MỞ ĐẦU Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Không những thế vật liệu cellulose và hemicellulose còn là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp và nhiều ngành nghề khác. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người.
Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn. Ngày nay để thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường, các nhà khoa học đang hướng đến đó là sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose. Hệ enzym này có thể được thiết kế bằng cách tổ hợp các loại enzym trong hệ enzym thủy phân lignocellulose từ các nguồn vi sinh vật khác nhau hoặc khai thác từ một chủng vi sinh vật nhưng có hệ enzym phong phú có khả năng thủy phân hiệu quả lignocellulose. Mối đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và khoáng hóa các polymer sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác.
Hệ vi sinh vật trong ruột mối có ý nghĩa quyết định trong quá trình phân giải cellulose. Có rất nhiều vi khuẩn phân giải cellulose đã được phân lập và đã được định tên từ nhiều loài mối khác nhau. Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả. Tuy nhiên, việc phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose với mục đích khai thác chủng vi sinh vật phân lập từ ruột mối trong phân giải lignocellulose cũng như khai thác hệ gen của chúng chưa được nghiên cứu.
Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam” Với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thông qua giải trình và phân tích hệ gen vi khuẩn để đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu cellulose của vi khuẩn ruột mối. 1 Mục tiêu của đề tài - Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam - Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam 2.
Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối (2) Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối (3) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn (4) Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính CMCase của chế phẩm (5) Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn (6) Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối Việt Nam. (2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ ruột mối (3) Lần đầu tiên giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối Cellulosimicrobium cellulans và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng. (4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột mối trên lignocellulose của rơm Ý nghĩa thực tiễn (1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải lignocellulose của vi khuẩn ruột mối (2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này.
2 cùng là glucose. Để phân hủy được cellulose, trước hết bề mặt cũng như các phần cấu trúc của cellulose cần phải được nới lỏng giúp các enzym có thể xâm nhập và tiếp xúc trực tiếp với các sợi cellulose ở bên trong. Một khi các cellulase xâm nhập vào được mạng lưới cellulose sẽ từng bước tiến hành phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là D-glucose. Sự thủy phân hoàn toàn cellulose thành sản phẩm cuối cùng glucose cần có hoạt động kết hợp của ít nhất 3 loại enzym endoglucanase (EC 3.74) và β-glucosidase (EC3.10 Hoạt động của các enzym cellulose [51]] Sản phẩm phức hợp nhiều enzym hay thiết kế cellulosome là một trong những phương pháp được nghiên cứu gần đây để tối ưu hóa quá trình thủy phân sinh khối.
Thiết kế cellulosome bao gồm các vật liệu với CBM và rất nhiều các modul kết dính từ các hệ cellulase khác nhau được sinh tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật. Các enzym từ các nguồn khác nhau được kết dính với nhau và thường được liên kết với một giá thể để tạo ra một phức hợp đa chức năng có kích thước lớn, gọi là cellulosome. Phức hợp cellulosome được cấu tạo bởi sự tương tác không cộng hóa trị và các liên kết đặc biệt, có ái lực cao giữa các mô-đun gắn kết. Trong trường hợp này, CBM liên kết với các thành phần trong cellulosome [50].
So với các hệ thống enzym đơn chức năng, phức hợp cellulosome thể hiện sức mạnh tổng hợp giữa các phân tử một cách chặt chẽ. Khi đưa các đơn vị cấu thành xúc tác có chức năng bất định vào liên kết vật lý chặt chẽ với nhau, hai enzym 23 có thể được coi là riêng biệt và có sức mạnh tổng hợp giữa các phân tử. Cả hệ thống enzym đơn chức năng và hệ thống cellulosome đều sử dụng các enzym họ celulase và hemicellulase. Sự tương tác tương hỗ giữa các enzym tạo nên một hệ phức lớn xúc tác linh hoạt,bổ sung lẫn nhau làm tăng hiệu quả quá trình thủy phân [50].
Mô hình mới thứ ba có thể được xem là trung gian giữa mô hình các enzym đơn chức năng và các enzym tổng hợp cao, đó là các enzym đa chức năng. Enzym đa chức năng là sản phẩm sinh tổng hợp từ một vi sinh vật nào đó, bao gồm hai hoặc nhiều enzym có mặt và cùng hoạt động xúc tác. Các enzym này thường bao gồm khối lượng phân tử cao và có một hoặc một số CBM. Trong tự nhiên, các enzym đa chức năng tồn tại trong cả hệ thống enzym đơn chức năng và hệ thống mô tế bào.
Việc phân loại các enzym đa chức năng dựa trên các đặc tính cơ chất và do đó có thể được nhóm thành một trong bốn lớp khác nhau: cellulase –– cellulase, cellulase – hemicellulase, hemicellulase – hemicellulase, và hệ thống hemicellulase – carbohydrate esterase [53]. Ứng dụng cellulase Cellulase được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như trong sản xuất thức ăn gia súc, trong sản xuất thực phẩm và đồ uống, trong dệt may, trong sản xuất giấy và đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu cồn sinh học [54]. Trong sản xuất bia, rượu và các loại đồ uống lên men từ ngũ cốc, cellulase chủ yếu hỗ trợ quá trình phân giải celluloase làm tăng hiệu quả quá trình lọc dịch đường sau thủy phân hoặc làm trong dịch lên men, giảm độ nhớt v.v…Các quá trình này chủ yếu sử dụng các cellulase dưới dạng các thương phẩm [55]. Trong chế biến thức ăn gia súc cellulase phân hủy chất xơ có trong nguyên liệu nhằm tăng giá trị chuyển hóa của thức ăn đối với động vật [56][57].
Trong công nghiệp dệt may cellulase được sử dụng với mục đích làm mềm, mịn, sạch và ổn định màu sắc của vải, trong các công đoạn của quá trình sản xuất endoglucanse được bổ sung để loại bỏ các sợi xơ ngắn trên bề mặt vải và các bụi bẩn trong mạng lưới vi sợi. Ngoài ra, trong sản xuất quần jean cellulase còn được sử dụng để tạo ra các vêt xước, rách “stonewashing” theo ý muốn mà không gây tổn hại đến vải, với cách này đã thay thế được [56]. Nhiên liệu sinh học là nguồn nguyên liệu thay thế các nguyên liệu hóa thạch quan trọng, ngày nay nhiều quốc gia đang tìm cách để giảm sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch. Một trong những bước quan trọng trong sản xuất nhiên liệu sinh học là chuyển hóa lignocelluloses thành đường có thể lên men.
Hiệu quả của quá trình này phụ thuộc vào mức độ phân giải hiệu quả của hệ enzym phân giải lignocellulose [58]. 24 Sinh khối Lignocellulose là nguồn năng lượng tái tạo với trữ lượng lớn trên trái đất. Tuy nhiêu quy trình sản xuất ethanol sinh học từ sinh khối phức tạp hơn nhiều so với việc sản xuất ethanol từ tinh bột hay từ đường. Để giảm được chi phí cho quá trình này cần có nguyên liệu thô chi phí thấp, hệ enzym hiệu quả và các phương pháp tiền xử lý.
Sinh khối cellulose là nguyên liệu có giá thành thấp, có thể tận dụng từ các phụ phẩm của các ngành khác và có thể tái tạo. Những vật liệu này bao gồm dăm gỗ, rơm rạ, bã mía, cây trồng, cỏ, lõi ngô v.v…Trong quá trình thủy phân đường đơn được tạo ra nhờ sự chyển hóa của hệ enzym cellulase và hemicellulase [24] Quá trình thủy phân các bã thải nông nghiệp: bã mía, lõi ngô,.bằng enzym được nghiên cứu rộng rãi tùy thuộc vào mục đích và khả năng ứng dụng của các sản phẩm thu được sau khi thủy phân. De Guilherme và cs (2017) đã sử dụng một nhóm các enzym: phức hợp cellulase với β-glucosidase, phức hợp (arabinase, β-glucanase, cellulases, hemicellulases, pectinase, xylanase), β-glucosidase và xylanase để thủy phân bã mía được tiền xử lý bằng acid kết hợp với kiềm để tăng cường sản xuất glucose và xylose. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng quá trình kết hợp tiền xử lý này làm tăng lượng cellulose lên 68,3%, giảm 16,2% lượng hemicellulose do quá trình tiền xử lý trước bằng acid làm một lượng hemicellulose bị hòa tan.
Lượng lignin trong sinh khối giảm 10,9% [59]. Sự kết hợp các enzym khác nhau để thủy phân làm tăng hiệu suất chuyển hóa bã mía thành đường, cải thiện nồng độ cuối cùng của glucose và xylose trong môi trường lên men.