Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease hiv 1 từ dịch chiết của lá cây thạch châu pyrenaria jonqueriana ổi psidium guajava và ma hoàng ephedra distachya 14

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease hiv 1 từ dịch chiết của lá cây thạch châu pyrenaria, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp

• Tác giả: Nguyễn Hồng Anh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1
• 1.1.1. Giới thiệu chung về HIV
• 1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1
• 1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1
• 1.2. CÁC CHẤT ỨC CH PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ AIDS
• 1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hoá học
• 1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên
• 1.3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Mẫu dƣợc liệu
• 1.3.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác
• 1.4. MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ
• 1.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật
• 1.5.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách
• 1.5.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin
• 1.5.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến
• 1.5.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu
• 1.6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.6.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.)
• 1.6.1.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.)
• 1.6.1.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Ổi (Psidium guajava L.)
• 1.6.1.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết và phân đoạn từ thân cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.)
• 1.6.2. TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.)
• 1.6.2.1. Kết quả tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 từ cao Hx của lá Ổi
• 1.6.2.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 của hợp chất LO-I
• 1.6.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I
• 1.6.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC
• 1.6.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1 của acid ursolic
• 1.6.3.2. Cơ chế ức chế protease HIV-1 của acid ursolic
• 1.6.3.3. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chất ức chế protease HIV 1 từ thực vật

Nghiên cứu về chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. HIV-1 là virus gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), và protease của nó đóng vai trò quan trọng trong chu trình sinh sản của virus. Việc tìm kiếm các chất ức chế tự nhiên từ thực vật không chỉ giúp phát triển các phương pháp điều trị mới mà còn tận dụng nguồn tài nguyên phong phú từ thiên nhiên.

1.1. Giới thiệu về HIV 1 và tầm quan trọng của protease

HIV-1 là một virus thuộc họ Retroviridae, gây ra AIDS. Protease HIV-1 là enzyme cần thiết cho việc phân cắt các polyprotein thành các protein chức năng. Sự hoạt động của protease là điều kiện tiên quyết để virus có thể lây nhiễm và phát triển trong cơ thể người.

1.2. Tại sao cần nghiên cứu chất ức chế từ thực vật

Việc phát triển các chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật có thể mang lại những lợi ích lớn. Các hợp chất tự nhiên thường có ít tác dụng phụ hơn so với các thuốc tổng hợp, đồng thời có thể giúp giảm thiểu tình trạng kháng thuốc của virus.

II. Thách thức trong việc phát triển chất ức chế protease HIV 1

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về chất ức chế protease HIV-1, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phát triển và ứng dụng chúng. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự xuất hiện của các chủng virus kháng thuốc, điều này làm giảm hiệu quả của các liệu pháp hiện tại.

2.1. Khó khăn trong việc tìm kiếm chất ức chế hiệu quả

Việc tìm kiếm các chất ức chế hiệu quả từ thực vật đòi hỏi phải sàng lọc một số lượng lớn các hợp chất. Điều này không chỉ tốn thời gian mà còn đòi hỏi nguồn lực nghiên cứu đáng kể.

2.2. Tình trạng kháng thuốc của HIV 1

HIV-1 có khả năng đột biến cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc. Điều này làm cho việc phát triển các chất ức chế mới trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết.

III. Phương pháp nghiên cứu chất ức chế protease HIV 1 từ thực vật

Nghiên cứu chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật thường sử dụng các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện đại. Các mẫu thực vật được thu thập và chiết xuất để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính ức chế protease.

3.1. Quy trình chiết xuất từ thực vật

Quy trình chiết xuất thường bao gồm việc sử dụng dung môi để tách các hợp chất từ mẫu thực vật. Các phương pháp như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để phân tích và xác định các hợp chất có hoạt tính.

3.2. Đánh giá hoạt tính ức chế protease

Hoạt tính ức chế protease HIV-1 được đánh giá thông qua các phương pháp như khuếch tán trên đĩa thạch hoặc sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu. Những phương pháp này giúp xác định hiệu quả của các hợp chất chiết xuất từ thực vật.

IV. Kết quả nghiên cứu chất ức chế protease HIV 1 từ thực vật

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số hợp chất chiết xuất từ lá cây Thạch châu, Ổi và Ma hoàng có khả năng ức chế hoạt tính của protease HIV-1. Những kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS.

4.1. Khả năng ức chế từ lá cây Thạch châu

Các dịch chiết từ lá cây Thạch châu cho thấy hoạt tính ức chế mạnh mẽ đối với protease HIV-1. Nghiên cứu đã xác định được các hợp chất chính có khả năng ức chế này.

4.2. Tác dụng của dịch chiết từ cây Ổi

Dịch chiết từ lá cây Ổi cũng cho thấy khả năng ức chế đáng kể. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để xác định cơ chế hoạt động của các hợp chất này.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu chất ức chế HIV 1

Nghiên cứu về chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật không chỉ mang lại hy vọng cho việc điều trị HIV/AIDS mà còn mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực dược liệu. Việc khai thác nguồn tài nguyên thực vật phong phú của Việt Nam có thể dẫn đến những phát hiện quan trọng trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu chất ức chế từ thực vật

Với sự phát triển của công nghệ và phương pháp nghiên cứu hiện đại, việc tìm kiếm và phát triển các chất ức chế từ thực vật sẽ ngày càng trở nên khả thi và hiệu quả hơn.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để xác định các hợp chất tiềm năng từ thực vật, cũng như đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chúng trong điều trị HIV/AIDS.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

HIV/AIDS vẫn là đại dịch toàn cầu với khoảng 36,9 triệu người nhiễm HIV tính đến cuối năm 2014, trong đó có 2 triệu ca nhiễm mới và 1,2 triệu ca tử vong trong năm đó. Ở Việt Nam, trong 6 tháng đầu năm 2015, có 3.204 người nhiễm HIV mới, 1.326 người chuyển sang giai đoạn AIDS và 438 người tử vong do AIDS. Mặc dù liệu pháp thuốc kháng retrovirus (ART) đã được áp dụng rộng rãi, sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc vẫn là thách thức lớn trong điều trị. Protease HIV-1 là enzyme thiết yếu trong quá trình trưởng thành của virus, phân cắt các polyprotein tiền thân thành các protein cấu trúc và chức năng. Việc ức chế hoạt tính protease HIV-1 làm virus không thể hoàn chỉnh và mất khả năng xâm nhiễm tế bào vật chủ, do đó protease là mục tiêu quan trọng trong phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS.

Tuy nhiên, các thuốc ức chế protease tổng hợp hiện nay gặp phải nhiều hạn chế như tác dụng phụ và sự kháng thuốc do đột biến virus. Việt Nam sở hữu nguồn dược liệu phong phú với hơn 12.000 loài thực vật, trong đó gần 4.000 loài được sử dụng trong y học cổ truyền, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tìm kiếm các chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên. Luận văn tập trung nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya) nhằm phát hiện các hợp chất tiềm năng có thể phát triển thành thuốc điều trị HIV/AIDS. Nghiên cứu được thực hiện tại Việt Nam trong giai đoạn 2012-2015, góp phần mở rộng hiểu biết về dược liệu Việt Nam và cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển thuốc kháng HIV mới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng protease HIV-1: Protease HIV-1 là enzyme aspartyl homodimer gồm 2 monomer, mỗi monomer 99 acid amin, có trung tâm hoạt động chứa bộ ba Asp-Thr-Gly. Enzyme phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành các protein cấu trúc và enzyme cần thiết cho sự trưởng thành của virus. Sự ức chế protease làm virus không hoàn chỉnh, mất khả năng lây nhiễm.

• Cơ chế ức chế enzyme: Các chất ức chế protease HIV-1 có thể là peptide hoặc không peptide, gắn vào trung tâm hoạt động enzyme theo cơ chế cạnh tranh hoặc không cạnh tranh. Đột biến tại các vị trí trung tâm hoạt động hoặc vùng ngoại vi ảnh hưởng đến hiệu quả ức chế và gây kháng thuốc.

• Khả năng ức chế protease HIV-1 của các hợp chất tự nhiên: Các hợp chất triterpen, flavonoid, lignin, phenol từ thực vật và nấm có hoạt tính ức chế protease HIV-1 với các mức độ khác nhau. Acid ursolic là một triterpen có hoạt tính ức chế mạnh và đặc hiệu.

• Phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt tính enzyme: Sử dụng pepsin làm enzyme thay thế để sàng lọc sơ bộ do tính tương đồng cấu trúc và cơ chế xúc tác với protease HIV-1. Đánh giá hoạt tính ức chế bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, phương pháp Anson cải tiến với cơ chất hemoglobin, và phương pháp sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu cho protease HIV-1 đo quang phổ UV và huỳnh quang.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu dược liệu gồm lá cây Thạch châu, lá cây Ổi và thân cây Ma hoàng được thu hái tại Việt Nam, xác định loài chính xác và lưu giữ tại Viện Dược liệu. Các hóa chất, enzyme, cơ chất peptide đặc hiệu và kit đo hoạt tính protease HIV-1 được nhập khẩu từ các hãng uy tín.

• Phân tách và tinh sạch hợp chất: Dịch chiết ethanol từ lá cây được phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (hexan, ethyl acetate, butanol). Các phân đoạn có hoạt tính được tinh sạch bằng sắc ký silica gel với hệ dung môi gradient. Hợp chất tinh sạch được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ UV, IR, MS, NMR (^1H, ^13C, DEPT).

• Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme:

  • Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất hemoglobin để sàng lọc hoạt tính ức chế pepsin.
  • Phương pháp Anson cải tiến đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm để xác định hoạt tính ức chế pepsin.
  • Đo hoạt tính protease HIV-1 bằng cơ chất peptide đặc hiệu L6525, theo dõi sự giảm hấp thụ A300 trong phản ứng thủy phân.
  • Xác định kiểu ức chế enzyme bằng phân tích đồ thị Lineweaver-Burk, tính toán các thông số Km và Vmax.

• Cỡ mẫu và timeline: Nghiên cứu thực hiện trong vòng 3 năm (2012-2015), với nhiều lần lặp lại thí nghiệm để đảm bảo độ tin cậy số liệu. Mẫu dược liệu được thu thập và xử lý theo quy trình chuẩn, các phân đoạn và hợp chất được đánh giá hoạt tính nhiều lần.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khả năng ức chế pepsin của dịch chiết thực vật:

   • Phân đoạn butanol từ lá Thạch châu ức chế pepsin tốt nhất với đường kính vòng phân giải 1,0 cm, tương đương mức độ ức chế +.
   • Lá Ổi có hoạt tính ức chế pepsin mạnh hơn, đặc biệt phân đoạn hexan và ethyl acetate đều có đường kính vòng phân giải 0,9 cm, mức độ ức chế ++.
   • Cây Ma hoàng có hoạt tính ức chế pepsin thấp hơn, phân đoạn butanol ức chế ở mức + với đường kính vòng phân giải 1,05 cm.

2. Phân lập hợp chất ức chế từ lá Ổi:

   • Cao phân đoạn hexan từ lá Ổi chứa hợp chất chính là triterpen với Rf = 0,7 trên sắc ký lớp mỏng.
   • Phân đoạn PĐ2 từ cao hexan có khả năng ức chế pepsin mạnh nhất với đường kính vòng phân giải 0,9 cm.
   • Hợp chất tinh sạch LO-I từ PĐ2 ức chế pepsin tương đương pepstatin A ở nồng độ 50 mg/ml, ức chế protease HIV-1 trên 70% ở nồng độ 2,5 µg/ml, mạnh hơn PĐ2 1,8 lần.

3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I:

   • LO-I được xác định là acid ursolic, một triterpen khung ursan, công thức phân tử C30H48O3, nhiệt độ nóng chảy 260-262°C.
   • Các phổ UV, IR, MS, NMR khẳng định cấu trúc acid ursolic.

4. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của acid ursolic:

   • Acid ursolic ức chế protease HIV-1 với IC50 là 3,5 µM, gần như ức chế hoàn toàn ở 20 µM.
   • Ức chế pepsin yếu hơn nhiều với IC50 là 2,5 mM, cho thấy acid ursolic có tính đặc hiệu cao với protease HIV-1.
   • Phân tích Lineweaver-Burk cho thấy acid ursolic ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh, làm giảm cả Km và Vmax.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy dịch chiết từ lá cây Ổi có hoạt tính ức chế pepsin và protease HIV-1 vượt trội so với lá Thạch châu và cây Ma hoàng, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính sinh học của triterpen trong Ổi. Việc phân lập acid ursolic từ lá Ổi và xác định đây là hợp chất chính có hoạt tính ức chế protease HIV-1 là đóng góp quan trọng, mở ra hướng phát triển thuốc kháng HIV từ nguồn dược liệu tự nhiên Việt Nam.

Acid ursolic thể hiện khả năng ức chế protease HIV-1 mạnh và đặc hiệu, vượt trội so với pepsin, giảm nguy cơ tác dụng phụ không mong muốn. Kiểu ức chế không cạnh tranh cho thấy acid ursolic có thể gắn vào vị trí khác trung tâm hoạt động enzyme, giúp hạn chế sự kháng thuốc do đột biến tại trung tâm hoạt động. Điều này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về acid ursolic và các triterpen khác có hoạt tính kháng HIV.

Các phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme được áp dụng đồng bộ, từ sàng lọc sơ bộ bằng pepsin đến xác định chính xác bằng cơ chất peptide đặc hiệu, đảm bảo tính chính xác và tin cậy của kết quả. Đồ thị Lineweaver-Burk và các bảng số liệu minh họa rõ ràng sự thay đổi thông số enzyme khi có chất ức chế, giúp hiểu sâu cơ chế tác động của acid ursolic.

Kết quả nghiên cứu góp phần khẳng định tiềm năng của các hợp chất tự nhiên trong điều trị HIV/AIDS, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các thuốc ức chế protease HIV-1 mới, an toàn và hiệu quả hơn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển acid ursolic thành chế phẩm thuốc ức chế protease HIV-1

   • Tiến hành nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của acid ursolic trong điều trị HIV/AIDS.
   • Mục tiêu: Giảm tải lượng virus và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.
   • Thời gian: 3-5 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu dược liệu, bệnh viện chuyên khoa.

2. Mở rộng nghiên cứu sàng lọc các hợp chất triterpen khác từ dược liệu Việt Nam

   • Tập trung vào các cây thuốc có chứa triterpen để tìm kiếm các chất ức chế protease HIV-1 tiềm năng.
   • Mục tiêu: Tăng số lượng ứng viên thuốc tự nhiên.
   • Thời gian: 2-3 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các trường đại học, viện nghiên cứu sinh học.

3. Nâng cao công nghệ phân tích và tinh sạch hợp chất

   • Áp dụng các kỹ thuật sắc ký hiện đại như UPLC, MS/MS để tăng độ chính xác và hiệu quả phân lập.
   • Mục tiêu: Rút ngắn thời gian nghiên cứu, tăng độ tinh khiết hợp chất.
   • Thời gian: 1-2 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme và protein.

4. Phát triển các chế phẩm kết hợp acid ursolic với thuốc ART hiện hành

   • Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng, giảm liều thuốc tổng hợp và hạn chế tác dụng phụ.
   • Mục tiêu: Tăng hiệu quả điều trị, giảm kháng thuốc.
   • Thời gian: 3-4 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu lâm sàng, công ty dược phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược liệu và sinh học thực nghiệm

   • Lợi ích: Cung cấp dữ liệu khoa học về hoạt tính sinh học của acid ursolic và các hợp chất triterpen, phương pháp phân lập và đánh giá enzyme.
   • Use case: Phát triển nghiên cứu sâu hơn về thuốc kháng HIV từ dược liệu.

2. Bác sĩ và chuyên gia điều trị HIV/AIDS

   • Lợi ích: Hiểu thêm về các liệu pháp điều trị mới có nguồn gốc tự nhiên, tiềm năng kết hợp với liệu pháp ART.
   • Use case: Tư vấn và áp dụng các phương pháp điều trị hỗ trợ cho bệnh nhân.

3. Cơ quan quản lý dược phẩm và y tế

   • Lợi ích: Tham khảo cơ sở khoa học để đánh giá, cấp phép các sản phẩm thuốc mới từ dược liệu.
   • Use case: Xây dựng chính sách phát triển thuốc kháng HIV tự nhiên.

4. Doanh nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học

   • Lợi ích: Tìm kiếm nguyên liệu và công nghệ phát triển thuốc mới, mở rộng danh mục sản phẩm.
   • Use case: Đầu tư nghiên cứu và phát triển sản phẩm thuốc ức chế protease HIV-1 từ acid ursolic.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn pepsin để sàng lọc hoạt tính ức chế protease HIV-1?
   Pepsin có cấu trúc và cơ chế xúc tác tương tự protease HIV-1, dễ sử dụng trong sàng lọc sơ bộ do tính đặc hiệu cao của protease HIV-1 với cơ chất peptide đặc hiệu. Ví dụ, nhiều nghiên cứu đã dùng pepsin để đánh giá hoạt tính ức chế ban đầu trước khi xác định chính xác trên protease HIV-1.

2. Acid ursolic có ưu điểm gì so với các thuốc ức chế protease tổng hợp?
   Acid ursolic có nguồn gốc tự nhiên, ít tác dụng phụ, đặc hiệu cao với protease HIV-1 và ức chế theo kiểu không cạnh tranh, giúp hạn chế kháng thuốc do đột biến trung tâm hoạt động enzyme. Đây là lợi thế so với các thuốc tổng hợp thường gây tác dụng phụ và dễ kháng thuốc.

3. Phương pháp xác định kiểu ức chế enzyme được thực hiện như thế nào?
   Sử dụng đồ thị Lineweaver-Burk để phân tích sự thay đổi Km và Vmax khi có và không có chất ức chế. Acid ursolic làm giảm cả Km và Vmax, cho thấy kiểu ức chế không cạnh tranh, tức chất ức chế gắn vào vị trí khác trung tâm hoạt động enzyme.

4. Nguồn dược liệu Việt Nam có tiềm năng như thế nào trong nghiên cứu thuốc kháng HIV?
   Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó gần 4.000 loài được dùng làm thuốc, cung cấp nguồn nguyên liệu phong phú để sàng lọc các hợp chất có hoạt tính ức chế protease HIV-1, như acid ursolic từ lá Ổi trong nghiên cứu này.

5. Các bước tiếp theo để phát triển acid ursolic thành thuốc điều trị là gì?
   Cần tiến hành nghiên cứu tiền lâm sàng về độc tính, dược động học, sau đó thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn trên người. Đồng thời, phát triển công nghệ bào chế và phối hợp với các thuốc ART hiện hành để tăng hiệu quả điều trị.

Kết luận

• Dịch chiết từ lá cây Ổi có hoạt tính ức chế protease HIV-1 vượt trội so với lá Thạch châu và cây Ma hoàng.
• Hợp chất acid ursolic được phân lập từ lá Ổi là chất ức chế protease HIV-1 mạnh với IC50 3,5 µM và đặc hiệu cao so với pepsin.
• Acid ursolic ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh, giúp hạn chế kháng thuốc do đột biến enzyme.
• Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển thuốc kháng HIV từ dược liệu Việt Nam, góp phần đa dạng hóa liệu pháp điều trị HIV/AIDS.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu tiền lâm sàng, lâm sàng và phát triển công nghệ bào chế acid ursolic để ứng dụng trong điều trị HIV/AIDS.

Khuyến khích các viện nghiên cứu, bệnh viện và doanh nghiệp dược phẩm phối hợp triển khai các nghiên cứu phát triển acid ursolic thành thuốc điều trị HIV hiệu quả và an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV). Đây là virus thuộc họ Retroviridae và có hai type chính là HIV-1 và HIV-2, trong đó type 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân chính gây ra AIDS ở ngƣời. Cho đến nay, dù đã có những chƣơng trình hành động toàn cầu cùng với sự phát triển của các phƣơng pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch của toàn nhân loại và cần thiết phải tăng cƣờng các biện pháp phòng ngừa, điều trị bệnh hiệu quả. Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp rất nhiều khó khăn và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thƣờng xuyên xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên.

Vì vậy, cho đến hiện nay, ngƣời nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đƣờng duy nhất là sử dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) [39]. Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trƣởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn hình thành nhƣng không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [26]. Vì vậy, một số chất ức chế protease HIV-1 (PI) đã đƣợc phát triển thành thuốc điều trị bệnh nhân HIV/AIDS.

Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trong thời gian dài với nồng độ cao cùng với tốc độ đột biến lớn của HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc là một trong những nguyên nhân chính gây thất bại điều trị với ART nói chung và PI nói riêng. Hơn nữa, việc thiết kế các chất PI mới không phải dễ dàng, không định hƣớng, phải sàng lọc trên số lƣợng khá lớn các hợp chất thiết kế tƣơng tự nhau trên cơ sở hiểu biết về cấu trúc và chức năng của protease HIV-1. Mặt khác, những chất này nhiều khi không thân thiện với con ngƣời, phải trải qua nhiều bƣớc thử nghiệm. Chính vì vậy, bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học trên thế giới cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease của HIV-1 (protease HIV-1).

1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc có giá trị lớn với sức khỏe con ngƣời. Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học cổ truyền. Nhƣ vậy, thực vật Việt Nam cũng s là nguồn nguyên liệu phong phú để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chƣa khai thác nguồn tài nguyên phong phú của đất nƣớc theo hƣớng này.

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya)” nhằm thu nhận đƣợc chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc từ dƣợc liệu Việt Nam. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1 1.

Giới thiệu chung về HIV Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát triển xã hội. Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nƣớc phát triển, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các nƣớc châu Á. Đến nay vẫn chƣa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị AIDS đặc hiệu. Theo chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2015), tính đến cuối năm 2014, thế giới có khoảng 36,9 triệu ngƣời (dao động trong khoảng từ 34,3 triệu đến 41,4 triệu) đang mang căn bệnh AIDS, trong đó số đối tƣợng nhiễm mới là 2 triệu ngƣời và có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS trong năm 2014.

Khu vực các nƣớc Châu Phi gần Sahara (Sub-Saharan Africa) vẫn là nơi có số ngƣời nhiễm HIV cao nhất trên thế giới với hơn 2/3 dân số, tiếp đến là châu Á Thái Bình Dƣơng với 5,0 triệu ngƣời nhiễm HIV [91]. Ở Việt Nam, theo số liệu mới nhất của Cục phòng chống HIV/AIDS, Bộ Y tế (Báo cáo số 561/BC-BYT của Cục phòng chống HIV/AIDS, ngày 18/6/2015) trong 6 tháng đầu năm 2015, số ngƣời xét nghiệm phát hiện mới nhiễm HIV là 3.204 ngƣời, số ngƣời nhiễm HIV chuyển sang giai đoạn AIDS là 1.326 ngƣời, số ngƣời nhiễm HIV tử vong là 438 và số tử vong báo cáo bổ sung quý II/2015 là 1500 ngƣời. Lũy tích số ngƣời nhiễm HIV đang còn sống 227.114 ngƣời, số bệnh nhân AIDS là 71.115 và số tử vong là 74. Nhìn chung, lây truyền HIV/AIDS qua đƣờng tình dục ngày càng gia tăng liên tục từ 2007 trở lại đây; số ngƣời nhiễm HIV phát hiện mới tiếp tục có xu hƣớng giảm, nhƣng lũy tích số ngƣời nhiễm HIV còn sống tiếp tục gia tăng.

Trong phòng chống nhiễm HIV/AIDS, phƣơng thức điều trị phổ biến nhất hiện nay vẫn là liệu pháp dùng thuốc chống virus (ART-antiretroviral drug therapy) bao gồm thuốc ức chế reverse transcriptase, thuốc ức chế integrase và thuốc ức chế 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Trong đó, protease đƣợc mã hóa bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [26]. Vì vậy, protease của HIV-1 (protease HIV-1) là một trong những đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị AIDS.

Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1 Về cấu trúc, protease HIV-1 là một protease aspartyl (có chứa gốc aspartic trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A 2. Năm 1989, Navia và tập thể từ phòng thí nghiệm của Merck là nhóm đầu tiên công bố cấu trúc tinh thể của protease HIV-1. Sau đó, một cấu trúc chính xác hơn đã đƣợc báo cáo bởi Kent và tập thể [16]. Đến năm 2010, với sự đóng góp đáng kể của phƣơng pháp nhiễu xạ tia X, hơn 400 cấu trúc của protease HIV-1 (kiểu dại và dạng đột biến) trong phức hệ với các chất ức chế khác nhau đã đƣợc làm sáng tỏ.

Những dẫn liệu này giúp các nhà nghiên cứu có đƣợc hiểu biết sâu sắc về các kiểu liên kết của enzyme với chất ức chế và cơ sở phân tử của kháng thuốc [10, 83]. Protease HIV-1 là một homodimer, mỗi monomer gồm 99 acid amin và đƣợc sắp xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng. Mô hình cấu trúc bậc hai đƣợc thể hiện rõ ràng ở phiến nếp gấp β và một đoạn xoắn α ngắn gần đầu C [37]. Cấu tạo của protease HIV-1 có thể chia thành ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ (Hình 1.

Trong đó, vùng dimer hóa đƣợc hình thành nhờ tƣơng tác giữa 8 gốc acid amin 1 - 4 (vùng N đầu cùng) và 96 - 99 (vùng C tận cùng) từ mỗi monomer và các acid amin trong trung tâm hoạt động 24 - 29. Các gốc acid amin này là 2 đầu C của phiến gấp nếp β đƣợc cấu tạo theo nguyên tắc các acid amin kỵ nƣớc Pro1, Ile3, Leu97 và Phe99 hƣớng vào nội phân tử enzyme còn các gốc phân cực Gln2, Thr4, Thr96 và Asn98 thì quay ra ngoài tiếp xúc với dung môi [22]. Bốn gốc ở đầu C tận cùng tham gia vào tƣơng tác giữa các chuỗi để duy trì sự ổn định của cấu trúc dimer, bao gồm 34 liên kết hydro và 4 cầu muối. Tƣơng tác 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] giữa các gốc Ile50 và Gly51’; Asp29, Arg87 và Arg88’ cũng ảnh hƣởng đến sự ổn định của cấu trúc dimer.

Khi enzyme gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất, sự ổn định của cấu trúc dimer đƣợc tăng cƣờng. Vùng lõi gồm 4 đầu N sợi β (các gốc acid amin 10 - 32 và 63 - 85 của mỗi monomer) có vai trò quan trọng đối với sự ổn định cấu trúc dimer và hoạt tính xúc tác của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme nằm trong vùng lõi và bao gồm ba gốc acid amin từ mỗi monomer. Vùng mũ đƣợc mở rộng tạo thành một vùng gấp xuống đóng vai trò giống nhƣ một giá đỡ cho chuyển động của vùng mũ.

Vùng mũ nằm ở phần rộng nhất của enzyme bao gồm các acid amin từ 33 - 43 và 44 - 63 bao quanh trung tâm hoạt động. Đầu N của vùng này rất giàu glycine, do đó tăng cƣờng tính linh hoạt về hình dáng của các enzyme ở dạng tự do [37, 78, 85]. Cấu trúc dạng dimer (A) và cấu trúc chi tiết (B) của protease HIV-1 [43] (Vùng dimer hóa (D), vùng mũ (F), và trung tâm hoạt động (A)) Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp - Thr - Gly nằm tại mặt phân giới của dimer. Tại một monomer nhóm bộ ba xúc tác đƣợc đặt ở vị trí 25 - 26 - 27 và do tính đối xứng ở monomer còn lại là 25’ - 26’ - 27’.

Trung tâm hoạt động đƣợc làm ổn định nhờ mạng lƣới các liên kết hydro giữa các gốc acid amin chính tại vị trí này với các gốc acid amin xung quanh. Cấu trúc khắt khe của trung tâm hoạt động là do gốc Thr26 hình thành các liên kết hydro với nhóm amin của Thr26' và với nhóm oxygen carbonyl của Leu24 nằm ở bên cạnh gốc Asp đóng vai trò xúc tác. Mỗi gốc Asp25 cũng đƣợc liên kết với nhóm NH của Gly27'. Phân tử Asp là cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease.

Vai trò quan trọng của Asp25 đƣợc làm rõ khi thay thế Asp bằng các acid amin khác dẫn đến enzyme bị bất hoạt [27]. 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Để làm rõ cơ sở phân tử và đánh giá những tiềm năng của một chất ức chế chống lại sự kháng thuốc, Hou và tập thể đã tiến hành nghiên cứu vai trò của các gốc riêng biệt trên phân tử protease HIV-1 dựa trên sự kết hợp giữa enzyme với 6 loại cơ chất và 8 chất ức chế đƣợc FDA công nhận. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự đóng góp của các gốc khác nhau vào liên kết giữa enzyme với cơ chất là khác nhau.