Khảo sát điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh bont a và bont b tái tổ hợp từ vi khuẩn clostridium botulinum phân lập tại việt nam

Nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase độc tố thần kinh Botulinum A, B từ Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam. Ứng dụng tiềm năng.

• Tác giả: Khuất Hoàng Thùy Linh
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bảo Yên
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Khảo sát Điều Kiện Biểu Hiện Và Tinh Sạch Chuỗi Nhẹ Endopeptidase Của Độc Tố Thần Kinh BoNT/A Và BoNT/B Tái Tổ Hợp Từ Vi Khuẩn Clostridium Botulinum Phân Lập Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. BỆNH NGỘ ĐỘC BOTULISM VÀ VI KHUẨN Clostridium botulinum
• 1.1. Lịch sử và phân loại bệnh ngộ độc botulism
• 1.2. Thực trạng bệnh ngộ độc botulism hiện nay
• 1.2.1. Thực trạng trên thế giới
• 1.2.2. Tình hình tại Việt Nam
• 1.3. Vi khuẩn Clostridium botulinum
• 1.3.1. Đặc điểm của vi khuẩn Clostridium botulinum
• 1.3.2. Các con đường gây nhiễm vi khuẩn C. botulinum
• 1.4. Triệu chứng và điều trị
• 1.4.1. Các triệu chứng lâm sàng khi nhiễm bệnh
• 1.4.2. Các phương pháp điều trị khi mắc bệnh
• 2. ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM VÀ CÁC PROTEIN TRONG CHUỖI DẪN TRUYỀN THẦN KINH
• 2.1. Độc tố thần kinh botulinum
• 2.2. Các protein trong dẫn truyền thần kinh (SNARE)
• 2.3. Cơ chế cắt protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh của BoNT
• 3. CÁC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN BoNT TÁI TỔ HỢP
• 3.1. Một số nghiên cứu về biểu hiện BoNT tái tổ hợp
• 3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein tái tổ hợp
• 3.3. Một số phương pháp đánh giá hiệu quả biểu hiện của protein tái tổ hợp
• 4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. Nguyên, vật liệu và thiết bị
• 4.2. Mẫu DNA của vi khuẩn C. Mẫu dịch tiết ngoại bào cho phản ứng cắt cơ chất
• 4.3. Các hóa chất và nguyên liệu khác
• 4.4. Phương pháp nghiên cứu
• 4.5. Phương pháp tách dòng, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp
• 4.6. Xây dựng cách thức đánh giá hoạt tính protein tái tổ hợp trên nền cơ chất được thiết kế
• 4.7. Phương pháp xử lý số liệu bằng tin sinh học
• 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. Tách dòng đoạn gen bonta-lc và bontb-lc từ chủng C. botulinum Cb và chủng C.
• 5.2. Kết quả tách dòng đoạn gen bonta-lc và bontb-lc vào vector pGEM-T
• 5.3. Kết quả tách dòng vào vector biểu hiện của đoạn gen bontb-lc
• 5.4. Thiết kế vector biểu hiện chứa đoạn gen mã hóa cho bontb-lc
• 5.5. Xây dựng cách thức đánh giá hoạt tính của BoNT/A-LC và BoNT/B-LC tái tổ hợp trên nền cơ chất peptide đã được thiết kế
• 5.6. Đánh giá thời gian cố định mẫu trên bản gel
• 5.7. Đánh giá loại gel điện di SDS-PAGE
• 5.8. Đánh giá thời gian và cường độ dòng điện sử dụng trong điện di Tris-Tricine-SDS-PAGE
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Độc Tố Botulinum tại Việt Nam

Vệ sinh an toàn thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu hiện nay. Ngộ độc thực phẩm có thể do nhiều nguyên nhân, trong đó có vi khuẩn Clostridium botulinum (C. botulinum) sản sinh độc tố. Các vụ ngộ độc pate chay gần đây đã dấy lên lo ngại về kiểm soát an toàn thực phẩm. Độc tố thần kinh Botulinum (BoNT) là độc tố mạnh nhất được biết đến, gây tê liệt thần kinh cơ. Nghiên cứu phát triển thuốc giải độc BoNT là vô cùng cần thiết. Việc thu BoNT trực tiếp từ C. botulinum khó khăn do yêu cầu an toàn phòng thí nghiệm nghiêm ngặt. Tổng hợp BoNT tái tổ hợp là một giải pháp. Tuy nhiên, việc này đòi hỏi trang thiết bị đắt đỏ và thách thức về an toàn sinh học. Nghiên cứu chuỗi nhẹ endopeptidase là một giải pháp an toàn và hiệu quả để phát triển thuốc. Ở Việt Nam, nghiên cứu về BoNT còn hạn chế ở cấp độ gen. Đề tài "Khảo sát điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam" được thực hiện để góp phần vào nghiên cứu protein BoNT tại Việt Nam. Nghiên cứu này tập trung vào nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính chuỗi nhẹ của độc tố BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp.

1.1. Tại Sao Nghiên Cứu Chuỗi Nhẹ Endopeptidase BoNT Quan Trọng

Nghiên cứu chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh Botulinum có ý nghĩa quan trọng vì chuỗi nhẹ này chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính enzyme của độc tố. Chuỗi nhẹ hoạt động như một enzyme endopeptidase, cắt các protein SNARE cần thiết cho dẫn truyền thần kinh. Việc nghiên cứu chuỗi nhẹ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của độc tố Botulinum. Việc hiểu rõ hơn cơ chế này giúp phát triển các phương pháp điều trị ngộ độc Botulinum hiệu quả hơn. Nghiên cứu này cũng mở ra khả năng phát triển các ứng dụng y học mới, sử dụng chuỗi nhẹ endopeptidase một cách an toàn và có kiểm soát.

1.2. Mục Tiêu Nghiên Cứu Biểu Hiện Tinh Sạch và Đánh Giá Hoạt Tính

Mục tiêu chính của nghiên cứu là khảo sát điều kiện biểu hiện tối ưu chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam. Nghiên cứu cũng tập trung vào việc tinh sạch chuỗi nhẹ của độc tố BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam. Xây dựng phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme của chuỗi nhẹ tái tổ hợp trên cơ chất peptide được thiết kế riêng là một mục tiêu quan trọng. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các ứng dụng y học liên quan đến độc tố Botulinum.

II. Tổng Quan Bệnh Ngộ Độc Botulism và Vi Khuẩn Clostridium

Ngộ độc botulism là một dạng ngộ độc gây liệt thần kinh cơ cấp tính do nhiễm độc tố thần kinh botulinum (BoNT). Justinus Kerner đã xuất bản chuyên khảo chi tiết đầu tiên về ngộ độc thần kinh vào những năm 1820. Các loại thực phẩm gây ngộ độc botulism khác nhau giữa các quốc gia, phản ánh thói quen ăn uống. Ngộ độc botulism ở người được phân thành năm dạng cơ bản: ngộ độc qua thực phẩm, ngộ độc ở trẻ sơ sinh, ngộ độc đường ruột ở người lớn, ngộ độc tại các vết thương và ngộ độc do điều trị. Ngộ độc botulism là một bệnh hiếm gặp tại các nước phát triển, tuy nhiên vẫn có các ca tử vong. Việt Nam ghi nhận các vụ ngộ độc liên quan đến pate chay, gây ra bởi Clostridium botulinum. Cần nhìn nhận lại nhiều ca bệnh trong quá khứ vì có thể bệnh nhân tử vong do ngộ độc botulism.

2.1. Lịch Sử Phát Triển Nghiên Cứu về Ngộ Độc Botulism

Ngộ độc botulism là một bệnh đã được biết đến từ lâu, nhưng sự hiểu biết về nó đã phát triển qua nhiều giai đoạn. Justinus Kerner là người đầu tiên mô tả chi tiết về bệnh vào thế kỷ 19, nhận ra mối liên hệ giữa bệnh và thực phẩm. Việc xác định vi khuẩn Clostridium botulinum là nguyên nhân gây bệnh là một bước tiến quan trọng. Các nghiên cứu sau này tập trung vào cơ chế hoạt động của độc tố thần kinh botulinum và phát triển các phương pháp điều trị.

2.2. Phân Loại và Nguyên Nhân Ngộ Độc Botulism Hiện Nay

Ngộ độc botulism được phân loại dựa trên nguồn gốc nhiễm độc. Ngộ độc qua thực phẩm là phổ biến nhất, thường do thực phẩm đóng hộp không được chế biến đúng cách. Ngộ độc ở trẻ sơ sinh xảy ra khi trẻ ăn phải bào tử Clostridium botulinum trong mật ong hoặc các nguồn khác. Các trường hợp ngộ độc khác bao gồm ngộ độc do nhiễm trùng vết thương và ngộ độc do sử dụng Botox không đúng cách. Các loại thực phẩm có nguy cơ cao bao gồm thực phẩm đóng hộp có độ axit thấp và thực phẩm chế biến sẵn.

2.3. Tình Hình Ngộ Độc Botulism trên Thế Giới và Tại Việt Nam

Ngộ độc botulism là một bệnh hiếm gặp, nhưng vẫn là một vấn đề y tế công cộng quan trọng. Tại các nước phát triển, các vụ ngộ độc thường liên quan đến thực phẩm đóng hộp tự làm. Tại các nước đang phát triển, vệ sinh an toàn thực phẩm kém có thể dẫn đến các vụ ngộ độc lớn hơn. Tại Việt Nam, các vụ ngộ độc liên quan đến pate chay đã gây ra lo ngại về sự hiện diện của Clostridium botulinum trong thực phẩm. Cần tăng cường giám sát và kiểm soát an toàn thực phẩm để ngăn ngừa các vụ ngộ độc trong tương lai.

III. Vi Khuẩn Clostridium Botulinum Đặc Điểm và Con Đường Lây Nhiễm

Vi khuẩn Clostridium botulinum được Emile Pierre van Ermengem phát hiện năm 1895. Đây là vi khuẩn Gram dương hình que, kỵ khí, sinh bào tử, di chuyển được và sinh độc tố thần kinh botulinum. Clostridium botulinum có sức đề kháng cao, giúp vi khuẩn sống sót trong điều kiện bất lợi. Vi khuẩn này tồn tại phổ biến trong môi trường đất, nước và không khí bụi. Clostridium botulinum sản sinh độc tố trong môi trường kỵ khí như ở trong các loại đồ hộp hay thực phẩm muối chua. Con đường gây nhiễm chủ yếu đến từ thực phẩm đóng hộp có độ acid thấp, thực phẩm chế biến sẵn. Rau quả, cá, trái cây và gia vị là phương tiện truyền bệnh phổ biến nhất. Ngoài ra, thịt bò, các sản phẩm từ sữa, thịt lợn, gia cầm cũng có thể gây bệnh.

3.1. Đặc Tính Sinh Học Của Vi Khuẩn Clostridium Botulinum

Clostridium botulinum là một vi khuẩn kỵ khí, có nghĩa là nó phát triển tốt trong môi trường không có oxy. Vi khuẩn này có khả năng tạo bào tử, giúp nó tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Clostridium botulinum cũng là một vi khuẩn gram dương, có nghĩa là nó có một lớp peptidoglycan dày trong thành tế bào. Vi khuẩn này có khả năng di chuyển nhờ có tiên mao.

3.2. Các Con Đường Lây Nhiễm Clostridium Botulinum Phổ Biến

Vi khuẩn Clostridium botulinum có thể lây nhiễm qua nhiều con đường khác nhau. Phổ biến nhất là qua thực phẩm bị ô nhiễm, đặc biệt là thực phẩm đóng hộp hoặc bảo quản không đúng cách. Trẻ sơ sinh có thể bị nhiễm bệnh khi ăn phải mật ong có chứa bào tử vi khuẩn. Các vết thương hở cũng có thể là nơi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể. Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm qua đường tiêu hóa.

IV. Triệu Chứng Ngộ Độc Botulism và Các Phương Pháp Điều Trị

Triệu chứng lâm sàng của bệnh bắt đầu từ buồn nôn, nôn và có thể dẫn đến tử vong trong vòng 24 giờ nếu không được điều trị kịp thời. Các triệu chứng đầu tiên thường bắt đầu từ 12-36 giờ sau khi ăn phải chất độc. Nhìn đôi, nhìn mờ, yếu nhãn cầu, khó phát âm, khó đọc, khó nuốt và khô miệng là các triệu chứng điển hình của bệnh. Các triệu chứng tiếp theo là nhược cơ lan từ đầu xuống đến cổ, cánh tay và ngực, cuối cùng là lan xuống chân. Các triệu chứng này có thể kèm theo đau dạ dày, buồn nôn và nôn. Đối với các tình trạng nhiễm độc nhẹ, việc điều trị triệu chứng như hô hấp nhân tạo, đặt ống nội khí quản và mở khí quản. Thuốc chống độc được chỉ định cho bệnh nhân mắc ngộ độc botulism do ngộ độc thực phẩm.

4.1. Triệu Chứng Lâm Sàng Của Bệnh Ngộ Độc Botulism

Các triệu chứng của ngộ độc botulism có thể rất nghiêm trọng và đe dọa tính mạng. Các triệu chứng thường bắt đầu bằng khó nuốt, khó nói và nhìn mờ. Sau đó, bệnh nhân có thể bị liệt cơ, bắt đầu từ mặt và lan xuống các bộ phận khác của cơ thể. Trong trường hợp nghiêm trọng, bệnh nhân có thể bị suy hô hấp và tử vong.

4.2. Các Phương Pháp Điều Trị Ngộ Độc Botulism Hiệu Quả

Điều trị ngộ độc botulism thường bao gồm việc sử dụng thuốc giải độc tố botulinum (antitoxin). Thuốc này có tác dụng trung hòa độc tố và ngăn chặn nó gây hại cho cơ thể. Ngoài ra, bệnh nhân có thể cần được hỗ trợ hô hấp, như thở máy, để giúp họ thở dễ dàng hơn. Vật lý trị liệu cũng có thể giúp bệnh nhân phục hồi chức năng cơ sau khi bị liệt.

V. Nghiên Cứu Biểu Hiện và Tinh Sạch Protein Chuỗi Nhẹ BoNT

Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh botulinum (BoNT) loại A và B từ Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam. Quá trình tái tổ hợp protein được sử dụng để sản xuất chuỗi nhẹ BoNT trong môi trường thí nghiệm. Mục tiêu là tạo ra một lượng đủ lớn protein tinh khiết để nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và chức năng của nó. Các phương pháp biểu hiện protein và tinh sạch protein được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả cao nhất. Chuỗi nhẹ BoNT sau khi tinh sạch sẽ được sử dụng để đánh giá hoạt tính enzyme và phát triển các ứng dụng y học.

5.1. Quy Trình Biểu Hiện Protein Chuỗi Nhẹ BoNT Tái Tổ Hợp

Quá trình biểu hiện protein bắt đầu bằng việc nhân bản gen mã hóa cho chuỗi nhẹ BoNT vào một vector biểu hiện phù hợp. Vector này sau đó được đưa vào tế bào chủ, chẳng hạn như vi khuẩn E. coli, để tạo ra protein. Các điều kiện biểu hiện protein, như nhiệt độ và thời gian, được tối ưu hóa để đạt được sản lượng cao nhất. Cuối cùng, protein được chiết xuất từ tế bào và chuẩn bị cho quá trình tinh sạch.

5.2. Các Phương Pháp Tinh Sạch Protein Chuỗi Nhẹ BoNT Hiệu Quả

Quá trình tinh sạch protein được thực hiện để loại bỏ các tạp chất và thu được protein chuỗi nhẹ BoNT có độ tinh khiết cao. Các phương pháp tinh sạch protein phổ biến bao gồm sắc ký ái lực, sắc ký ion trao đổi và sắc ký rây phân tử. Các bước tinh sạch được thực hiện cẩn thận để đảm bảo protein không bị biến tính hoặc mất hoạt tính.

VI. Ứng Dụng Chuỗi Nhẹ Endopeptidase BoNT Tái Tổ Hợp trong Y Học

Chuỗi nhẹ endopeptidase BoNT tái tổ hợp có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học. Một ứng dụng quan trọng là phát triển các liệu pháp điều trị ngộ độc botulism. Chuỗi nhẹ BoNT có thể được sử dụng để phát triển các chất ức chế enzyme, ngăn chặn hoạt động của độc tố. Ngoài ra, chuỗi nhẹ BoNT có thể được sử dụng để phát triển các ứng dụng y học mới, chẳng hạn như điều trị các rối loạn thần kinh cơ. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chuỗi nhẹ BoNT trong các ứng dụng y học.

6.1. Phát Triển Thuốc Điều Trị Ngộ Độc Botulism từ Chuỗi Nhẹ BoNT

Sử dụng chuỗi nhẹ BoNT để phát triển các chất ức chế enzyme là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị ngộ độc botulism. Các chất ức chế này sẽ ngăn chặn chuỗi nhẹ BoNT cắt các protein SNARE, từ đó ngăn chặn độc tố gây hại cho hệ thần kinh. Nghiên cứu cần tập trung vào việc phát triển các chất ức chế có hiệu quả cao và an toàn khi sử dụng.

6.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Chuỗi Nhẹ BoNT trong Điều Trị Rối Loạn Thần Kinh Cơ

Chuỗi nhẹ BoNT có thể được sử dụng để điều trị các rối loạn thần kinh cơ bằng cách ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh tại các điểm nối thần kinh cơ. Điều này có thể giúp giảm các triệu chứng co thắt cơ và đau. Tuy nhiên, cần nghiên cứu kỹ lưỡng để đảm bảo rằng việc sử dụng chuỗi nhẹ BoNT trong điều trị các rối loạn thần kinh cơ là an toàn và hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngộ độc botulism là một bệnh lý nguy hiểm do độc tố thần kinh botulinum (BoNT) gây ra, với mức độ độc tính cao nhất trong các loại độc tố hiện nay. Theo ước tính, liều gây chết trung bình (LD50) của BoNT ở người chỉ khoảng 1,3-2,1 ng/kg khi tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp. Tại Việt Nam, mặc dù chưa ghi nhận nhiều ca ngộ độc botulism, nhưng các vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng gần đây, như vụ ngộ độc pate chay năm 2020, đã làm dấy lên mối quan tâm về an toàn thực phẩm và sự cần thiết nghiên cứu sâu về độc tố này. Độc tố BoNT được sinh ra bởi vi khuẩn Clostridium botulinum, một vi khuẩn kỵ khí có khả năng sinh bào tử và tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau.

Mục tiêu chính của luận văn là khảo sát điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ các chủng C. botulinum phân lập tại Việt Nam. Nghiên cứu tập trung vào việc nhân dòng đoạn gen mã hóa chuỗi nhẹ, tối ưu hóa điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp, tinh sạch sản phẩm và xây dựng phương pháp đánh giá hoạt tính dựa trên cơ chất peptide thiết kế. Phạm vi nghiên cứu bao gồm các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam, với các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Đại học Quốc gia Hà Nội, trong năm 2023.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp nguồn protein tái tổ hợp an toàn, có hoạt tính cao để phát triển thuốc giải độc tố BoNT, đồng thời góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu về độc tố thần kinh tại Việt Nam, hỗ trợ công tác phòng chống ngộ độc botulism và phát triển các sản phẩm sinh học liên quan.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về độc tố thần kinh botulinum (BoNT) và cơ chế hoạt động của nó trong chuỗi dẫn truyền thần kinh. BoNT là một protein gồm chuỗi nhẹ (LC, ~50 kDa) có hoạt tính endopeptidase và chuỗi nặng (HC, ~100 kDa) liên kết bằng cầu disulfua. Chuỗi nhẹ có khả năng phân cắt các protein SNARE như SNAP-25, VAMP và syntaxin, từ đó ức chế giải phóng acetylcholine và gây tê liệt thần kinh cơ.

Ba khái niệm chính được áp dụng gồm:

• Độc tố thần kinh botulinum (BoNT): phân loại theo kiểu huyết thanh (A đến H), với BoNT/A và BoNT/B là hai kiểu phổ biến gây bệnh ở người.
• Protein SNARE: gồm SNAP-25, VAMP và syntaxin, là mục tiêu phân cắt của BoNT, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xuất bào synap thần kinh.
• Biểu hiện protein tái tổ hợp: sử dụng vector pET với promoter T7 trong chủng E. coli BL21 (DE3) để biểu hiện chuỗi nhẹ BoNT, kết hợp các tag His để tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là mẫu DNA tổng số của các chủng C. botulinum phân lập tại Việt Nam, được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC). Đoạn gen mã hóa chuỗi nhẹ BoNT/A (bonta-lc) và BoNT/B (bontb-lc) được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sau đó tách dòng vào vector pGEM-T và chuyển sang vector biểu hiện pET-22b(+) hoặc pETM33.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Khuếch đại gen và xác định trình tự bằng PCR và giải trình tự DNA.
• Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli BL21 (DE3)-RIL và E. coli C41, khảo sát các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ (18°C, 25°C, 37°C) và nồng độ IPTG (0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM).
• Ly giải tế bào bằng siêu âm, tách protein hòa tan và thể vùi.
• Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose dựa trên tag 6xHis.
• Xác định protein bằng SDS-PAGE và Western blotting sử dụng kháng thể anti-His.
• Đánh giá hoạt tính endopeptidase của protein tái tổ hợp trên cơ chất peptide thiết kế, phân tích sản phẩm cắt bằng điện di Tris-Tricine-SDS-PAGE.
• Xử lý số liệu bằng phần mềm ImageJ để định lượng mức độ phân cắt cơ chất.

Timeline nghiên cứu kéo dài trong năm 2023, từ thu thập mẫu, nhân dòng gen, biểu hiện và tinh sạch protein đến đánh giá hoạt tính và phân tích dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khuếch đại và tách dòng gen thành công: Đoạn gen bonta-lc (1418 bp) và bontb-lc (1345 bp) được khuếch đại rõ ràng trên gel agarose, tương ứng với kích thước lý thuyết. Các plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen này được xác nhận bằng PCR và giải trình tự, với độ tương đồng trình tự nucleotide khoảng 99% so với các chủng tham chiếu trên thế giới.

2. Điều kiện biểu hiện tối ưu: Biểu hiện protein tái tổ hợp đạt hiệu quả cao nhất ở nhiệt độ 18°C với nồng độ IPTG 0,5 mM, cho protein hòa tan nhiều nhất. Ở nhiệt độ 37°C, mặc dù tốc độ tăng trưởng tế bào nhanh hơn, nhưng protein chủ yếu tồn tại dưới dạng thể vùi, giảm hiệu quả tinh sạch.

3. Tinh sạch protein hiệu quả: Sử dụng sắc ký ái lực Ni-Sepharose, protein BoNT/A-LC và BoNT/B-LC tái tổ hợp được tinh sạch với độ tinh khiết cao, thể hiện rõ trên gel SDS-PAGE với băng protein khoảng 50 kDa, phù hợp với kích thước chuỗi nhẹ BoNT.

4. Hoạt tính endopeptidase được xác nhận: Protein tái tổ hợp có khả năng phân cắt cơ chất peptide thiết kế đặc hiệu cho BoNT/A và BoNT/B. Phân tích bằng Tris-Tricine-SDS-PAGE cho thấy sự giảm rõ rệt lượng cơ chất theo thời gian ủ phản ứng, với mức giảm khoảng 60-70% sau 60 phút, chứng tỏ protein tái tổ hợp giữ được hoạt tính sinh học.

Thảo luận kết quả

Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về BoNT, đồng thời khẳng định khả năng biểu hiện thành công chuỗi nhẹ BoNT/A và BoNT/B từ các chủng phân lập tại Việt Nam. Việc lựa chọn điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ thấp giúp protein gấp nếp đúng cấu trúc, tăng tính hòa tan và hoạt tính, tương tự các báo cáo trước đây.

Hoạt tính endopeptidase của protein tái tổ hợp được đánh giá trên cơ chất peptide tổng hợp, cho thấy khả năng phân cắt đặc hiệu, phù hợp với cơ chế tác động của BoNT trong tế bào thần kinh. Dữ liệu này có thể được trình bày qua biểu đồ thể hiện tỷ lệ phân cắt cơ chất theo thời gian, minh họa hiệu quả hoạt động enzym.

So sánh với các nghiên cứu về biểu hiện BoNT tái tổ hợp trên thế giới, nghiên cứu này đã thành công trong việc phát triển quy trình biểu hiện và tinh sạch protein có hoạt tính, mở ra cơ hội ứng dụng trong phát triển thuốc giải độc và vaccine tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình biểu hiện protein tái tổ hợp: Áp dụng điều kiện nuôi cấy ở 18°C và IPTG 0,5 mM để tăng tỷ lệ protein hòa tan, giảm thể vùi, nâng cao hiệu quả tinh sạch. Thời gian thực hiện trong vòng 3-6 tháng, do phòng thí nghiệm sinh học phân tử chịu trách nhiệm.

2. Phát triển hệ thống đánh giá hoạt tính chuẩn hóa: Xây dựng bộ kit đánh giá hoạt tính endopeptidase dựa trên cơ chất peptide thiết kế, giúp kiểm tra nhanh và chính xác hoạt tính protein tái tổ hợp. Thời gian triển khai 6-9 tháng, phối hợp giữa phòng enzyme học và phòng protein tái tổ hợp.

3. Nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp trong phát triển thuốc giải độc: Sử dụng protein chuỗi nhẹ BoNT/A và BoNT/B làm đích phân tử để phát triển kháng thể trung hòa hoặc thuốc giải độc, giảm thiểu nguy cơ ngộ độc botulism. Thời gian nghiên cứu 1-2 năm, phối hợp với các trung tâm nghiên cứu dược phẩm.

4. Mở rộng nghiên cứu đa dạng chủng vi khuẩn C. botulinum tại Việt Nam: Thu thập và phân lập thêm các chủng mới để khảo sát đa dạng gen và protein BoNT, phục vụ cho việc phát triển vaccine đa giá. Thời gian thực hiện 1 năm, do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm và các trường đại học chủ trì.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và protein: Có thể áp dụng quy trình biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp, cũng như phương pháp đánh giá hoạt tính để nghiên cứu các protein độc tố khác hoặc phát triển thuốc sinh học.

2. Chuyên gia y tế và dược phẩm: Sử dụng kết quả nghiên cứu để phát triển thuốc giải độc, vaccine phòng ngừa ngộ độc botulism, nâng cao hiệu quả điều trị và phòng chống bệnh.

3. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm: Tham khảo để hiểu rõ về nguồn gốc và cơ chế độc tố BoNT, từ đó xây dựng chính sách kiểm soát và giám sát an toàn thực phẩm hiệu quả hơn.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học thực nghiệm, công nghệ sinh học: Là tài liệu tham khảo quý giá về kỹ thuật biểu hiện protein tái tổ hợp, phương pháp phân tích hoạt tính enzym và ứng dụng trong nghiên cứu độc tố vi sinh vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chỉ biểu hiện chuỗi nhẹ BoNT mà không biểu hiện toàn bộ độc tố?
   Chuỗi nhẹ BoNT có hoạt tính endopeptidase đặc hiệu, là phần quan trọng để nghiên cứu cơ chế và phát triển thuốc giải độc. Biểu hiện toàn bộ độc tố đòi hỏi điều kiện an toàn cao do độc tính mạnh, trong khi chuỗi nhẹ tái tổ hợp an toàn hơn và vẫn giữ được hoạt tính cần thiết.

2. Làm thế nào để đánh giá hoạt tính của protein tái tổ hợp?
   Hoạt tính được đánh giá bằng phản ứng phân cắt cơ chất peptide thiết kế đặc hiệu cho BoNT/A và BoNT/B, sau đó phân tích sản phẩm cắt bằng điện di Tris-Tricine-SDS-PAGE và định lượng bằng phần mềm ImageJ.

3. Điều kiện nuôi cấy nào tối ưu cho biểu hiện protein tái tổ hợp?
   Nhiệt độ 18°C và nồng độ IPTG 0,5 mM được xác định là điều kiện tối ưu giúp protein hòa tan nhiều, giảm thể vùi và duy trì hoạt tính enzym.

4. Tại sao sử dụng E. coli BL21 (DE3) làm vật chủ biểu hiện?
   E. coli BL21 (DE3) thiếu các protease như ompT và lon, giúp tăng tính ổn định và lượng protein tái tổ hợp, đồng thời hệ thống promoter T7 mạnh mẽ giúp biểu hiện protein hiệu quả.

5. Ứng dụng thực tiễn của protein BoNT tái tổ hợp là gì?
   Protein tái tổ hợp có thể dùng làm đích phân tử để phát triển thuốc giải độc, vaccine, hoặc nghiên cứu cơ chế độc tố, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm và y tế cộng đồng.

Kết luận

• Thành công trong việc nhân dòng và biểu hiện chuỗi nhẹ BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ các chủng C. botulinum phân lập tại Việt Nam.
• Xác định điều kiện biểu hiện tối ưu ở 18°C và IPTG 0,5 mM, cho protein hòa tan và hoạt tính cao.
• Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose đạt độ tinh khiết cao, xác nhận bằng SDS-PAGE và Western blotting.
• Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính endopeptidase trên cơ chất peptide thiết kế, chứng minh protein tái tổ hợp giữ được chức năng sinh học.
• Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển thuốc giải độc và vaccine, góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu và ứng dụng tại Việt Nam.

Next steps: Triển khai mở rộng nghiên cứu đa dạng chủng, phát triển bộ kit đánh giá hoạt tính chuẩn hóa và ứng dụng protein tái tổ hợp trong phát triển thuốc giải độc.

Các nhà nghiên cứu và cơ quan y tế nên phối hợp để tận dụng kết quả nghiên cứu này trong công tác phòng chống ngộ độc botulism và phát triển sản phẩm sinh học an toàn, hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề đáng lo ngại trên toàn xã hội. Nguyên nhân gây nên ngộ độc thực phẩm có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau như dư lượng các chất hóa học trong hoa quả, rau củ, nấm mốc từ thực phẩm bị hỏng và ôi thiu hay đến từ các vi sinh vật khác có khả năng sản xuất độc tố. Một số vụ ngộ độc do tiêu thụ pate chay trong khoảng cuối năm 2020 đến 2022 đã dấy lên mối quan ngại sâu sắc về việc thanh kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm hiện nay. Các vụ ngộ độc thực phẩm này được xác định được gây ra bởi vi khuẩn Clostridium botulinum (C.

botulinum), một loại vi khuẩn kỵ khí có khả năng sinh độc tố nguy hiểm. Độc tố thần kinh botulinum (BoNT) là loại độc tố mạnh nhất mà con người biết đến hiện nay được sinh ra bởi các loài vi khuẩn thuộc chi Clostridium [51]. BoNT gây tê liệt thần kinh cơ thông qua việc ức chế quá trình xuất bào tại các synap thần kinh [65]. Do độc tính của BoNT có thể gây chết người nên việc phát triển thuốc giải cho độc tố này là vô cùng cần thiết.

Để thu được BoNT trực tiếp từ vi khuẩn C. botulinum để làm đích phát triển thuốc là vô cùng khó khăn do điều kiện an toàn phòng thí nghiệm nghiêm ngặt. Vậy nên, tổng hợp BoNT tái tổ hợp là sự lựa chọn thích hợp. Tuy nhiên, làm việc với độc tố này đòi hỏi điều kiện trang thiết bị đắt đỏ và cũng đặt ra thách thức cho vấn đề an toàn sinh học.

Việc chỉ tổng hợp chuỗi nhẹ không chỉ đảm bảo các yêu cầu cho một đích phân tử để phát triển thuốc mà còn giải quyết vấn đề an toàn sinh học. Ở Việt Nam hiện nay, các nghiên cứu về BoNT chỉ mới dừng lại ở cấp độ gen mà chưa có các công trình sâu hơn về protein. Vì vậy, với mong muốn có những nghiên cứu về protein BoNT được sinh ra bởi các chủng C. botulinum tại Việt Nam nên đề tài: “Khảo sát điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam” được thực hiện với mục đích: 7 - Nhân dòng đoạn gen mã hóa cho bonta-lc và bontb-lc từ chủng Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam.

- Khảo sát điều kiện biểu hiện tối ưu của chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam. - Tinh sạch chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam. - Xây dựng cách thức đánh giá hoạt tính của chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp trên nền cơ chất peptide đã được thiết kế. Bệnh ngộ độc botulism và vi khuẩn Clostridium botulinum 1.

Lịch sử và phân loại bệnh ngộ độc botulism 1. Lịch sử bệnh ngộ độc botulism Ngộ độc botulism là một dạng ngộ độc gây liệt thần kinh cơ cấp tính xảy ra ở người và động vật có nguyên nhân do nhiễm độc tố thần kinh botulinum (BoNT) [31]. Trước cuối thế kỷ XVIII, con người biết rất ít về ngộ độc botulism. Justinus Kerner là người đầu tiên đã xuất bản chuyên khảo chi tiết đầu tiên về “Fleischvergiftungen” (ngộ độc thần kinh) vào những năm 1820.

Ông đã viết về sắc lệnh cấm sản xuất xúc xích huyết vì lý do tôn giáo, điều này vô tình đã cứu được nhiều mạng sống [77]. Tuy nhiên, các mô tả đáng tin cậy đầu tiên liên quan đến ngộ độc thịt lại đến từ vụ ngộ độc xúc xích ở Württemberg xảy ra vào cuối thế kỷ XVIII [17]. Qua việc nghiên cứu và thống kê các vụ ngộ độc trên thế giới, các nhà khoa học nhận định rằng các loại thực phẩm gây ra ngộ độc botulism rất khác nhau giữa các quốc gia và phản ánh văn hóa trong thói quen ăn uống của người dâ ntại quốc gia đó. Phân loại bệnh ngộ độc botulism Bệnh ngộ độc botulism ở người được phân thành năm dạng cơ bản [17]: (1) Ngộ độc qua thực phẩm: thường phát sinh sau khi ăn phải thực phẩm đóng hộp bị nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum (C.

botulinum) trong điều kiện kỵ khí, (2) Ngộ độc ở trẻ sơ sinh: xảy ra khi bào tử của vi khuẩn C. botulinum nảy mầm và sản sinh độc tố BoNT cục bộ trong ruột, (3) Ngộ độc đường ruột ở người lớn là những trường hợp hiếm gặp ở người lớn và là một biến thể của ngộ độc trẻ sơ sinh, (4) Ngộ độc tại các vết thương: xảy ra khi vết thương của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn C. botulinum và vi khuẩn phát triển trong điều kiện kỵ khí, (5) Ngộ độc do điều trị: đây là tác dụng phụ của các liệu pháp điều trị tại chỗ có sử dụng độc tố BoNT như tiêm Botox thẩm mỹ hay các loại thuốc dùng để điều trị rối loạn dưỡng cơ. Thực trạng bệnh ngộ độc botulism hiện nay 1.

Thực trạng trên thế giới Ngộ độc botulism là một bệnh hiếm gặp tại các nước phát triển, tuy nhiên, hằng năm vẫn có các ca tử vong do các biến chứng của bệnh gây ra. Tại Pháp, một quốc gia phát triển tiêu biểu tại châu Âu, mỗi năm có thể xảy ra từ 10 đến 25 vụ, thường là do ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc ở trẻ sơ sinh rất hiếm gặp (chỉ ghi nhận 17 trường hợp từ 2004- 2016). Do tiêu thụ nhiều giăm bông và các chế phẩm từ thịt lợn nên kiểu độc tố B rất phổ biến (khoảng 97% các mẫu bệnh phẩm chứa độc tố kiểu B) trong các trường hợp ngộ độc tại Pháp.

Tuy nhiên, các vụ ngộ độc nghiêm trọng có nguyên nhân là kiểu độc tố A, F và E đang ngày càng gia tăng tại quốc gia này [53]. Tại Mỹ, trong các năm từ 2001 đến 2017 đã có 326 trường hợp ngộ độc botulism được báo cáo. Các vụ ngộ độc thường xảy ra lẻ tẻ và có tần suất trung bình là 19 vụ mỗi năm. Nguyên nhân ngộ độc thường đến từ các loại hoa quả hoặc các thực phẩm có nguồn gốc rau củ đóng hộp gây ra.

Kiểu độc tố gây bệnh phổ biến ở Mỹ là BoNT/A (khoảng 65%), tiếp theo là BoNT/E với khoảng 25% trường hợp ngộ độc đã ghi nhận có nguyên nhân là kiểu độc tố này. Trong khi đó, xếp thứ ba về tần suất xuất hiện tại các vụ ngộ độc là BoNT/B (7%). Tuy không gây ra các trường hợp khẩn cấp về y tế cộng đồng nhưng do mức độ nghiêm trọng của các ca bệnh, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC) vẫn xếp C. botulinum và nhóm có nguy cơ sinh học cao, các cơ sở y tế của nước này cũng được khuyến nghị là nên chứa sẵn một lượng nhất định thuốc kháng độc tố cho BoNT [39].

Theo thống kê của Hệ thống giám sát bùng phát dịch bệnh do thực phẩm quốc gia Trung Quốc công bố, trong giai đoạn từ tháng 1 năm 2004 đến tháng 12 năm 2020, trên toàn Trung Quốc đã xảy ra 80 vụ bùng phát ngộ độc có liên quan đến C. botulinum với tỷ lệ tử vong lên đến 14,25%. Trong các vụ ngộ độc được thống kê thì ngộ độc do BoNT/A được xác định là phổ biến nhất với tỷ lệ 51,85%, tiếp theo là BoNT/B có tỷ lệ xếp thứ hai thấp hơn về độ phổ biến (33,33%). Nghiên 10 cứu cũng chỉ ra rằng, nguyên nhân chính gây ra các vụ bùng phát ngộ độc đến từ đậu phụ thối và thịt bò khô không được bảo quản và chế biến dung cách [38].

Đây cũng là hai món ăn đường phố phổ biến tại Trung Quốc. Việc bảo quản và chế biến các món ăn đường phố từ lâu đã là một mối đe dọa về vệ sinh an toàn thực phẩm. Ngoài hai món ăn được đề cập trên thì còn nhiều món ăn chế biến theo phương pháp truyền thống khác cũng chứa nguy cơ cao về ngộ độc thực phẩm. Tình hình tại Việt Nam Tại Việt Nam, các vụ ngộ độc botulism chưa từng được ghi nhận trước đây.

Tuy nhiên, vụ ngộ độc xảy ra vào tháng 8 năm 2020 do ăn pate chay đã khiến ngành y tế phải nhìn nhận lại nhiều ca bệnh trong quá khứ vì có thể các bệnh nhân tử vong bởi ngộ độc botulism mà không phải là đột quỵ hay một bệnh tiêu hóa cấp tính có triệu chứng tương tự. Các mẫu bệnh phẩm trong vụ ngộ độc này được thu thập tại Bệnh viện Chợ Rẫy ghi nhận sự xuất hiện của gen độc tố BoNT/B [25] trong khi kết quả của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương (NIHE) lại cho thấy nguyên nhân gây ra ngộ độc là kiểu độc tố kép A(B) với gen mã hóa cho độc tố B là gen câm [1,45]. Một số vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra vào năm 2021 cũng được xác định có nguyên nhân đến từ thực phẩm nhiễm C. Trong đó có vụ ngộ độc trẻ sơ sinh ở Hà Nội được xác định nhiễm BoNT có kiểu độc tố kép A(B) với gen B là gen câm [46].

Vi khuẩn Clostridium botulinum 1. Đặc điểm của vi khuẩn Clostridium botulinum Vi khuẩn C. botulinum lần đầu được Emile Pierre van Ermengem phát hiện vào năm 1895 từ một vụ ngộ độc botulism tại Bỉ. Năm 1897, ông đã công bố kết quả phân lập của mình cùng với mô tả về yêu cầu nuôi cấy và độc tố của nó trên tạp chí vi sinh học của Đức và gọi nó là Bacillus botulinus [12].

Sau này, khi chi Bacillus gồm các vi khuẩn hiếu khí được tách riêng ra, Bacillus botulinus được đổi thành C. botulinum thuộc chi Clostridium gồm các vi khuẩn kỵ khí [74]. botulinum là một vi khuẩn Gram dương có hình que, sống kỵ khí, sinh bào tử, di chuyển được và có khả năng sinh độc tố thần kinh botulinum. botulinum có sức đề kháng cao giúp vi khuẩn sống sót trong các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường có pH thấp hay điều kiện kỵ khí [49].

botulinum tồn tại phổ biến trong môi trường đất, nước và không khí bụi. botulinum sản sinh độc tố trong môi trường kỵ khí như ở trong các loại đồ hộp hay thực phẩm muối chua có khả năng gây ngộ độc thực phẩm. botulinum được nhuộm bằng Gentian tím dưới kính hiển vi (https://microbe-canvas. Các con đường gây nhiễm vi khuẩn C.

botulinum Nguồn gốc chủ yếu gây nhiễm C. botulinum đến từ các loại thực phẩm đóng hộp, đặc biệt là các loại thực phẩm có độ acid thấp (pH >4,6), thực phẩm chế biến sẵn có liên quan đến khoảng 10% số vụ bùng phát [78]. Các loại thực phẩm này là môi trường lý tưởng cho vi khuẩn sinh trưởng và sản sinh độc tố.