Tổng quan luận án

Tôm sú (Penaeus monodon Fabricius, 1798) là loài giáp xác có kích thước lớn và giữ vị trí là đối tượng nuôi kinh tế chủ lực trong ngành xuất khẩu thủy sản của Việt Nam. Theo số liệu thống kê năm 2016, diện tích nuôi tôm nước lợ của cả nước đạt 649.645 ha với sản lượng 657.282 tấn, mang lại giá trị xuất khẩu trên 3,15 tỷ USD. Chiến lược phát triển ngành tôm đặt mục tiêu đến năm 2025 đạt kim ngạch xuất khẩu 10 tỷ USD, sản lượng 1,1 triệu tấn trên diện tích 750.000 ha; trong đó nhu cầu nguồn tôm bố mẹ là khoảng 500.000 con (riêng tôm sú bố mẹ cần 100.000 con/năm) và nhu cầu tôm giống đạt khoảng 130 tỷ con/năm (với 30 tỷ con giống tôm sú). Mặc dù có tiềm năng kinh tế lớn, nghề nuôi tôm sú tại Việt Nam vẫn phụ thuộc phần lớn vào nguồn tôm bố mẹ khai thác ngoài tự nhiên, dẫn đến giá thành cá thể thành thục tăng cao (có thời điểm lên đến hàng chục triệu đồng/con) trong khi trữ lượng tự nhiên suy giảm. Bên cạnh đó, các thách thức về dịch bệnh virus (WSSV, YHV, IHHNV, LSNV), hiện tượng mặn hóa nước ngầm, suy giảm rừng ngập mặn và sự cạnh tranh từ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sạch bệnh đặt ra yêu cầu phải gia hóa và nâng cao chất lượng di truyền đàn tôm bố mẹ bản địa.

Khoảng trống nghiên cứu lớn hiện nay là các nghiên cứu về di truyền phân tử trên tôm sú còn ít, các thông tin về locus tính trạng số lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng rất hiếm. Các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam hầu hết chỉ tập trung trên hệ phiên mã (transcriptome) của mô cơ hoặc gan tụy và khảo sát trên các quần thể hẹp, chưa giải mã và khai thác đầy đủ biến dị trên toàn bộ hệ gen (genome) để phục vụ công tác chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (MAS). Đề tài "Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm" được thực hiện trong khuôn khổ Đề tài cấp Nhà nước "Lập bản đồ bộ gen tôm sú (Penaeus monodon)" thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể gồm:

  1. Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam.
  2. Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.

Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm 4 nhiệm vụ: (1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển khác nhau của Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP; (2) Lai hỗn hợp 4 dòng tôm sú bố mẹ khác nhau về nguồn gốc địa lý để tạo vật liệu nghiên cứu thế hệ Go và G1; (3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự (GBS) để phân tích hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm thế hệ Go và G1 nhằm sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng; (4) Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm năng ứng dụng của SNP này đối với việc đánh giá các cá thể tôm nhằm hỗ trợ công tác chọn giống tôm sú.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798).
  • Phạm vi không gian:
    • Mẫu tôm tự nhiên đánh giá đa hình AFLP thu thập tại ba vùng biển: Bắc Trung Bộ (Nghệ An), Nam Trung Bộ (Khánh Hòa) và Nam Bộ (Bạc Liêu).
    • Mẫu bố mẹ tạo dòng lai gồm 4 nguồn địa lý: Ấn Độ Dương (nhập từ Thái Lan - biển Andaman và Myanmar), Thái Bình Dương (nhập từ Singapore), Nội địa (Cà Mau, Đà Nẵng, Phú Yên) và Gia hóa (Công ty Moana Ninh Thuận).
  • Phạm vi thời gian và thực nghiệm: Quá trình theo dõi tăng trưởng thế hệ Go và G1 được tiến hành trong 80 ngày nuôi chung an toàn sinh học (tương đương 4 tháng tuổi tính từ giai đoạn hậu ấu trùng PL15 đến khi đạt khối lượng thương phẩm khoảng 25g).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về phân loại học, đặc điểm sinh học, lịch sử phát triển nghề nuôi tôm sú và các kỹ thuật chỉ thị phân tử trên thế giới và tại Việt Nam. Về mặt phân loại, tôm sú thuộc ngành Arthropoda, phân ngành Crustacea, lớp Malacostraca, bộ Decapoda, họ Penaeidae, chi Penaeus (Brusca et al., 1990; Motoh, 1985). Tác giả dẫn chứng các mốc lịch sử nuôi tôm từ nghiên cứu của Motosaku Fujinaga (1934) tại Nhật Bản về khép kín vòng đời Penaeus japonicus, các nghiên cứu chuyển giao công nghệ sang Mỹ và Đài Loan (Kungvankij, 1984), đến giai đoạn suy giảm sản lượng do dịch bệnh đốm trắng và khủng hoảng môi trường tại Đài Loan năm 1988, Trung Quốc năm 1994, Thái Lan, Indonesia và Ecuador (Chanratchakool, 2003; Aziz et al., 2007; Briggs et al., 2004). Các công trình nghiên cứu công nghệ sản xuất giống và gia hóa tôm sú trên thế giới được ghi nhận từ Aquacop (1979), Primavera (1985), Chamberlain & Gervais (1984), Chong & Khoo (1988), Withyachumnarnkul et al. (1998) và Coman et al. (2005).

Về kỹ thuật chỉ thị phân tử, văn bản phân tích ưu nhược điểm của các hệ thống chỉ thị:

  • RAPD: Khuếch đại ngẫu nhiên đoạn DNA bằng mồi 10 nucleotide (Williams et al., 1990; Vaseeharan et al., 2013; Liu & Cordes, 2004). Kỹ thuật này đã được Tassanakajon et al. (1997, 1998) dùng để đánh giá 3 quần thể tôm sú Thái Lan (84 primer cho sản phẩm), Garcia & Benzie (1995) phát hiện tỷ lệ đa hình 6-7% ở P. monodon.
  • RFLP: Phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế bằng lai đoạn dò Southern (Graner et al., 1991; Lander & Botstain, 1989; Nguyễn Đức Thành, 2014), kết hợp với mtDNA nghiên cứu quần thể tôm sú Ấn Độ Dương - Thái Bình Dương (Benzie et al., 2002).
  • Microsatellite: Trình tự lặp lại ngắn đơn giản hoặc phức tạp, phân bố đều trên hệ gen với tần số đột biến khoảng $10^{-2}$/thế hệ (Weber & Wong, 1993; Crawford & Cuthbertson, 1996; Liu et al., 2001c; Karsi et al., 2002). Chỉ thị microsatellite được Pan et al. (2004) dùng với 23 locus, Brooker et al. (2000) phân tích 3 locus Pmo9, Pmo25, Pmo27 trên 312 mẫu tôm, Wuthisuthimethavee et al. (2005) lập bản đồ liên kết 103,6 cM gồm 9 nhóm liên kết trên 76 cá thể F1 (Join-Map 2.0, LOD 5), và Aziz et al. (2011) khảo sát 30 cặp mồi microsatellite tại Malaysia (3-36 alen/locus, kích thước 100-275 bp).
  • mtDNA: Nghiên cứu của Klinbunga et al. (2001) trên gen 16S và COI-COII phân biệt quần thể biển Andaman và vịnh Thái Lan ($p < 0,0001$), Khamnamtong et al. (2009) khảo sát đa hình gen COI với độ đa dạng nucleotide 6,604%.
  • SNP và công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS/GBS): Baranski et al. (2014) lập bản đồ liên kết mật độ cao ở P. monodon với 3959 SNP thuộc 44 nhóm liên kết từ 1024 cá thể thuộc 7 gia đình bằng chip Illumina iSelect 6000 SNP. Jones et al. (2017) xác định 234.452 SNP trên Litopenaeus vannamei và tích hợp 8.967 SNP vào chip thương mại Illumina Infinium ShrimpLD-24 v1.0. Các nghiên cứu SNP liên quan đến tính trạng sinh sản và tăng trưởng còn có Klinbunga et al. (2015) trên gen thụ thể vitellogenin (PmVtgr) và Prasertlux et al. (2011) trên gen protein gắn kết X-box 1 (PmXbp1).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu di truyền tôm sú trước đây gồm có: Quyền Đình Thi et al. (2003); Nguyễn Thị Thảo et al. (2004) phân tích đa hình microsatellite trên 3 quần đàn tôm; Kim Thị Phương Oanh et al. (2010) phân tích vùng D-loop ty thể phát hiện 19 kiểu đơn bội mới ở tôm sú Hải Phòng; Kim Thị Phương Oanh et al. (2014) giải mã 283 đoạn cDNA/EST; Nguyễn Hải Bằng et al. (2015) lắp ráp de novo transcriptome từ mô cơ và gan tụy tôm sú Bắc Trung Bộ thu được 17.406 unigene (N50 = 402 bp), sàng lọc 51 unigene liên quan tăng trưởng và 16.148 unigene sai khác biểu hiện; Nguyễn Giang Thu et al. (2015) sàng lọc từ transcriptome 484 SNP liên quan tăng trưởng từ 30 mẫu tự nhiên và 2650 SNP từ 20 mẫu gia hóa G1 (1832 SNP chỉ có ở nhóm lớn nhanh, 64 SNP chỉ có ở nhóm lớn chậm, 754 SNP chung).

Vị trí của luận án: Trong khi các nghiên cứu trong nước trước đó chỉ dừng lại ở transcriptome mô cơ/gan tụy hoặc phân tích quần thể hẹp, luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống nghiên cứu hệ gen (genome) tổng thể bằng cách kết hợp kỹ thuật AFLP để đánh giá đa dạng di truyền tự nhiên 3 miền, áp dụng công nghệ GBS để sàng lọc trực tiếp các SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng trên đàn tôm lai 4 dòng (thế hệ Go, G1) và ứng dụng kỹ thuật KASP để thẩm tra kiểu gen phục vụ chọn giống thực tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về di truyền học phân tử, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS), nguyên lý đa hình chiều dài đoạn khuếch đại chọn lọc (AFLP), nguyên lý làm giảm tính phức tạp của hệ gen bằng enzyme cắt hạn chế kết hợp giải trình tự thế hệ mới (GBS) và cơ chế chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang trong phản ứng PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được bố trí cụ thể như sau:

  1. Nguồn mẫu và vật liệu:
  • Mẫu AFLP: Thu thập trên 50 mẫu/quần đàn từ 3 vùng biển: Bắc Trung Bộ (BTB - Nghệ An), Nam Trung Bộ (NTB - Khánh Hòa) và Nam Bộ (NB - Bạc Liêu). Quy chuẩn thu mẫu: Đánh bắt xa bờ cách bờ tối thiểu 7 km (quanh các đảo), thu rải rác 3-5 mẫu/ngày nhằm tránh trùng lặp quan hệ phả hệ gia đình. Bảo quản mẫu trong cồn 95-100% hoặc lạnh sâu.
  • Mẫu bố mẹ tạo thế hệ Go và G1: Tổng số 836 cá thể (>100g/con) thuộc 4 dòng tôm bố mẹ:
Dòng tôm Ký hiệu Tôm cái ($\female$) Tôm đực ($\male$) Tổng số (con) Nguồn gốc địa lý
Ấn Độ Dương A 76 71 147 Thái Lan (biển Andaman), Myanmar
Thái Bình Dương T 86 58 144 Singapore
Nội địa N 236 186 422 Cà Mau, Đà Nẵng, Phú Yên
Gia hóa G 62 61 123 Công ty Moana Ninh Thuận
Tổng cộng 460 376 836
  • Mẫu sàng lọc SNP (GBS): Chia thành 4 nhóm với tổng cộng 240 cá thể:
Ký hiệu nhóm Thế hệ Tính trạng tăng trưởng Số lượng cá thể ($\female, \male$)
Nhóm I Go Nhanh (Fast - F) 60 (30 $\female$, 30 $\male$)
Nhóm II Go Chậm (Slow - S) 60 (30 $\female$, 30 $\male$)
Nhóm III G1 Nhanh (Fast - F) 60 (30 $\female$, 30 $\male$)
Nhóm IV G1 Chậm (Slow - S) 60 (30 $\female$, 30 $\male$)
  • Mẫu kiểm chứng KASP: Gồm 40 cá thể tôm sú cái tăng trưởng nhanh thế hệ G1 do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II cung cấp.
  1. Quy trình kiểm soát an toàn sinh học và tạo đàn lai:
  • Tôm bố mẹ được sát trùng bằng dung dịch Povidone iodine 20 ppm.
  • Nuôi cách ly sơ cấp: Từng cá thể nuôi riêng trong thùng xốp 40 lít, cho ăn mực, hầu, trùn biển (7-10% khối lượng thân, 3 lần/ngày). Tầm soát 4 loại virus: WSSV, YHV, IHHNV, LSNV.
  • Nuôi cách ly thứ cấp: Nuôi trong hệ thống bể tuần hoàn kín $60-70\text{ m}^3$ lót cát, nước khử trùng bằng chlorine 30 ppm và trung hòa bằng thiosulphate. Tôm cái được bấm dấu mắt và buộc dây đuôi theo dõi lột xác để cấy tinh nhân tạo.
  • Lai tổ hợp toàn phần $4 \times 4$ tạo thế hệ Go (gồm 4 phép lai nội dòng: AA, TT, NN, GG và 12 phép lai khác dòng: AT, AN, AG, TA, TN, TG, NA, NT, NG, GA, GT, GN).
  • Ương nuôi riêng từng gia đình đến khối lượng 2g, sau đó chọn ngẫu nhiên 35 cá thể/gia đình, đánh dấu bằng phẩm màu huỳnh quang (VIE), đưa vào nuôi chung trong 4 bể an toàn sinh học trong 80 ngày để đánh giá tốc độ sinh trưởng đến khối lượng trung bình 25g.
  • Ghép phối các cá thể Go theo sơ đồ thiết kế để tạo thế hệ con G1.
  1. Kỹ thuật sinh học phân tử và phân tích dữ liệu:
  • Tách chiết DNA: Sử dụng 100 mg mô cơ thân theo phương pháp Eurobiobank (2004) kết hợp đệm ly giải tế bào (Lysis buffer), proteinase K ($55^\circ\text{C}$ trong 2 giờ), chiết tách bằng Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (PCI tỷ lệ 25:24:1) và Chloroform:Isoamyl alcohol (CI tỷ lệ 24:1), kết tủa bằng isopropanol và rửa bằng ethanol 70%. Tinh sạch bằng PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies). Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch bằng máy quang phổ NanoDrop ở bước sóng 260 nm và 280 nm; kiểm tra độ toàn vẹn trên gel agarose 1% (100V, 45 phút).
  • Phân tích AFLP: Cắt DNA bằng cặp enzyme cắt hạn chế EcoRI và MseI, gắn adaptor tương ứng. Thực hiện PCR tiền khuếch đại với mồi EcoRI+A và MseI+C; PCR khuếch đại chọn lọc với mồi gắn huỳnh quang EcoRI-ACC JOE ($1\ \mu\text{M}$) và MseI-CTT ($5\ \mu\text{M}$). Điện di mao quản trên máy ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer với polymer POP-7 và thang chuẩn GeneScan-500 ROX. Xử lý và đọc tín hiệu peak huỳnh quang bằng phần mềm GeneMapper Software Version 4.1.
  • Phân tích GBS: Cắt DNA bằng enzyme ApeKI, gắn Barcode adaptor và Common adaptor, tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit, khuếch đại PCR với Taq Master Mix và giải trình tự trên hệ thống máy Illumina NextSeq500. Xử lý dữ liệu bằng các thuật toán tin sinh học để lắp ráp contig, sàng lọc SNP và chú giải chức năng gen.
  • Phân tích KASP: Sử dụng KASP Master mix (LGC Genomics) và mồi đặc hiệu:
    • Mồi xuôi alen kiểu dại (gắn HEX-tail): 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGAGCTCCTTCGGCC-3’
    • Mồi xuôi alen kiểu đột biến (gắn FAM-tail): 5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCACGCATCTTGGTCTTCTCC-3’
    • Mồi ngược: 5’-CGCACGCATCTTGGTCTTCTCC-3’ Tín hiệu huỳnh quang FRET được ghi nhận để phân định kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp các cơ sở dữ liệu khoa học về tôm sú Penaeus monodon và các phương pháp nghiên cứu hệ gen ứng dụng trong thủy sản:

  • Đặc điểm sinh thái và phân bố địa lý: Tôm sú phân bố từ kinh độ $30^\circ\text{E}$ đến $155^\circ\text{E}$, vĩ độ $35^\circ\text{N}$ đến $35^\circ\text{S}$. Tôm có khả năng thích ứng độ mặn rộng từ 2‰ đến 40‰ (giai đoạn ấu trùng thích ứng 28-32‰, giai đoạn lớn 10-15‰, giai đoạn 50-70g có thể chịu dưới 5‰, khi sinh sản quay lại vùng biển độ mặn cao). Vòng đời trải qua 6 giai đoạn: Phôi (12-15 giờ), Nauplius (N1-N6, kéo dài 2-3 ngày, dinh dưỡng bằng noãn hoàng), Zoea (Z1-Z3, kéo dài 4-5 ngày, ăn tảo khuê), Mysis (M1-M3, kéo dài 3-4 ngày, ăn luân trùng và ấu trùng Artemia), Hậu ấu trùng (Postlarvae, 5-6 tuần thành tôm giống), và Tôm giống (6-8 tháng thành tôm trưởng thành tham gia sinh sản).
  • Tình hình sản xuất giống và nuôi thương phẩm: Trình bày chi tiết lịch sử nuôi tôm thế giới từ năm 1934, sự thống trị của tôm sú trong thập niên 1980 với năng suất thâm canh trên 10 tấn/ha (cỡ 30g/con), tiếp sau đó là sự sụt giảm sản lượng do dịch bệnh đốm trắng thập niên 1990 và xu hướng chuyển đổi sang tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (L. vannamei). Tại Việt Nam, tôm sú chiếm 50-60% sản lượng nuôi nhờ ưu thế sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long.
  • Cơ sở lý thuyết các hệ thống chỉ thị phân tử: Phân tích nguyên lý, ưu điểm và hạn chế của các phương pháp RAPD, RFLP, Microsatellite, SNP và AFLP.
  • Đánh giá hiện trạng ứng dụng công nghệ gen: Điểm lại các công trình xây dựng bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng quần thể tôm sú quốc tế và trong nước; phân tích nguyên lý hoạt động của công nghệ giải trình tự GBS (làm giảm độ phức tạp hệ gen qua enzyme cắt hạn chế, giải trình tự thông lượng cao NGS) và kỹ thuật chẩn đoán kiểu gen KASP (tỷ lệ lỗi chỉ 0,7-1,6%, không cần xử lý sau PCR).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết các quy trình bố trí thí nghiệm, nguồn gốc sinh học của các mẫu vật liệu và các bước kỹ thuật phân tích:

  • Thu thập và xử lý vật liệu: Phương pháp thu gom tôm tự nhiên tại Nghệ An, Khánh Hòa, Bạc Liêu và quản lý 836 cá thể bố mẹ thuộc 4 dòng (Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Nội địa, Gia hóa).
  • Quy trình an toàn sinh học: Mô tả quy trình cách ly sơ cấp (thùng xốp 40L riêng biệt, khử trùng Povidone iodine 20 ppm) và thứ cấp (bể tuần hoàn kín $60-70\text{ m}^3$, xử lý chlorine 30 ppm), phác đồ kiểm soát 4 loại mầm bệnh virus nguy hiểm (WSSV, YHV, IHHNV, LSNV).
  • Thiết lập sơ đồ lai: Lai tổ hợp toàn phần $4 \times 4$ gồm 16 công thức phối ghép tạo thế hệ Go:
Tôm đực ($\male$) \ Tôm cái ($\female$) Dòng A Dòng T Dòng N Dòng G
Dòng A AA TA NA GA
Dòng T AT TT NT GT
Dòng N AN TN NN GN
Dòng G AG TG NG GG

(Ghi chú: A: Ấn Độ Dương; T: Thái Bình Dương; N: Nội địa; G: Gia hóa)

  • Kỹ thuật nuôi chung và phân loại: Quy trình ương riêng từng gia đình đến 2g, chọn 35 cá thể/gia đình, đánh dấu huỳnh quang VIE và nuôi chung trong 4 bể trong 80 ngày để phân loại nhóm tăng trưởng nhanh và nhóm tăng trưởng chậm (mỗi nhóm chọn 60 cá thể gồm 30 đực và 30 cái ở cả thế hệ Go và G1).
  • Quy trình sinh học phân tử: Tách chiết DNA mô cơ theo Eurobiobank (2004) bằng dung dịch PCI/CI, tinh sạch qua cột PureLink, kiểm tra quang phổ NanoDrop và điện di agarose 1%. Chi tiết các thông số phản ứng cắt kiểm tra enzyme EcoRI và MseI, phản ứng gắn adaptor, phản ứng PCR tiền khuếch đại và khuếch đại chọn lọc AFLP trên hệ thống ABI PRISM 3100 qua phần mềm GeneMapper v4.1; quy trình giải trình tự GBS với enzyme ApeKI trên máy Illumina NextSeq500; quy trình phản ứng KASP với bộ mồi chuyên biệt và KASP Master mix của hãng LGC Genomics.

Kết quả và những đóng góp mới

Các kết quả và đóng góp mới của luận án được tổng hợp từ dữ liệu phân tích di truyền phân tử:

  1. Đóng góp khoa học:
  • Luận án là công trình đầu tiên đưa ra đánh giá về đa dạng di truyền của ba quần đàn tôm sú tự nhiên thu từ các vùng biển Việt Nam (Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Nam Bộ) bằng kỹ thuật AFLP trên hệ thống điện di mao quản tự động ABI PRISM 3100.
  • Sàng lọc và thiết lập được bộ dữ liệu chỉ thị SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm thông qua công nghệ giải trình tự GBS trên hệ thống Illumina NextSeq500.
  • Xác định được 2 chỉ thị SNP nằm trong vùng exon của gen mã hóa chuỗi nặng Myosin (Myosin Heavy Chain - MHC). Đây là phát hiện đầu tiên về chỉ thị SNP nằm trong vùng exon của gen MHC ở các loài thuộc họ giáp xác:
    • Chỉ thị SNP thứ nhất: Contig83953:g.20T>C trên gen MHCa, làm biến đổi bộ ba mã hóa (codon) từ AAA thành AAG. Đây là đột biến đồng nghĩa, không làm thay đổi acid amin Lysine.
    • Chỉ thị SNP thứ hai: Contig260347:g.19G>A trên gen MHC1, làm biến đổi bộ ba mã hóa từ GGA (mã hóa Glycine) thành GAA (mã hóa Glutamic acid). Đây là đột biến sai nghĩa làm thay đổi cấu trúc acid amin của chuỗi polypeptide.
  1. Đóng góp thực tiễn và ứng dụng kiểm chứng:
  • Thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu và áp dụng kỹ thuật KASP để thẩm tra chỉ thị SNP G>A trên 40 cá thể tôm sú cái thế hệ G1 tăng trưởng nhanh, cho kết quả phân định kiểu gen rõ rệt:
    • 28 cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến A:A.
    • 2 cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại G:G.
    • 10 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử G:A.
  • Kết quả cho thấy tỷ lệ cá thể mang alen A chiếm ưu thế vượt trội (38/40 cá thể mang alen A ở dạng đồng hợp tử hoặc dị hợp tử) trong nhóm tôm tăng trưởng nhanh.
Chỉ thị SNP Vị trí gen Biến đổi codon Biến đổi acid amin Loại đột biến Kết quả kiểm tra KASP trên 40 cá thể G1 lớn nhanh
Contig83953:g.20T>C Exon gen MHCa AAA $\rightarrow$ AAG Lysine $\rightarrow$ Lysine Đồng nghĩa Chưa thiết kế KASP
Contig260347:g.19G>A Exon gen MHC1 GGA $\rightarrow$ GAA Glycine $\rightarrow$ Acid Glutamic Sai nghĩa 28 đồng hợp tử A:A; 2 đồng hợp tử G:G; 10 dị hợp tử G:A
  1. Kiến nghị và giải pháp:
  • Ứng dụng chỉ thị phân tử SNP Contig260347:g.19G>A của gen MHC1 kết hợp công nghệ KASP như một công cụ hỗ trợ chọn lọc kiểu gen nhanh và chính xác ở giai đoạn sớm, giúp rút ngắn thời gian chọn giống.
  • Sử dụng các tổ hợp lai giữa nguồn tôm nhập ngoại có tốc độ tăng trưởng nhanh với nguồn tôm nội địa thích nghi tốt để chọn tạo đàn tôm sú bố mẹ chất lượng cao, phục vụ sản xuất giống thương phẩm tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Nghiên cứu kiểm chứng kỹ thuật KASP mới được thực hiện trên cỡ mẫu thử nghiệm gồm 40 cá thể tôm sú cái thuộc thế hệ G1 tăng trưởng nhanh; chưa mở rộng đánh giá kiểm chứng KASP trên diện rộng đối với toàn bộ các cá thể đực và nhóm tăng trưởng chậm.
    • Phạm vi sàng lọc tính trạng của luận án tập trung chủ yếu vào tính trạng tăng trưởng khối lượng, chưa tích hợp đồng thời các chỉ thị liên kết với tính trạng kháng các bệnh virus nguy hiểm (WSSV, YHV, IHHNV, LSNV) hoặc tính chống chịu môi trường khắc nghiệt.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Tiếp tục theo dõi, đánh giá sự di truyền và ổn định của các chỉ thị SNP phát hiện được qua các thế hệ chọn giống tiếp theo (G2, G3 và các thế hệ sau).
    • Mở rộng ứng dụng công nghệ GBS và KASP để sàng lọc thêm các chỉ thị phân tử liên quan đến tính kháng bệnh và các tính trạng chất lượng thịt, hoàn thiện quy trình chọn giống tổng thể cho tôm sú Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học, Nuôi trồng thủy sản và Sinh học phân tử. Phần tổng quan tài liệu (Chương 1) cung cấp hệ thống thông tin chi tiết về các thế hệ chỉ thị phân tử từ RAPD, RFLP, Microsatellite đến SNP, GBS và KASP.
  • Các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên tại các viện nghiên cứu thủy sản (Viện Nghiên cứu NTTS I, II, III), các trung tâm giống hải sản: Có thể tham khảo trực tiếp quy trình an toàn sinh học, kỹ thuật lai tổ hợp $4 \times 4$, quy trình đánh dấu cá thể (VIE), phương pháp tách chiết DNA Eurobiobank, quy trình phân tích AFLP trên máy ABI PRISM 3100 và quy trình thiết kế mồi KASP (Chương 2).
  • Các đơn vị sản xuất giống và nhà hoạch định chính sách ngành thủy sản: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng các chương trình gia hóa, chọn giống tôm sú bản địa dựa trên công nghệ chỉ thị phân tử thay thế dần việc phụ thuộc vào khai thác tôm bố mẹ tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

  1. Các mẫu tôm sú tự nhiên dùng để đánh giá đa hình AFLP được thu thập từ những vùng biển nào và phải tuân theo những nguyên tắc kỹ thuật gì? Các mẫu tôm sú tự nhiên phục vụ phân tích AFLP được thu thập từ 3 vùng biển: Bắc Trung Bộ (tỉnh Nghệ An), Nam Trung Bộ (tỉnh Khánh Hòa) và Nam Bộ (tỉnh Bạc Liêu) với số lượng trên 50 mẫu/quần đàn. Nguyên tắc thu mẫu bắt buộc: Thu cách bờ tối thiểu 7 km (thường quanh các đảo) để tránh lẫn tôm nuôi thoát ra từ ao, và chỉ thu rải rác 3-5 mẫu/ngày nhằm đảm bảo tính đại diện, tránh thu các cá thể cùng đàn hoặc cùng bố mẹ làm sai lệch kết quả đánh giá.

  2. Bốn dòng tôm bố mẹ sử dụng để thiết lập các gia đình lai thế hệ Go và G1 có nguồn gốc và số lượng như thế nào? Vật liệu gốc gồm 836 cá thể (>100g/con) thuộc 4 dòng: Dòng Ấn Độ Dương (A, nhập từ Thái Lan và Myanmar: 76 cái, 71 đực, tổng 147 con); Dòng Thái Bình Dương (T, nhập từ Singapore: 86 cái, 58 đực, tổng 144 con); Dòng Nội địa (N, thu thập từ Cà Mau, Đà Nẵng, Phú Yên: 236 cái, 186 đực, tổng 422 con); Dòng Gia hóa (G, từ Công ty Moana Ninh Thuận: 62 cái, 61 đực, tổng 123 con). Tổng số gồm 460 tôm cái và 376 tôm đực.

  3. Hai chỉ thị SNP nằm trong vùng exon của gen nào và gây ra các biến đổi nucleotide, acid amin cụ thể ra sao? Hai chỉ thị SNP được phát hiện nằm trong vùng exon của gen mã hóa chuỗi nặng Myosin (MHC):

  • Contig83953:g.20T>C trên gen MHCa: Biến đổi codon AAA thành AAG, là đột biến đồng nghĩa không làm thay đổi acid amin Lysine.
  • Contig260347:g.19G>A trên gen MHC1: Biến đổi codon GGA thành GAA, là đột biến sai nghĩa làm thay đổi acid amin từ Glycine thành Acid Glutamic.
  1. Kết quả kiểm tra kiểu gen bằng kỹ thuật KASP trên 40 cá thể tôm sú cái G1 tăng trưởng nhanh ghi nhận những tỷ lệ kiểu gen nào? Phân tích KASP trên 40 mẫu tôm sú cái thế hệ G1 tăng trưởng nhanh ghi nhận: 28 mẫu có kiểu gen đồng hợp tử đột biến A:A, 2 mẫu có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại G:G, và 10 mẫu có kiểu gen dị hợp tử G:A. Kết quả khẳng định alen đột biến A xuất hiện với tần số rất cao (ở 38/40 cá thể) trong nhóm tôm tăng trưởng nhanh.

  2. Những loại mầm bệnh virus nguy hiểm nào bắt buộc phải tầm soát và loại bỏ trong quy trình an toàn sinh học nuôi giữ tôm bố mẹ? Quy trình cách ly an toàn sinh học tầm soát nghiêm ngặt 4 loại mầm bệnh virus nguy hiểm trên tôm sú gồm: Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), Virus gây bệnh đầu vàng (YHV), Virus gây hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV), và Virus gây hội chứng còi (LSNV). Chỉ những cá thể âm tính hoàn toàn với cả 4 loại virus mới được đưa vào nuôi vỗ và thực hiện lai ghép.

Kết luận

Luận án đã thực hiện đánh giá đa dạng di truyền của các quần đàn tôm sú tự nhiên tại Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP và xây dựng thành công đàn tôm lai 4 dòng địa lý qua hai thế hệ Go và G1. Bằng việc ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới GBS, nghiên cứu đã phát hiện hai chỉ thị SNP nằm trên vùng exon của gen mã hóa chuỗi nặng Myosin (MHCa và MHC1), trong đó chỉ thị Contig260347:g.19G>A gây đột biến sai nghĩa từ Glycine thành Acid Glutamic. Kết quả thẩm định kiểu gen bằng kỹ thuật KASP trên 40 cá thể tôm cái G1 tăng trưởng nhanh xác nhận sự ưu thế của alen A (với 28 cá thể đồng hợp tử A:A và 10 cá thể dị hợp tử G:A). Những dẫn liệu khoa học này cung cấp cơ sở và công cụ phân tử hữu ích phục vụ công tác chọn giống và gia hóa tôm sú tăng trưởng nhanh tại Việt Nam.