Đặt vấn đề Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) là loại cây thân thảo đƣợc biết đến với giá trị dƣợc liệu cao. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Thổ nhân sâm cho thấy, trong lá và rễ có rất nhiều các hợp chất có hoạt tính dƣợc học khác nhau nhƣ: alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, phytosterol, phytol; trong đó các phytol chiếm t lệ cao (69,32 %). Từ lâu, Thổ nhân sâm đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền, đặc biệt là trong điều trị bệnh tiểu đƣờng type 2, viêm da, rối loạn tiêu hóa, yếu sinh lý và rối loạn sinh sản. Galactogue trong lá có tác dụng chống viêm, kích thích tăng tiết sữa ở phụ nữ cho con bú và có khả năng chữa bệnh viêm loét.
Rễ của cây Thổ nhân sâm đƣợc sử dụng để thúc đẩy khả năng sinh sản và chữa các bệnh phụ khoa nhƣ bất thƣờng trong chu kỳ kinh nguyệt. Steroid saponin trong rễ cây Thổ nhân sâm có tác dụng phòng và chữa bệnh xơ vỡ động mạch, đồng thời còn là nguyên liệu để tổng hợp nên hormone sinh dục. Flavonoid là một hợp chất có vai trò quan trọng đối với con ngƣời nhƣ có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thƣ… Tuy nhiên, chƣa thấy nghiên cứu về thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm vì hàm lƣợng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum, trong đó có cây Thổ nhân sâm rất thấp. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để nâng cao hàm lƣợng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum nói chung và cây Thổ nhân sâm (T.
paniculatum) nói riêng để có thể sử dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Cho đến nay, đã có một số cách tiếp cận chủ yếu đƣợc áp dụng đối với cây dƣợc liệu để làm tăng hàm lƣợng flavonoid. Đó là sử dụng phƣơng pháp chọn lọc từ quần thể hoặc lai hữu tính hay đột biến thực nghiệm, từ đó chọn lọc các dòng cây có hàm lƣợng flavonoid cao. Tuy nhiên, đối với cây Thổ nhân sâm chƣa thấy công bố nào về ứng dụng phƣơng pháp này để nâng cao hàm lƣợng flavonoid; nhƣng việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nhƣ chuyển gen và nuôi cấy mô tế bào thực vật ở cây dƣợc liệu đã đƣợc quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong thu nhận các dƣợc chất, trong đó có flavonoid.
LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 Ở thực vật, flavonoid đƣợc tổng hợp qua đƣờng phenylpropanoid, chuyển phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA và sau đó 4-coumaroyl-CoA sẽ đi vào quá trình tổng hợp flavonoid. Có rất nhiều các enzyme tham gia vào con đƣờng tổng hợp flavonoid nhƣ phenylalanine ammonia-lyase, cinnamate 4-hydroxylase, 4- Coumarate CoA ligase, chalcone synthase, chalcone isomerase… Trong đó, chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid bằng việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở đƣợc đóng vòng để hình thành các naringenin. Sau đó, hợp chất này sẽ đƣợc chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid chính nhƣ flavanone, flavonol và anthocyanin. Do vậy, biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CHI sẽ làm tăng hoạt độ của enzyme chìa khóa CHI và hàm lƣợng các loại flavonoid trong cây chuyển gen sẽ đƣợc cải thiện.
Ngoài ra, Thổ nhân sâm là loài cây có rễ củ, nhiều hợp chất thứ cấp đƣợc tập trung ở rễ, trong đó có flavonoid. Do vậy, để tăng thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm, cách tiếp cận ứng dụng k thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật bằng phƣơng pháp cảm ứng tạo rễ tơ nhằm tăng sinh khối cũng đƣợc quan tâm nghiên cứu. Khi mô thực vật (lá, đoạn thân, lá mầm.) bị lây nhiễm Agrobacterium rhizogenes thì T-DNA trong cấu trúc Ri-plasmid mang các gen rol và các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin loại IAA sẽ đƣợc chuyển vào mô thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của các gen rol và các gen tổng hợp auxin sẽ tạo nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật đƣợc lây nhiễm A.
Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc dòng cây chuyển gen GmCHI có hàm lƣợng flavonoid cao hơn cây đối chứng không chuyển gen và xác định đƣợc điều kiện thích hợp trong cảm ứng tạo rễ tơ in vitro ở cây Thổ nhân sâm. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nội dung nghiên cứu (i) Nghiên cứu định danh các mẫu Thổ nhân sâm thu tại một số địa phƣơng bằng phƣơng pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA.
Đặc điểm hình thái của các mẫu Thổ nhân sâm thu từ các địa phƣơng đƣợc quan sát trực tiếp và mô tả đặc điểm rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt. Sử dụng mã vạch DNA (trình tự vùng ITS; đoạn gen matK, rpoB, rpoC1) để định danh các mẫu Thổ nhân sâm thu thập đƣợc. (ii) Nghiên cứu chuyển gen GmCHI và tạo dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen. Nghiên cứu điều kiện thích hợp trong khử trùng hạt ở cây Thổ nhân sâm.
Khảo sát ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến sự tái sinh đa chồi, ra rễ in vitro ở cây Thổ nhân sâm; Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm thông qua nách lá mầm và tạo các dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen. Phân tích sự hợp nhất và sự biểu hiện của gen chuyển GmCHI ở cây Thổ nhân sâm chuyển gen; Phân tích, so sánh hàm lƣợng flavonoid tổng số trong các dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen và cây không chuyển gen. (iii) Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm nhờ A. Khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm.
Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ A. rhizogenes, nồng độ AS, thời gian lây nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả tạo rễ tơ từ mô lá Thổ nhân sâm. Nghiên cứu xác định ngƣỡng diệt khuẩn của cefotaxime đối với A. rhizogenes; Phân tích dòng rễ tơ mang gen rolC bằng kĩ thuật PCR.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sự tăng trƣởng rễ tơ Thổ nhân sâm. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ định danh các mẫu Thổ nhân sâm thu thập ở một số địa phƣơng tạo nguồn vật liệu ban đầu để nuôi cấy in vitro đến chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm và phân tích sự biểu hiện của gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tƣơng ở cây Thổ nhân sâm chuyển gen. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 Cụ thể là: 1) Năm mẫu Thổ nhân sâm thu tại các địa phƣơng ở Việt Nam thuộc một loài T. paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) đƣợc định danh bằng sự kết hợp giữa phƣơng pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA.
2) Lần đầu tiên biểu hiện thành công gen GmCHI có nguồn gốc từ cây đậu tƣơng ở cây Thổ nhân sâm và tạo đƣợc 2 dòng Thổ nhân sâm chuyển gen có hàm lƣợng flavonoid cao hơn các cây đối chứng không chuyển gen. 3) Tạo đƣợc 5 dòng rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm làm vật liệu phục vụ chọn dòng rễ tơ có hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Kết quả đạt đƣợc của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong cách tiếp cận cải thiện hàm lƣợng flavonoid bằng k thuật chuyển gen mã hóa enzyme chìa khóa của quá trình tổng hợp flavonoid và tạo dòng rễ tơ in vitro ở cây Thổ nhân sâm. Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ là cơ sở ứng dụng k thuật tạo dòng rễ tơ và chuyển gen vào việc nâng cao hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học ở cây Thổ nhân sâm và một số loại cây dƣợc liệu khác.
Kết quả nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho giải pháp nâng cao hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thực vật. Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học, công nghệ quốc tế và quốc gia cùng với các trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tƣ liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. Về mặt thực tiễn Các dòng rễ tơ và dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen làm vật liệu cho chọn giống Thổ nhân sâm có hàm lƣợng flavonoid cao. Kết quả của nghiên cứu đã mở ra triển vọng ứng dụng k thuật tạo dòng rễ tơ và k thuật biểu hiện gen vào việc nâng cao hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây dƣợc liệu.
LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM 1. Cây Thổ nhân sâm 1.
Phân loại và đặc điểm sinh học của cây Thổ nhân sâm Theo Đỗ Tất Lợi (2004), cây Thổ nhân sâm (T. paniculatum) thuộc chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae), bộ Cẩm chƣớng (Caryophyllales), phân lớp Cẩm chƣớng (Caryophyllidae), lớp hai lá mầm (Magnoliopsida) [3. Thổ nhân sâm là loại cây cỏ mọc hằng năm, thân màu xanh, mọc thẳng, có thể cao tới 0,6 m, phía dƣới chia cành. Lá mọc so le, hình trứng ngƣợc, hoặc hình thìa, phiến lá dày, hơi thẫm, hai mặt đều bóng, đầu lá nhọn hoặc tù, phía cuống hẹp lại, cuống rất ngắn, lá dài 5-7 cm, rộng 2,5-3,5 cm.
Vào mùa hạ ở đầu cành xuất hiện cụm hoa hình chùm nhiều hoa nhỏ, đƣờng kính 6 mm, 5 cánh hoa màu tím nhạt, hơn 10 nhị dài 2 mm. Bầu hoa hình cầu. Quả nhỏ, khi chín có màu xám tro, đƣờng kính ƣớc 3mm. Hạt rất nhỏ, màu đen nhánh hơi dẹt, trên mặt hơi có vân nổi.
Mùa ra hoa vào tháng 6-7-8, mùa quả vào tháng 9-10-11. Rễ củ hình trụ mang nhiều rễ con, bề ngoài màu nâu đen. Lúc mới đƣợc thu hoạch, bên trong củ màu trắng, phơi khô sẽ chuyển thành màu đen, hình dáng củ gần giống với củ Nhân sâm. Cây Thổ nhân sâm mọc hoang và đƣợc trồng nhiều nơi trong nƣớc ta vì nhiều ngƣời nhầm là cây Nhân sâm.
Tuy nhiên, giữa cây Thổ nhân sâm và cây Nhân sâm khác nhau về hình thái cũng nhƣ về họ thực vật. Ở một số tỉnh của Trung Quốc nhƣ Triết Giang, Giang Tô, An Huy., cây Thổ nhân sâm cũng mọc hoang và đƣợc trồng làm cảnh, ngƣời ta gọi cây này với những tên Cao ly sâm, Thổ cao ly sâm… và cũng dùng nó làm thuốc bổ thay sâm [3]. Cây mọc rất khỏe, có thể trồng bằng hạt hoặc bằng một mẩu thân rễ. Cây phát triển nhanh, sau một năm có thể thu hoạch, để lâu năm thân rễ sẽ to hơn.