ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, xúc tác sinh học là một trong những công cụ hứa hẹn nhất để tổng hợp bền vững các hợp chất có hoạt tính sinh học cho ngành dược phẩm và các ngành công nghiệp khác. Điều này được minh chứng bởi thực tế việc phát triển và sử dụng các sản phẩm của quá trình xúc tác sinh học, đem lại doanh số vô cùng ấn tượng cho nền kinh tế thế giới. Chẳng hạn, năm 2020 là 10,6 tỷ USD, dự kiến năm 2027 đạt 14,9 tỷ USD [1]. Một trong những chất xúc tác sinh học được nghiên cứu và có nhiều ứng dụng góp phần quan trọng vào sự phát triển mạnh mẽ của ngành dược phẩm nói riêng và các ngành công nghiệp nói chung, đó là Cytochrom P450 (CYP) [2].
Các CYP được phân bố rộng khắp trong tự nhiên và xúc tác cho đa dạng các loại phản ứng với các loại cơ chất khác nhau, đặc biệt là khả năng oxy hóa chọn lọc ở các vị trí allyl, liên kết đôi hoặc thậm chí cả ở liên kết C-H không được hoạt hóa vốn rất khó thực hiện bởi xúc tác hóa học. Vì vậy, CYP có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất tự nhiên thành các sản phẩm có giá trị. Khả năng này đặc biệt hấp dẫn đối với lĩnh vực phát triển và khai thác các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học [3]. Một trong những loài có khả năng tạo ra lượng lớn các CYP, đó chính là Streptomyces [4].
Streptomyces là một xạ khuẩn được biết đến rộng rãi như một vi sinh vật công nghiệp quan trọng, có tiềm năng trong việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm kháng sinh, thuốc chống ung thư, thuốc ức chế miễn dịch và enzym. Các CYP của Streptomyces có khả năng xúc tác đa dạng các loại phản ứng như phản ứng este hóa, oxy hóa, hydroxyl hóa, thủy phân, khử hydro và halogen hóa trên các cơ chất khác nhau với tính linh hoạt cao. Đến nay, có hơn 8500 trình tự gen mã hóa cho CYP được tìm thấy trong bộ gen của Streptomyces. Tuy nhiên mới chỉ có khoảng 2,4% trong số đó được xác định chức năng và dưới 0,4% được xác định cấu trúc [5].
cavourensis YBQ59 được phân lập từ rễ cây Quế Cinnamomum cassia J. Presl ở Yên Bái - Việt Nam, bởi nhóm nghiên cứu thuộc phòng Công 1 nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học, là vi khuẩn nội sinh thực vật (endophytic bacteria). Từ môi trường lên men của chủng S. cavourensis YBQ59, 8 hợp chất có hoạt tính kháng sinh và kháng ung thư đã được phân lập, bao gồm: 1- monolinolein, bafilomycin D, nonactic acid, daidzein, 3′-hydroxydaidzein, 5,11- epoxy-10-cadinanol, prelactone B, và daucosterol [6].
Các chất này có hoạt tính kháng sinh mạnh đối với các chủng Staphylococcus đa kháng thuốc và hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào ung thư phổi ở người. Bộ gen của chủng S. cavourensis YBQ59 đã được giải trình tự, cho thấy chủng này có 21 gen mã hóa cho các CYP [7]. Do những enzym này thường đóng vai trò quan trọng trong phản ứng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, nên việc khai thác các CYP hứa hẹn sẽ phát hiện những enzym mới có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y dược.
Tại Việt Nam, chúng tôi là một trong những nhóm đầu tiên nghiên cứu về CYP từ chủng vi khuẩn S. Bước đầu chúng tôi đã tiến hành biểu hiện, tinh sạch và xác định được một vài tính chất của một số CYP từ vi khuẩn S. cavourensis YBQ59 tái tổ hợp trong E.coli, trong đó có CYP154A mới nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch [8]. Vì vậy, để góp phần tìm hiểu về một ứng cử viên tiềm năng cho ngành công nghiệp dược phẩm xanh, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch và xác định tính chất của CYP154A từ Strepromyces cavourensis YBQ59” với những mục tiêu sau: 1.
Biểu hiện được enzym CYP154A từ S. Tinh sạch được enzym CYP154A từ S. Xác định tính chất của enzym CYP154A tái tổ hợp tinh sạch được. 2 PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.
Định nghĩa Xúc tác sinh học là một thuật ngữ dùng để mô tả việc sử dụng các chất xúc tác sinh học (ở dạng toàn bộ tế bào hoặc các enzym phân lập ở trạng thái tự nhiên hoặc enzym tái tổ hợp) nhằm làm tăng tốc độ phản ứng tổng hợp các hợp chất hữu cơ [9]. Xúc tác sinh học là một trong những trụ cột chính của công nghệ sinh học ứng dụng, được Liên đoàn Công nghệ sinh học châu Âu xác định vai trò là “sự tích hợp của khoa học tự nhiên và khoa học kỹ thuật nhằm đạt được ứng dụng của sinh vật, tế bào, các bộ phận của chúng và các chất tương tự phân tử cho các sản phẩm và dịch vụ” [10]. Tự nhiên đã tạo ra những chất xúc tác sinh học trong quá trình tiến hóa qua hàng triệu năm. Chúng chủ yếu là protein nhưng cũng có axit nucleic mang đặc tính xúc tác tương tự như đặc tính của enzym được phát hiện vào đầu những năm 80.
Tuy nhiên, cho đến nay, trong số các chất xúc tác tự nhiên này, chỉ có enzym được sử dụng trong xúc tác sinh học ứng dụng. Ưu điểm và nhược điểm Xúc tác sinh học ngày càng được ứng dụng rộng rãi và thay thế dần xúc tác hóa học trong các ngành công nghiệp bởi những ưu điểm mang tính đặc trưng của chúng. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất xúc tác sinh học trong công nghiệp cũng còn hạn chế do các chất xúc tác sinh học cũng có những nhược điểm nhất định. Dưới đây là bảng tóm tắt ưu, nhược điểm của chất xúc tác sinh học mà cụ thể là enzym (Bảng 1.
Những ưu điểm và nhược điểm chính của các chất xúc tác sinh học Ưu điểm Nhược điểm ✓ Xúc tác rất hiệu quả đối với hầu ✓ Các chất xúc tác có bản chất là hết phản ứng hóa học và protein kém ổn định trong môi chuyển hóa đã biết. trường nước ✓ Tính chọn lọc cao ✓ Nhiều enzym phụ thuộc vào ✓ Điều kiện phản ứng dễ thiết cofactor lập, đơn giản, ít tốn kém ✓ Enzym có thể bị bất hoạt bởi ✓ Sản phẩm phụ tạo ra ít, thân nhiều yếu tố: Nhiệt độ cao, giá thiện với môi trường trị pH, nồng độ muối cao, bọt ✓ Có khả năng phân hủy sinh học khí, ion kim loại trong nước, … ✓ Có thể chuẩn bị trên quy mô lớn thông qua quá trình lên men (enzym vi sinh vật) ✓ Có thể tái sử dụng ✓ Có thể được thiết kế đáp ứng nhu cầu ✓ Tính an toàn cao, không độc hại nếu được tuân thủ đúng quy trình 1. Vai trò của xúc tác sinh học trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới Thuốc là thành quả của hàng loạt các công trình nghiên cứu, thử nghiệm và đánh giá. Trước đây, thời gian trung bình để phát triển một loại thuốc mới từ giai đoạn phát hiện cho tới khi đưa vào điều trị cho người bệnh là 10 – 15 năm.
Chi phí trung bình cho việc nghiên cứu và phát triển thành công một thuốc vào khoảng 800 triệu đô la cho tới 1 tỷ đô la. Quá trình này gồm nhiều giai đoạn được tóm tắt trong Hình 1. Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới Với thế mạnh như đã nói ở trên (mục 1.2), việc sử dụng xúc tác sinh học trong những thập niên gần đây đã giúp quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới được rút ngắn và chi phí được giảm một cách rõ rệt [11]. Các cấu trúc tiềm năng được xác định ban đầu thường không được tối ưu hóa về hiệu quả điều trị kèm biểu hiện các tác dụng không mong muốn.
Do đó, cấu trúc này cần được sửa đổi bởi các chất xúc tác sinh học bằng cách thêm vào một số nhóm chức năng nhất định (oxy hóa, glycosyl hóa, halogen hóa, v.) hoặc chuyển đổi các nhóm chức năng hiện có (loại bỏ, oxy hóa hoặc cắt giảm, thay thế) [12]. Xúc tác sinh học giúp quá trình nghiên cứu chủ động sửa đổi cấu trúc, nhanh chóng hoàn thiện cấu trúc hoạt chất tiềm năng giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng không mong muốn. Khoảng 15 năm trước, ngành công nghiệp dược phẩm phần lớn đã chuyển từ xúc tác sinh học toàn bộ tế bào sang tập trung vào các quy trình dựa trên enzym được phân lập. Các chất xúc tác sinh học là enzym được phân lập bảo quản trong tủ lạnh phòng thí nghiệm, luôn sẵn sàng tham gia vào một vài giai đoạn của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc [13].
Một trong những ví dụ thành công và được công bố rộng rãi nhất về quá trình nghiên cứu, phát triển thuốc mới ứng dụng xúc tác sinh học là quá trình tổng hợp sitagliptin - dược chất của sản phẩm thương mại Januvia được sử dụng trong điều trị đái tháo đường type II. Quá trình phát triển này đã ứng dụng xúc tác sinh học 5 thông qua tác dụng xúc tác của enzym transaminase. Thông thường, sitagliptin được điều chế bằng cách sử dụng rhodium, một kim loại nặng làm chất xúc tác. Tuy nhiên, so với phương pháp sử dụng xúc tác hóa học, phương pháp ứng dụng xúc tác sinh học cho thấy giảm đáng kể chất thải, tiết kiệm chi phí cũng như loại bỏ việc sử dụng kim loại nặng.
Bên cạnh đó, sản lượng và năng suất tổng thể đã tăng lên 10 và 53%, giảm tổng lượng chất thải được tạo ra 19% [10]. Ngoài ra, việc sử dụng chất xúc tác sinh học giúp rút ngắn thời gian nghiên cứu và tạo ra hoạt chất sitagliptin xuống còn một năm [13] so với phương pháp tổng hợp hóa học trước đây. Trong số các enzym là chất xúc tác sinh học, CYP là chất xúc tác sinh học được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu phát triển thuốc mới, do enzym này có tính linh hoạt xúc tác với đa dạng cơ chất [11]. Định nghĩa và danh pháp Cytochrom P450 (CYP) có bản chất là hemoprotein, là một siêu họ enzym monoxygenase xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các hợp chất ngoại sinh, nội sinh và tổng hợp các hợp chất [2], [14].
Tên gọi “cytochrom P450” có nguồn gốc do một số đặc điểm của chúng: Liên kết với màng tế bào (cyto), chứa nhân hem (chrom và P), đặc biệt là khi liên kết với carbon monoxide (CO), các protein này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng xấp xỉ 450 nm [2].