đột biến nhạy cảm TKI kinh điển (Exon 19 del, L858R) và đột biến kháng thuốc chính (T790M).
  • Should-have: Khả năng phân tích mẫu dịch màng phổi/màng tim khi không thể lấy mẫu sinh thiết lõi.
  • Could-have: Tự động hóa quá trình đọc kết quả qua phần mềm chuyên dụng để loại bỏ sai số chủ quan.

Thiết kế hệ thống sinh học phân tử

Quy trình xét nghiệm được cấu trúc thành 4 modul liên hoàn:

  1. Module Tiền xử lý & Tách chiết DNA: Tách paraffin bằng Deparaffinization Solution, ly giải tế bào bằng Proteinase K ở 56°C và 90°C, gắn DNA lên cột silica của PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen).
  2. Module Đo kiểm nồng độ: Định lượng DNA sợi đôi đặc hiệu bằng fluorometer huỳnh quang Qubit® 3.0 với Qubit dsDNA HS Assay Kit.
  3. Module Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR): Khuếch đại vùng gen đích từ exon 18 đến exon 21 sử dụng cặp mồi đánh dấu sinh học.
  4. Module Lai phân tử & Nhận diện kết quả: Lai sản phẩm PCR với các oligonucleotide cố định trên thanh thử nghiệm (Teststrip), gắn phức hợp enzyme liên hợp Streptavidin-Alkaline Phosphatase, phát triển phản ứng đổi màu và quét tự động trên phần mềm StripAssay Evaluator® (ViennaLab).
# Cấu hình chu kỳ nhiệt PCR khuếch đại gen EGFR trên máy luân nhiệt
[PHASE_1: Pre-incubation]
Temperature: 37°C  --> Duration: 10 mins  (Enzyme activation)
Temperature: 94°C  --> Duration: 02 mins  (Initial denaturation)

[PHASE_2: Amplification (33 Cycles)]
Step 1: 94°C       --> Duration: 15 secs  (Denaturation)
Step 2: 70°C       --> Duration: 60 secs  (Annealing)
Step 3: 58°C       --> Duration: 90 secs  (Extension)

[PHASE_3: Final Extension & Hold]
Temperature: 60°C  --> Duration: 03 mins  (Final extension)
Temperature: 04°C  --> Duration: Hold     (Storage)

Implementation và kết quả

Quy trình triển khai kỹ thuật

Nghiên cứu tiến hành xử lý 177 mẫu bệnh phẩm theo giao thức chuẩn nghiêm ngặt:

  • Nguồn bệnh phẩm: 80,8% từ sinh thiết kim/nội soi (143 mẫu), 11,3% từ dịch màng phổi/màng tim (20 mẫu) và 7,9% từ mẫu bệnh phẩm sau phẫu thuật (14 mẫu).
  • Vị trí lấy mẫu: Khối u nguyên phát tại phổi chiếm 65,0% (115 mẫu), tổ chức di căn cơ quan khác chiếm 14,7%, dịch tiết chiếm 11,3% và hạch di căn chiếm 9,0%.

Toàn bộ dữ liệu nghiên cứu được chuẩn hóa cấu trúc và phân tích thống kê qua script chuyên dụng trên phần mềm Stata 12.0 và EpiData 3.1:

* Nhập và mã hóa dữ liệu bệnh nhân UTPKPTBN Giai đoạn IV
clear
import delimited "egfr_nsclc_data.csv", encoding("utf-8")

* Kiểm định Chi-square mối tương quan đột biến EGFR với Giới tính và Tiền sử hút thuốc
tabulate gender egfr_mutation, chi2 expected
tabulate smoking_status egfr_mutation, chi2 expected

* So sánh trung bình SUVmax và CEA giữa 2 nhóm đột biến bằng Two-sample t-test
ttest suvmax_tumor, by(egfr_mutation)
ttest cea_level, by(egfr_mutation)

Kết quả đột biến gen EGFR đạt được

Trong tổng số 177 bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV, nghiên cứu phát hiện 71 bệnh nhân mang đột biến gen EGFR, đạt tỷ lệ 40,1%.

Phân bố 78 đột biến EGFR phát hiện được trên 71 bệnh nhân:
Exon 19 Deletion  [██████████████████████████████] 52.6% (41 đột biến)
Exon 21 L858R/Q   [██████████████████]             34.6% (27 đột biến)
Exon 20 T790M     [████]                           7.7%  (6 đột biến)
Exon 18 G719X     [███]                            5.1%  (4 đột biến)
  • Tỷ lệ đột biến kép: 7 bệnh nhân (9,9% trong nhóm có đột biến) mang đồng thời 2 dạng đột biến, trong đó có 6 trường hợp mang 1 đột biến nhạy cảm kết hợp với đột biến kháng thuốc T790M.
  • Tính nhạy cảm với điều trị đích: 92,3% các đột biến ghi nhận thuộc nhóm làm tăng tính nhạy cảm với TKI thế hệ 1 (Erlotinib, Gefitinib). Đột biến nguyên phát gây kháng thuốc T790M chiếm 7,7%.

Mối liên quan giữa đột biến EGFR với các yếu tố lâm sàng & cận lâm sàng

Yếu tố phân tích Nhóm phân loại Tổng số (N) Phát hiện đột biến (n, %) Giá trị p
Giới tính Nữ 51 34 (66,7%) p < 0,0001
Nam 126 37 (29,4%)
Hút thuốc lá Không hút thuốc 65 37 (56,9%) p = 0,001
Đã/đang hút thuốc 112 34 (30,4%)
Nhóm tuổi < 40 tuổi 5 3 (60,0%) p = 0,676
40 - 59 tuổi 71 28 (39,4%)
≥ 60 tuổi 101 40 (39,6%)
Mô bệnh học Biểu mô tuyến 171 69 (40,3%) p = 0,730
Biểu mô vảy 6 2 (33,3%)
Chất chỉ điểm CEA Bình thường (<4,3 ng/mL) 61 24 (38,6%) p = 0,935
Tăng (≥4,3 ng/mL) 116 44 (37,9%)
Chỉ số $SUV_{max}$ u Trung bình tại u phổi 59 (PET/CT) 10,2 (nhóm đột biến) p = 0,916

Đổi mới và đóng góp

Cải tiến kỹ thuật xét nghiệm

Đề tài đã chuẩn hóa thành công quy trình ứng dụng công nghệ StripAssay (ViennaLab) trên các dạng bệnh phẩm phức tạp của bệnh nhân ung thư giai đoạn cuối. Phương pháp này cho phép phát hiện song song 30 biến thể đột biến điểm và mất đoạn chỉ trong một phản ứng lai duy nhất, khắc phục nhược điểm thao tác đa ống dễ nhiễm chéo của PCR truyền thống.

So sánh tỷ lệ phát hiện đột biến EGFR qua các nghiên cứu:

Đóng góp cho y học thực chứng

  • Xác lập bằng chứng khoa học vững chắc về tính ưu việt của phân nhóm: Nữ giới có tỷ lệ đột biến cao gấp 2,27 lần nam giới ($66,7%$ vs $29,4%$) và người không hút thuốc lá có tỷ lệ đột biến cao gấp 1,87 lần người hút thuốc ($56,9%$ vs $30,4%$).
  • Ghi nhận sự gia tăng của tỷ lệ đột biến kháng thuốc Exon 20 (T790M đạt $7,7%$), cảnh báo các nhà lâm sàng cần chú trọng phát hiện đột biến kháng thuốc ngay từ giai đoạn ban đầu để xây dựng chiến lược điều trị bước hai hoặc cân nhắc TKI thế hệ 3 (Osimertinib).

Ứng dụng thực tế và triển khai

Hướng dẫn ứng dụng điều trị cá thể hóa (Precision Medicine)

Kết quả phân tích EGFR đóng vai trò là tiêu chuẩn vàng định hướng phác đồ điều trị cho bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV theo khuyến cáo NCCN và ESMO:

  1. Dương tính với đột biến Exon 19 del hoặc Exon 21 L858R: Ưu tiên sử dụng thuốc nhắm trúng đích phân tử nhỏ EGFR-TKI (Gefitinib, Erlotinib, Afatinib). Phác đồ này kéo dài thời gian sống không tiến triển (PFS) vượt trội so với phác đồ hóa trị Platinum kép.
  2. Xuất hiện đột biến kháng thuốc T790M: Định hướng chuyển đổi sớm sang thuốc TKI thế hệ 3 (Osimertinib) hoặc cân nhắc kết hợp kháng thể đơn dòng.

Hiệu quả kinh tế y tế

Việc chỉ định xét nghiệm EGFR thường quy trước điều trị giúp tránh lãng phí chi phí hóa trị không đáp ứng, giảm thiểu số ngày nằm viện do độc tính hóa chất và nâng cao chất lượng sống (QoL) cho bệnh nhân giai đoạn cuối.

Hạn chế và hướng phát triển

  • Hạn chế mẫu đơn trung tâm: Dù cỡ mẫu đạt 177 bệnh nhân giai đoạn IV, nghiên cứu được thực hiện tại một trung tâm duy nhất (Bệnh viện Bạch Mai).
  • Hạn chế kỹ thuật đơn gen: Chưa phân tích đồng thời các đột biến sinh ung quan trọng khác trong NSCLC như đột biến tái sắp xếp gen ALK, ROS1, BRAF, hoặc khuếch đại MET.
  • Định hướng phát triển:
    • Ứng dụng kỹ thuật sinh thiết lỏng (Liquid Biopsy) phân tích DNA tự do của khối u trong máu (ctDNA/cfDNA) cho những trường hợp bệnh nhân không thể thực hiện sinh thiết mô xâm lấn.
    • Chuyển đổi sang hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) với các panel đa gen toàn diện.

Đối tượng hưởng lợi

  • Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu & Hô hấp: Có căn cứ dữ liệu dịch tễ học phân tử thực tế tại Việt Nam để ra quyết định điều trị đích chính xác cho bệnh nhân giai đoạn IV.
  • Kỹ thuật viên & Cử nhân Xét nghiệm Y học: Nắm vững quy trình xử lý mẫu FFPE, giao thức PCR và kỹ thuật lai đầu dò ngược StripAssay chuẩn mực.
  • Bệnh nhân ung thư phổi: Được tiếp cận phác đồ điều trị trúng đích cá thể hóa, giảm tác dụng phụ độc tế bào, kéo dài thời gian sống có chất lượng.
  • Sinh viên & Học viên Sau đại học khối ngành Y Dược: Tài liệu tham khảo học thuật giá trị về thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang, xử lý số liệu y sinh và cơ chế sinh học phân tử của thụ thể EGFR.

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật đối với mẫu bệnh phẩm để làm xét nghiệm EGFR là gì?

Mẫu mô sinh thiết hoặc mẫu phẫu thuật phải được cố định trong dung dịch Formalin đệm trung tính $10%$ và đúc khối paraffin (FFPE). Lượng tế bào u trong lát cắt tối thiểu nên đạt từ $10%$ đến $20%$. Trong trường hợp không có mô sinh thiết, dịch màng phổi/màng tim có chứa tế bào ác tính đúc khối tế bào (Cell Block) vẫn đáp ứng tốt yêu cầu tách chiết DNA.

2. Sự khác biệt cơ bản giữa đột biến Exon 19 và Exon 20 là gì?

Đột biến trên Exon 19 (phổ biến nhất là mất đoạn E746_A750del) làm biến đổi cấu trúc không gian của miền Tyrosine Kinase, làm tăng ái lực của thụ thể với các thuốc TKI thế hệ 1 (nhạy cảm với thuốc). Ngược lại, đột biến T790M trên Exon 20 làm thay đổi vị trí gắn kết của ATP, ngăn cản thuốc TKI gắn vào miền kinase, dẫn đến hiện tượng đề kháng thuốc.

3. Xét nghiệm StripAssay có thể tích hợp vào các phòng xét nghiệm bệnh viện tuyến tỉnh không?

Hoàn toàn khả thi. Kỹ thuật StripAssay không đòi hỏi hệ thống máy giải trình tự NGS đắt tiền mà chỉ cần trang bị máy luân nhiệt PCR thông thường, máy ủ nhiệt và máy quét teststrip, phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của nhiều bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh hiện nay.

4. Bệnh nhân có kết quả EGFR âm tính thì nên điều trị như thế nào?

Đối với bệnh nhân không mang đột biến gen EGFR (Wild-type), điều trị đích bằng TKI đơn thuần không mang lại hiệu quả vượt trội. Bác sĩ sẽ chỉ định phác đồ hóa trị toàn thân kết hợp Platinum hoặc xét nghiệm bổ sung các dấu ấn sinh học khác như biểu hiện PD-L1 để chỉ định liệu pháp miễn dịch (Immunotherapy).

5. Chi phí và thời gian trả kết quả xét nghiệm EGFR trung bình là bao nhiêu?

Quy trình kỹ thuật hoàn thiện từ khâu xử lý mô, tách chiết DNA, chạy PCR đến phân tích dải lai mất khoảng 24 đến 48 giờ làm việc, chi phí tiết kiệm hơn đáng kể so với giải trình tự toàn bộ hệ gen NGS.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Thị Hoài Thu đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu đề ra, cung cấp bức tranh toàn diện và chính xác về tình trạng đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ giai đoạn IV tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017:

  • Tỷ lệ đột biến EGFR đạt 40,1%, trong đó hai nhóm đột biến nhạy cảm TKI kinh điển chiếm ưu thế tuyệt đối là Exon 19 ($52,6%$) và Exon 21 ($34,6%$).
  • Xác định rõ mối tương quan có ý nghĩa thống kê cao giữa trạng thái đột biến với giới tính nữ ($p < 0,0001$) và tiền sử không hút thuốc lá ($p = 0,001$).
  • Khẳng định giá trị thực tiễn bắt buộc của việc xét nghiệm đột biến gen thường quy cho mọi bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn tiến triển, đặt nền móng vững chắc cho việc ứng dụng y học chính xác và tối ưu hóa hiệu quả điều trị ung thư phổi tại Việt Nam.