Tổng quan luận án

Bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV) là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm tại Việt Nam và trên thế giới. Theo số liệu thống kê trong luận án, diện tích nuôi tôm của Việt Nam tăng từ 324,1 ha năm 2000 lên 652.612 ha vào cuối năm 2013; trong 6 tháng đầu năm 2014, diện tích thả nuôi đạt 638.422,7 ha với tổng sản lượng thu hoạch 258.730 tấn (gồm 113.309 tấn tôm sú và 149.507 tấn tôm thẻ chân trắng), đạt giá trị xuất khẩu 1,7 tỷ USD. Tuy nhiên, dịch bệnh đốm trắng bùng phát phức tạp: năm 2013 dịch xảy ra tại 280 xã thuộc 94 huyện của 28 tỉnh, thành phố với tổng diện tích nhiễm bệnh trên 12.000 ha; từ đầu năm 2014 đến ngày 20/7/2014, diện tích thiệt hại ghi nhận khoảng 25.000 ha tại 232 xã thuộc 60 huyện của 19 tỉnh, thành phố. Tôm nhiễm WSSV có tỷ lệ chết tích lũy lên tới gần 100% chỉ sau từ một đến vài tuần.

Khoảng trống nghiên cứu thực tế nằm ở việc các biện pháp phòng trị WSSV hiện nay còn hạn chế do tôm chưa có hệ miễn dịch thích ứng hoàn chỉnh có trí nhớ miễn dịch, đồng thời cơ chế xâm nhiễm của virus chưa được làm sáng tỏ toàn diện. Các nghiên cứu tạo vaccine tái tổ hợp dạng protein tinh sạch (như VP28 biểu hiện trong vi khuẩn hoặc nấm men) bằng đường tiêm khó áp dụng trên quy mô lớn, còn khi bổ sung vào môi trường nước thì protein dễ bị phân hủy sinh học hoặc biến tính, chi phí sản xuất lại cao. Do đó, yêu cầu đặt ra là phải phát triển một hệ thống vaccine đường uống bền vững, giá thành hợp lý, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung chính:

  1. Nhân dòng, xác định trình tự và một số đặc trưng của gen vp28 từ các mẫu WSSV thu nhận tại các địa bàn nuôi tôm chủ yếu ở Việt Nam.
  2. Tạo chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử dưới dạng protein dung hợp.
  3. Bước đầu đánh giá khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) của chế phẩm bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm (WSSV), hệ thống biểu hiện bề mặt bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm sinh học phân tử và hóa sinh được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội); các thử nghiệm bảo hộ trên tôm được phối hợp thực hiện với Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I và Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ.
  • Phạm vi thời gian: Luận án được thực hiện và hoàn thành trong giai đoạn 2011–2015 dưới sự tài trợ của Đề tài thuộc Chương trình Trọng điểm cấp Nhà nước mã số KC.09/11-15.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến virus WSSV, cấu trúc phân tử kháng nguyên vỏ, đáp ứng miễn dịch ở giáp xác và công nghệ hiển thị protein trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis:

  1. Nghiên cứu về phân loại, hình thái và bộ gen WSSV: Dịch đốm trắng được ghi nhận lần đầu tại Nhật Bản năm 1993 trên tôm Penaeus japonicus (Inouye et al., 1994; Nakano et al., 1994), sau đó bùng phát ở Trung Quốc (Huang et al., 1995), Thái Lan (Wongteerasupaya et al., 1995) và Đài Loan (Chou et al., 1995; Wang et al., 1995). WSSV được phân loại chính thức vào chi Whispovirus, họ mới Nimaviridae (van Hulten et al., 2001). Bộ gen của WSSV là DNA vòng sợi đôi kích thước khoảng 300 kb với 531 khung đọc mở (ORF), tiêu biểu là các chủng WSSV-CN (305 kb, Yang et al., 2001), WSSV-TH (297 kb, van Hulten et al., 2001) và WSSV-TW (307 kb, Tsai et al., 2004).
  2. Nghiên cứu dịch tễ và bệnh học WSSV tại Việt Nam: Bùi Quang Tề và cộng sự (2001) khảo sát 483 hộ nuôi tôm sú tại 8 tỉnh ven biển phía Bắc, ghi nhận 34,37% số hộ có tôm bị bệnh đốm trắng và chết hàng loạt. Nguyễn Viết Dũng và cộng sự (2004) phân tích cấu trúc bộ gen của các chủng WSSV phân lập tại Hà Nội, Long An, Kiên Giang và Cà Mau. Trần Thị Tuyết Hoa (2007) sử dụng kỹ thuật PCR-genotyping (ORF94) để nhận diện các chủng WSSV. Đỗ Thị Thanh Hương và cộng sự (2009, 2010) đánh giá biến đổi sinh lý, sinh hóa của giáp xác khi thay đổi điều kiện môi trường. Nguyễn Văn Hảo và cộng sự (2001) thiết lập mô hình cảm nhiễm thực nghiệm trên tôm sú.
  3. Kháng nguyên vỏ VP28 và các thử nghiệm vaccine: Protein VP28 (kích thước ~27,5 kDa, mã hóa bởi gen wsv421) là protein cấu trúc bề mặt chủ yếu cùng với VP26, VP24 và VP19, chiếm khoảng 60% tổng lượng protein vỏ (van Hulten et al., 2000, 2002; Tang et al., 2007). VP28 đóng vai trò trung gian gắn bám vào thụ thể tế bào vật chủ như PmRab7 (Sritunyalucksana et al., 2006) và Hsc70 (Xu et al., 2009). Nhiều nhóm tác giả đã biểu hiện rVP28 trong Escherichia coli (Sathish et al., 2004; Witteveldt et al., 2004; Phan Thị Phượng Trang và cs., 2008), trong nấm men Pichia pastoris (Jha và Xu, 2006), trong Brevibacillus brevis (Dechamp et al., 2006) hoặc trên bề mặt baculovirus (Syed-Musthaq và Kwang, 2009). Đỗ Thị Thảo và cs. (2012) sử dụng kháng thể đơn dòng kháng VP28 để phát triển que thử chẩn đoán nhanh.
  4. Biểu hiện kháng nguyên trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis: Công nghệ sử dụng các protein lớp áo ngoài (như CotB, CotC, CotG) của bào tử B. subtilis làm protein chuyên chở (carrier) để gắn kháng nguyên ngoại lai đã được chứng minh hiệu quả trong việc tạo vaccine sống đường uống (Isticato et al., 2001; Duc et al., 2003; Cutting et al., 2009).

Khoảng trống luận án tập trung giải quyết: Mặc dù VP28 đã được chứng minh là kháng nguyên tiềm năng, nhưng việc đưa VP28 trực tiếp vào nước nuôi thường làm protein mất hoạt tính, trong khi vi khuẩn sống E. coli không an toàn sinh học. Luận án lựa chọn giải pháp biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt bào tử B. subtilis – một vi khuẩn đường ruột an toàn (probiotic), có lớp vỏ bào tử bền vững với nhiệt độ, pH và enzyme tiêu hóa, giúp bảo vệ kháng nguyên đi qua đường tiêu hóa của tôm và kích thích miễn dịch tại chỗ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về cấu trúc phân tử của virus WSSV, sinh học nội bào tử của vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis và cơ chế đáp ứng miễn dịch bẩm sinh ở động vật giáp xác:

  • Cơ chế xâm nhiễm của WSSV: Phức hợp protein vỏ xuyên màng (VP28, VP19, VP51A) tạo vùng tiếp xúc gắn đặc hiệu với thụ thể màng tế bào tôm, mở đầu cho quá trình xâm nhập của nucleocapsid.
  • Cấu tạo nội bào tử B. subtilis: Bào tử gồm lớp vỏ ngoài (exosporium), lớp áo bào tử (spore coat, dày ~3 nm, chứa 50-80% protein tổng số của bào tử), lớp vỏ trong (cortex, chứa peptidoglycan và chịu áp suất thẩm thấu 20 atm), thành bào tử và lõi tế bào chứa phức hợp acid dipicolinic với ion Ca²⁺ chiếm 15% chất khô, tạo nên độ bền cao đối với nhiệt, bức xạ và hóa chất.
  • Hệ thống miễn dịch bẩm sinh của tôm: Gồm miễn dịch tế bào (thực bào, tạo hạch, bao bọc) và miễn dịch dịch thể (hệ thống prophenoloxidase - proPO, đông máu, peptide kháng khuẩn). Sự kích hoạt chuyển hóa proPO thành phenoloxidase (PO) làm tăng sinh melanin và các dạng oxy phản ứng (ROS); enzyme superoxide dismutase (SOD) tham gia khử độc gốc tự do oxy hóa, phản ánh trạng thái kích thích miễn dịch của tôm.
Nhóm phương pháp Kỹ thuật và công cụ sử dụng Mục đích thực hiện
Sinh học phân tử - Tách chiết DNA tổng số bằng phenol/chloroform
- Phản ứng PCR, Real-time PCR định lượng
- Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
- Giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger		 Nhân dòng gen vp28, phân tích đột biến so với chuỗi chuẩn AY168644; thiết kế vector biểu hiện pDG364-cotB-vp28 và pDG364-cotB-gst-vp28 tích hợp vào nhiễm sắc thể B. subtilis PY79.
Hóa sinh & Miễn dịch - Điện di SDS-PAGE protein
- Thẩm tách miễn dịch (Western blot)
- Kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang
- Đo quang phổ hấp thụ enzyme		 Xác định sự biểu hiện và độ tinh sạch của VP28; kiểm tra sự hiện diện của VP28 trên bề mặt bào tử; định lượng hoạt độ PO (chuyển L-DOPA thành dopachrome) và SOD.
Độ bền lý hóa bào tử - Xử lý nhiệt độ (60°C, 70°C, 80°C, 90°C, 100°C)
- Xử lý môi trường muối NaCl (0,5% đến 20%)
- Xử lý các dải pH (pH 2 đến pH 11)		 Đánh giá sức sống và độ bền vững của bào tử B. subtilis tái tổ hợp khi lưu trữ và phối trộn thức ăn.
Thử nghiệm sinh học in vivo - Phối trộn thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng
- Đếm khuẩn lạc xác định số lượng bào tử trong ruột
- Thử thách gây nhiễm WSSV nhân tạo		 Đánh giá khả năng bám dính trong ruột tôm, mức độ kích thích miễn dịch (PO, SOD) và xác định tỷ lệ bảo hộ tôm khi cảm nhiễm WSSV.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở khoa học về virus WSSV, cấu trúc kháng nguyên vỏ và tiềm năng ứng dụng của bào tử B. subtilis:

  • Đặc điểm sinh học của WSSV: Cấu trúc virion hình que elip kích thước 240–380 nm × 70–159 nm; nucleocapsid kích thước 80 × 350 nm có cấu trúc phân mảnh dạng vòng xếp chồng. Vỏ virus cấu tạo bởi ít nhất 35 loại protein, trong đó phức hợp gồm VP28, VP26, VP24 và VP19 chiếm ưu thế. Hệ gen DNA sợi đôi dạng vòng chứa khoảng 300 kb với các vùng lặp lại đặc trưng.
  • Bệnh lý và chẩn đoán: Bệnh đốm trắng xuất hiện trên nhiều đối tượng giáp xác (họ tôm he, tôm càng, cua, ghẹ, tôm hùm). Dấu hiệu đặc trưng là các đốm trắng đường kính 0,5–2,0 mm dưới vỏ giáp đầu ngực. Các phương pháp phát hiện gồm mô bệnh học, que thử nhanh miễn dịch, phản ứng chuỗi polymerase đơn (PCR), Nested PCR (Lo et al., 1996) và Real-time PCR.
  • Kháng nguyên VP28 và đáp ứng miễn dịch: VP28 (204 acid amin, cấu trúc không gian dạng trimer gồm 9 dải nếp gấp β và 1 chuỗi xoắn α) chứa các vị trí quyết định kháng nguyên tại các đoạn acid amin 28–67, 87–93 và 171–204. Miễn dịch dịch thể của tôm thể hiện qua dòng thác hoạt hóa enzyme proPO thành PO để tạo melanin và enzyme SOD để xử lý các gốc tự do O₂•⁻ sinh ra từ quá trình thực bào.
  • Hệ thống biểu hiện bề mặt bào tử vi khuẩn: Trình bày chi tiết đặc điểm sinh nội bào tử của B. subtilis, cấu trúc phân tầng của vỏ bào tử và nguyên lý gắn protein ngoại lai dung hợp với đầu C hoặc đầu N của protein lớp áo CotB.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết các nguyên vật liệu, chủng vi sinh vật, động vật thực nghiệm và quy trình thực hiện:

  • Vật liệu nghiên cứu: Mẫu tôm nhiễm WSSV thu thập từ các đầm nuôi tôm tại Việt Nam; chủng vi khuẩn E. coli DH5α dùng để nhân dòng, E. coli BL21(DE3) dùng để biểu hiện protein; chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 dạng dại; các plasmid pGEM-T, pET28b, pDG364, pDG364-cotB và pDG364-cotB-gst.
  • Hóa chất, môi trường: Môi trường Luria-Bertani (LB), môi trường sinh bào tử Difco Sporulation Medium (DSM), kháng sinh ampicillin, kanamycin, chloramphenicol; các enzyme giới hạn EcoRI, HindIII, NdeI, XhoI, T4 DNA ligase; cơ chất enzyme NBT, BCIP, L-DOPA.
  • Quy trình thực nghiệm: Trình bày chi tiết thành phần phản ứng PCR nhân bản gen vp28, phản ứng Real-time PCR định lượng tải lượng WSSV; quy trình biến nạp plasmid tích hợp vào hệ gen B. subtilis qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng tại locus amyE; phương pháp thu nhận, tinh sạch bào tử bằng ly tâm và xử lý lysozyme; các kỹ thuật kiểm tra biểu hiện (SDS-PAGE, Western blot sử dụng kháng thể kháng His-tag và kháng VP28, hiển vi huỳnh quang với kháng thể thứ cấp gắn FITC); quy trình đo hoạt độ enzyme PO (đo mật độ quang OD₄₉₀ nm) và SOD (đo ức chế khử NBT ở OD₅₆₀ nm); quy trình bố trí lô thí nghiệm cho tôm ăn thức ăn trộn bào tử và quy trình gây nhiễm nhân tạo WSSV theo nồng độ xác định.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận được bố cục theo ba nội dung khoa học chính:

1. Nhân dòng, xác định trình tự và một số đặc trưng của gen vp28 từ các mẫu WSSV thu nhận ở Việt Nam

  • Đoạn gen vp28 kích thước khoảng 615 bp được nhân bản thành công từ DNA tổng số của các mẫu tôm nhiễm bệnh bằng kỹ thuật PCR và nhân dòng vào vector pGEM-T.
  • Kết quả giải trình tự và so sánh với trình tự tham chiếu của chủng WSSV Việt Nam công bố trước đây (GenBank Accession: AY168644) đã phát hiện 5 vị trí sai khác nucleotide gồm: A125G, A183G, A226G, A403G và T517C. Trong đó, 4 đột biến làm thay đổi acid amin tương ứng trên chuỗi polypeptide của VP28.
Vị trí nucleotide Nucleotide tham chiếu (AY168644) Nucleotide đột biến (Luận án) Vị trí acid amin Acid amin chuẩn Acid amin biến đổi
125 A G 42 Asp (D) Gly (G)
183 A G 61 Met (M) Val (V)
226 A G 76 Asn (N) Ser (S)
403 A G 135 Ile (I) Val (V)
517 T C 173 Phe (F) Phe (F) (đột biến đồng nghĩa)

2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên VP28

  • Biểu hiện trong E. coli: Gen vp28 được biểu hiện thành công trong E. coli BL21(DE3) sử dụng vector pET28b dưới dạng protein dung hợp có gắn đuôi His-tag, khối lượng phân tử khoảng 28 kDa, được tinh sạch qua cột ái lực Ni-NTA agarose để làm kháng nguyên đối chứng và kiểm tra tính đặc hiệu miễn dịch.
  • Biểu hiện trên bề mặt bào tử B. subtilis: Tạo thành công hai cấu trúc dung hợp là CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 trong vector tích hợp pDG364, đưa vào thể nhiễm sắc của B. subtilis PY79. Sự hiện diện của protein dung hợp trên bề mặt bào tử được xác nhận bằng SDS-PAGE, Western blot và quan sát tín hiệu phát huỳnh quang trên kính hiển vi huỳnh quang khi sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng VP28. Cấu trúc có gắn đoạn protein trung gian GST (Glutathione S-Transferase) cho hiệu quả bộc lộ kháng nguyên tốt hơn do hạn chế được cản trở không gian.
  • Khảo sát điều kiện sinh bào tử và độ bền: Môi trường DSM cho hiệu suất tạo bào tử tái tổ hợp đạt trên 90% sau 48–72 giờ nuôi cấy. Bào tử tái tổ hợp thể hiện tính bền vững cao: chịu được xử lý nhiệt ở 80°C trong 30 phút, chịu được nồng độ muối NaCl lên tới 10–15% và bền vững trong dải pH rộng từ 3,0 đến 9,0. Bào tử phối trộn vào thức ăn tôm giữ nguyên tỷ lệ sống trên 95% sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng.

3. Khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28

  • Động thái tồn tại trong đường ruột: Khi cho tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn trộn bào tử với liều lượng 10⁸ CFU/g thức ăn, bào tử B. subtilis bám dính và duy trì mật độ ổn định trong ruột tôm trong suốt thời gian cho ăn và giảm dần sau khi ngừng sử dụng.
  • Kích thích đáp ứng miễn dịch: Hoạt độ enzyme phenoloxidase (PO) trong dịch chiết cơ tim và enzyme superoxide dismutase (SOD) trong mô cơ của nhóm tôm ăn bào tử tái tổ hợp CotB-GST-VP28 tăng cao rõ rệt (PO tăng từ 1,8 đến 2,5 lần; SOD tăng từ 1,5 đến 2,0 lần) so với nhóm đối chứng ăn thức ăn thường hoặc thức ăn trộn bào tử dạng dại PY79.
  • Đánh giá hiệu quả bảo vệ khi cảm nhiễm WSSV: Bằng kỹ thuật Real-time PCR với phương trình đường chuẩn có hiệu suất phản ứng E = 97,8%, nồng độ virus gây nhiễm thực nghiệm được chuẩn hóa. Kết quả thử nghiệm thử thách cho thấy, ở lô đối chứng (không ăn bào tử hoặc ăn bào tử hoang dại), tôm chết tích lũy 100% sau 7–10 ngày cảm nhiễm WSSV. Trong khi đó, lô tôm được cho ăn bào tử B. subtilis CotB-GST-VP28 liên tục trong 14 ngày trước khi gây nhiễm đạt tỷ lệ sống sót bảo hộ trên 70%.

Kết quả và những đóng góp mới

  1. Đóng góp về mặt khoa học và lý luận:

    • Xác định được đặc điểm trình tự gen vp28 từ các chủng WSSV lưu hành tại Việt Nam; phát hiện 5 sai khác nucleotide (A125G, A183G, A226G, A403G, T517C), trong đó có 4 đột biến làm thay đổi acid amin (Asp42Gly, Met61Val, Asn76Ser, Ile135Val) so với trình tự chuẩn AY168644.
    • Chứng minh được tính khả thi của việc biểu hiện kháng nguyên vỏ VP28 dạng dung hợp (CotB-VP28 và CotB-GST-VP28) trên bề mặt bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis, khẳng định vai trò của protein đệm GST trong việc hỗ trợ bộc lộ kháng nguyên bề mặt mà không làm mất đi các đặc tính sinh học của bào tử.
    • Cung cấp dẫn liệu khoa học về sự gia tăng hoạt độ các enzyme miễn dịch PO và SOD ở giáp xác khi tiếp nhận kháng nguyên VP28 trình diện trên bề mặt bào tử qua đường tiêu hóa.

  2. Đóng góp về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất:

    • Thiết lập thành công quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp mang kháng nguyên VP28 có khả năng bền nhiệt, chịu mặn và chịu acid, phù hợp với điều kiện chế biến và bảo quản thức ăn thủy sản.
    • Đề xuất giải pháp vaccine đường uống dùng trong phòng bệnh đốm trắng cho tôm thẻ chân trắng với tỷ lệ bảo hộ thực nghiệm đạt trên 70%, mở ra hướng sản xuất các chế phẩm phòng dịch sinh học an toàn thay thế cho việc tiêm kháng nguyên đơn lẻ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của luận án: Các thử nghiệm đánh giá hiệu lực bảo hộ của chế phẩm bào tử tái tổ hợp mới chỉ được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm và trong các bể nuôi thực nghiệm có kiểm soát chặt chẽ các chỉ tiêu môi trường; chưa triển khai thử nghiệm diện rộng tại các ao đầm nuôi bán thâm canh hoặc thâm canh ngoài thực địa nơi có nhiều yếu tố dao động sinh thái. Ngoài ra, cơ chế phân tử chi tiết của đáp ứng gần như miễn dịch (quasi-immune response) ở tôm sau khi ăn bào tử mang VP28 chưa được làm sáng tỏ toàn diện.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Tiến hành thử nghiệm pilot chế phẩm bào tử CotB-GST-VP28 ở quy mô ao nuôi thực tế; nghiên cứu biểu hiện phối hợp nhiều kháng nguyên vỏ (như đồng biểu hiện VP28 kết hợp VP26 hoặc VP19) trên cùng một bề mặt bào tử để gia tăng phổ kích thích miễn dịch; ứng dụng hệ thống vector biểu hiện bề mặt bào tử B. subtilis để phát triển các loại vaccine đường uống phòng ngừa các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn và virus khác trên động vật thủy sản.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị đối với nhiều đối tượng trong nghiên cứu và đào tạo:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Chuyên ngành Hóa sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học và Bệnh học thủy sản có thể tham khảo thiết kế vector tích hợp hệ gen vi khuẩn, kỹ thuật hiển thị bề mặt bào tử (spore surface display) và các phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu: Có thể khai thác các quy trình thực nghiệm chuẩn về nhân dòng gen virus, quy trình đánh giá hoạt độ enzyme oxy hóa khử (PO, SOD) trên giáp xác và kỹ thuật chuẩn hóa liều gây nhiễm WSSV bằng Real-time PCR.
  • Cán bộ kỹ thuật và chuyên gia nuôi trồng thủy sản: Tham khảo dữ liệu về độ bền lý hóa của bào tử B. subtilis để nghiên cứu quy trình phối trộn phụ gia sinh học, hướng tới sản xuất thức ăn chức năng phòng bệnh cho tôm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lựa chọn protein VP28 của WSSV làm đích biểu hiện kháng nguyên?
VP28 là protein cấu trúc chính nằm ở lớp vỏ ngoài của WSSV, chiếm tỷ lệ lớn cùng với VP19. Protein này giữ vai trò then chốt trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm thông qua việc gắn bám đặc hiệu vào các thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ tôm (như PmRab7). Việc kích thích cơ thể tôm nhận diện kháng nguyên VP28 sẽ giúp ngăn chặn sự gắn bám và dung hợp màng của virus, làm giảm khả năng xâm nhập gây bệnh.

2. Việc bổ sung đoạn protein GST vào giữa CotB và VP28 có tác dụng gì?
Đoạn protein GST (Glutathione S-Transferase) đóng vai trò là một chuỗi liên kết (spacer/linker) có cấu trúc không gian phù hợp. Sự hiện diện của GST giúp kéo dài khoảng cách giữa protein chuyên chở CotB (nằm sâu trong lớp áo bào tử) và kháng nguyên VP28, hạn chế hiện tượng cản trở không gian, giúp VP28 bộc lộ ra phía ngoài bề mặt bào tử một cách tự nhiên để các tế bào miễn dịch đường ruột của tôm dễ dàng nhận diện.

3. Trình tự gen vp28 phân lập tại Việt Nam trong luận án có những đột biến nào so với chuỗi tham chiếu AY168644?
Luận án phát hiện 5 vị trí sai khác nucleotide gồm: A125G, A183G, A226G, A403G và T517C. Trong đó có 4 đột biến làm thay đổi acid amin tương ứng: Asp42Gly, Met61Val, Asn76Ser và Ile135Val; riêng đột biến T517C là đột biến đồng nghĩa, không làm thay đổi acid amin phenylalanine ở vị trí 173.

4. Khả năng bảo hộ tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợp được đánh giá qua những chỉ tiêu sinh học nào?
Khả năng bảo hộ được đánh giá thông qua: (1) Sự bám dính và tồn tại của vi khuẩn trong ruột tôm; (2) Mức độ gia tăng hoạt độ của hai enzyme liên quan đến miễn dịch bẩm sinh là phenoloxidase (PO) trong dịch cơ tim và superoxide dismutase (SOD) trong mô thịt; (3) Tỷ lệ sống sót tích lũy của tôm sau khi gây nhiễm thực nghiệm bằng dịch virus WSSV định lượng bằng Real-time PCR, với tỷ lệ bảo hộ đạt trên 70%.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Phạm Kiên Cường đã nhân dòng, xác định trình tự gen vp28 từ các mẫu WSSV tại Việt Nam và phát hiện 5 sai khác nucleotide đặc trưng. Đề tài đã thiết kế thành công chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 tái tổ hợp mang các cấu trúc CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, hiển thị hiệu quả kháng nguyên VP28 trên bề mặt bào tử với độ bền nhiệt, bền mặn và bền pH cao. Bào tử tái tổ hợp khi phối trộn vào thức ăn cho tôm thẻ chân trắng đã kích thích gia tăng hoạt độ các enzyme miễn dịch PO, SOD và mang lại tỷ lệ bảo hộ trên 70% trước thử thách gây nhiễm WSSV, khẳng định tiềm năng ứng dụng làm chế phẩm sinh học phòng bệnh đốm trắng trong nuôi trồng thủy sản.