Đặt vấn đề Hiện nay ngành công nghệ enzyme ngày càng phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường và đặc biệt là trong y học.5) là một trong những enzyme được ứng dụng nhiều trong các phân tích y học. Đây là enzyme thủy phân cơ chất urea, sản phẩm của quá trình khử độc từ NH: trong cơ thể và được đảo thải ra nước tiểu. Trong lĩnh vực xét nghiệm, giá trị nồng độ urea máu và nước tiểu có vai trò rất lớn trong chấn đoán và theo dõi các bệnh lý về thanh lọc ở thận. Enzyme urease thường được dùng trong các bộ kit thử định lượng urea máu và nước tiêu hay dưới dạng enzyme không tan trong máy chạy thận nhân tạo để lọc máu.
Ở Việt Nam, nguồn thu nhận enzyme urease rất dồi dào, có thể từ động vật, thực vật, vi sinh vật đều có khả năng sản xuất enzyme với khả năng ứng dụng rất lớn. Tuy nhiên hầu hết các sản phâm enzyme tinh chế, các bộ kit hóa chất định lượng urea được sử dụng ở Việt Nam đều phải nhập khâu với giá thành khá cao. Trên thế giới hiện có nhiều nghiên cứu về tách chiết, cố định enzyme urease trên các vật liệu vô cơ, hữu cơ, cải tiến được độ bền của vật liệu và đã cho kết quả rất tốt khi ứng dụng trong y học. Trong khi đó, các nghiên cứu trong nước vềenzyme urease chỉ tập trung vào tách chiết và tinh sạch từ nguồn đậu nành hay có định enzyme urease ứng dụng trong ngành thực phâm, còn ứng dụng trong y học thì rất ít.
Với nguồn nguyên liệu là hạt đậu nành ở Việt Nam cho năng suất ôn định, giá cả hợp lý, việc nghiên cứu thu nhận, tĩnh sạch, tăng khả năng tái sử dụng của enzyme urease và ứng dụng trong xét nghiệm phân tích urea trong máu là cần thiết. Mục đích nghiên cứu Ở nước ta, enzyme urease từ đậu nành đã được nhiều tác giả nghiên cứu các phương pháp thu nhận, tỉnh sạch nhưng chưa có nghiên cứu nào cho việc cố định sản phẩm enzyme này. Do quá trình tách chiết và tỉnh sạch enzyme thường mất nhiều thời gian và chỉ phí nên việc nghiên cứu, khảo sát một số chất mang dùng cho cô định enzyme để tăng khả năng tái sử dụng mà vẫn duy trì được hoạt tính của enzyme sẽ đem lại nhiều lợi ích đáng kể. HƯTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ - 2013 Ngoài ra trong lĩnh vực y học, enzyme urease thường được dùng trong các bộ kit thử xét nghiệm định lượng urea máu, nước tiêu đưới dạng hòa tan; hay dạng không tan trên các biosensor của hệ thống máy sinh hóa, miễn dịch tự động, máy lọc thận.
Với tính chất giúp cho phản ứng xảy ra nhanh hơn, enzyme đã giúp cho việc phân tích, xác định nồng độ các chất trong bệnh phẩm rất nhiều. Do đó đề tăng hiệu quả tái sử dụng, chúng tôi tiến hành cố định enzyme urease sau khi tách chiết, tỉnh sạch từ hạt đậu nành Việt Nam trên một số vật liệu nhằm chọn ra vật liệu tối ưu, đồng thời khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính urease. Từ đó chúng tôi sẽ so sánh giá trị urea đo được với kết quả urea khi sử dụng bộ kit dạng thương mại để định lượng urea trong huyết thanh bệnh nhân. Kết quả của nghiên cứu có thê làm tiền đề cho những nghiên cứu tạo bộ kit thử urea máu với giá thành phù hợp.
Đối tượng nghiên cứu - Enzyme urease thu nhan từ đậu nành, sau đó được cố định với chất mang hữu cơ, chất mang dạng phức hữu cơ kết hợp hữu cơ, hữu cơ kết hợp vô cơ. - _ Sản phẩm enzyme urease cố định với các điều kiện tốt nhất sẽ được dùng để xúc tác phản ứng thủy phân urea trong huyết thanh bệnh nhân nhằm xác định nồng độ urea mau. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu cố định enzyme urease thu nhận từ đậu nành được thực hiện trên các chat mang alginate, chitosan, alginate kết hợp chitosan, alginate kết hợp với celite. Lựa chọn chất mang phù hợp, đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng (pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất) đến hoạt tính của enzyme cố định đề có thể sử dụng sản phẩm một cách tốt nhất.
Từ đó ứng dụng trong xét nghiệm urea máu của bệnh nhân có so sánh với kết quả định lượng trên máy sinh hóa tự động. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Với nguồn nguyên liệu có sẵn trong nước, enzyme urease tách chiết từ đậu nành khi được cố định sẽ bền vững hơn trong môi trường phản ứng và có khả năng tái sử dụng nhiều lần. Do đó sẽ mang lại lợi ích đáng kể như tiết kiệm thời gian va chi phí của xét nghiệm urea trong máu. Ngoài ra nghiên cứu cũng có thể làm tiền đề cho những nghiên cứu tạo bộ kit thử urea máu với giá thành phù hợp.
HƯTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ - 2013 CHUONG1: TONG QUAN 1. TONG QUAN VE ENZYME UREASE Urease (EC 3.5) thuộc nhóm enzyme thủy phân, trong đó số 3 chi nhóm chính là hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-N (không phải liên kết peptid), số I chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng, số 5 chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ. Enzyme urease có thể tìm thấy trong nhiều loài thực vật, vi khuẩn (Lactobacillusruminis, — Lactobacillusfermentum, Helicobacter _ pylori, Campylobacterpylori.) , nẵm Rhizopusoryzae và trongnhiều loạimôcủangườinhư niêm mạc dạ dày, gan, thận,hồng cầu. Trọng lượng phân tử của enzyme urease có nguồn gốc khác nhau thì khác nhau tùy thuộc vào thành phần cấu tạo.
Enzyme urease chiếm tỉ lệ cao trong các loài cây họ đậu : trong đậu nành (Giycine max) chiếm khoảng 0,012% trọng lượng khô và trong đậu rựa (Jack bean) là 0,07 — 0,14 % {1. Lịch sử phát triển - Năm 1773, Hillare M. Rouelle đã phát hiện urea hiện diện trong nước tiểu người [4]. - Nam 1798, nghiên cứu dẫn xuất amoniac trong nước tiêu do quá trình lên men urea của Fourcroy and Vauquelin đã được công nhận [4].
- Nam 1864, Tieghem đã phân lập được chủng vi khuẩn Micrococcus ureae c6 khả năng phân giải urea trong nước tiểu [4]. - Năm 1874, Musculus đã thu nhận được một loại enzyme phân giải urea trong nước tiêu đã phân hủy, đến năm 1890 theo đề xuất của Miquel thì enzyme này được đặt tên là urease [4]. - Nam 1909, Takeuchi phát hiện ra enzyme urease hiện diện trong hạt đậu nành (Glycin max) [5]. - Nam 1913, nhiều nghiên cứu cho rằng enzyme urease có thể được ứng dụng xác định sự hiện diện của urea.
Sau khi phát hiện enzyme urease có mặt trong hạt đậu nành, các thử nghiệm cũng đã cho thấy enzyme này cũng tổn tại trong HƯTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ - 2013 hạt thầu dầu tuy nhiên khả năng thủy phân lượng urea ít hơn trong đậu nành [6]. - Nam 1926, giáo sư James B.Sumner, nhà khoa học người Đức, là người đầu tiên đã chứng minh enzyme này là một loại protein. Ông đã thành công trong việc tách chiết va két tinh enzyme urease thanh dang tinh thể trong suốt từ Canavalia ensiformis (dau rua) [6] - Năm 1946 phat minh cua James B.Sumner mới được công nhận và ông đã được trao giải Nobel Hóa học. Đây chính là bước ngoặc cho các nghiên cứu về enzyme urease sau này.
mA James Batcheller Sumner Hình 1.1: Giáo sư James Batcheller Sumner* Ì người đầu tiên đã thành công trong tách chiết và kết tỉnh urease từ đậu rựa. Ngày nay đã có rất nhiều tác giả đã nghiên cứu khảo sát, cải tiễn để tăng hiệu quả thu nhận, tăng khả năng tái sử dụng enzyme urease để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phâm, y học, môi trường. Đặc điểm của enzyme urease - _ Tên hệ thống: urea aminohydrolase. - Trong lượng phân tử: 480 — 545 KDa.
- Dé bén: dang khé cé thé bén tir 4-12 tháng. - _ Các chất ức chế: ion kim loại nang, thiocynate. HVTH: Lé Thi My Ngoc Luận văn thạc sĩ - 2013 1. Cấu trúc đặc trưng của enzyme urease Enzyme urease có nguồn gốc từ thực vật và nam được cấu tạo từ các tiểu đơn vị giống nhau, có trọng lượng phân tử khoảng 90 kDa, phổ biến nhất là dang trimer gm 3 chuỗi œ và hexamer gồm 6 chuỗi œ.
Trong khi đó enzyme urease có nguồn gốc từ vi khuẩn thì được cấu tạo từ 3 tiểu đơn vị riêng biệt: l chuỗi ơ (60 — 76 kDa), I chuỗi (§— 21 kDa), I chuỗi y (6 — 14 kDa), thường sẽ tạo thành dang trimer a3 B3 y3. M6t số vi sinh vat khac enzyme urease có thé gom 4 Ba Ya, Os s ys. Trước đây khi chưa có kỹ thuật sử dụng tia X trong phân tích cấu trúc tỉnh thê nên chưa thê giải thích được dạng tỉnh thể của enzyme urease. Đến năm 1995, Karplus đã thành công khi dùng kỹ thuật này và đã khẳng định rằng đây là một protein có cấu trúc dạng tinh thể.
Cấu trúc dạng tỉnh thể của enzyme urease (hình 1.2) gồm có 8 cạnh, không màu, trong suốt, có đường kính 4— 30 um.2: Cấu trúc dạng tinh thể của enzym eurease HƯTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ - 2013 LƯreass từ đậu nành | 93 5 kDa | (Givein mare) Unease tử đậu ha lan | 90.0 kDa | (Cajanus cajan) Urease tir hat bing [ 98 3kDa | (Gossypium hirsutwm) Urease tir nam 912kDa | 835 = (Schizosaccharomces pombe Urease tir nam | 915kDa | 339 = (Coccidioides imumitis) ? 5 a Unease tir vi khudn [ 111kDa |Í 117kDa |Í 60 3 kDa | tô t1 06 56 “= (Klebsiella aerogenes) Y 5 a Unease tir vi kun |iiexps || i22xp: || 610xDa | me“.z= (Proteus mirabilis) 3 a Urease tir vi khuan | 111kDa || 140 kDa | 614kDa | L01/126570= (Baciiius pasteurii) ? 5 a Unease tir vi kimin [ 112uD2 |[ 13.6xD2 || 666xDaz | tas.~ (treapia:ma turyea[yticum) Y 3 a Unease tir vi khugn [ 110xD2 |[ 121 xD2 || 610kDa | ›2'sz= (Proteus vulgaris) ? 5 a Unease từ vi khuẩn | 110kDa | 154kDa | 61kDa | 98/138/57t= (Stapiwiococcus xviosus) ? 5 a Unease tir vi Kuan [ 120xD2 |[ 210xp2 || 650kDa | £@tt#= (Stapiyviococcuz leet) 3 a UƯeass từ vị khuẩn | 139kDa || 204kDa | 724kDa | t0 1/1 06/5~e= (Stapiviococcus sapropiqyticus) Y 5 a Unease tir vi Khudn [ søxp: |[:sox: || 73.3:Cấu tạo của enzyme urease từ các nguồn gốc khác nhau [4] HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ - 2013 Enzyme urease có 2 vùng hoạt tính và đặc hiệu với cơ chất là urea hoặc các chất có cấu trúc tương tự urea. Năm 1975, Dixon đã chứng minh được urease là một enzyme đầu tiên có chứa ion Nikel [7]. Urease là một trong rất ít enzyme đòi hỏi phải có Nikel cho hoạt động xúc tác.