ĐẶT VẤN ĐỀ Các hoạt động nông nghiệp trong thế kỷ 20 đã đƣợc thực hiện rất nhiều bằng cách sử dụng thiết bị nông nghiệp, giống cây trồng năng suất cao, làm đất thâm canh, tƣới tiêu, phân bón, thuốc trừ sâu và các đầu vào sản xuất khác. Những ứng dụng này có thể ảnh hƣởng tiêu cực đến chất lƣợng của đất và góp phần gây ô nhiễm môi trƣờng. Để giảm thiểu những tác động tiêu cực này do các kỹ thuật canh tác thông thƣờng gây ra, việc cấy vi sinh vật nhƣ phân bón sinh học đang đƣợc chú ý nhiều hơn. Một liên kết cộng sinh đƣợc hình thành giữa vi sinh vật và thực vật, hữu ích cho cả hai.
Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật liên kết với thực vật, sống trong các mô sống của cây chủ mà không gây ra bất kỳ tác hại nào cho cây chủ (Ahmed et al., 2012; Hallmann et al. Các vi sinh vật nội sinh phổ biến bao gồm các loài nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn, có thể đƣợc phân lập từ các cây trồng nông nghiệp hay cây cỏ hoang dại, từ cây một lá mầm và cây hai lá mầm. Một số vi khuẩn nội sinh có khả năng thúc đẩy tăng trƣởng thực vật và kiểm soát sinh học với các tác nhân gây bệnh. Khả năng thúc đẩy tăng trƣởng thực vật có thể thông qua việc cung cấp các chất dinh dƣỡng cho cây, điều hòa các phytohormone, hay làm tăng tính khả dụng của các nguyên tố khoáng.
Vi khuẩn nội sinh sở hữu khả năng quan trọng để hòa tan phosphate không hòa tan và cung cấp nitơ cho cây chủ. Bên cạnh đó, vi khuẩn nội sinh có khả năng ức chế sinh học với các loại nấm, vi khuẩn và tuyến trùng gây bệnh trên thực vật. Do đó, khi cƣ trú trong mô thực vật, vi sinh vật nội sinh đem lại cho cây trồng nhiều điều kiện thuận lợi giúp cây trồng phát triển tốt (Dhanya và Padmavathy, 2014). Các loài cây ăn quả, có múi thuộc chi Citrus (họ Rutaceae, Aurantioideae Citrus) là cây ăn quả chính, đƣợc sử dụng nhiều nhất ở Việt Nam và trên thế giới.
Các loài cây thuộc chi Citrus đều là cây dƣợc liệu giá trị: quả có thịt quả chứa nhiều thành phần dinh dƣỡng nhƣ carbohidrate, beta carotene, vitamin, chất khoáng; vỏ quả, lá và hoa chứa nhiều tinh dầu, pectin, các hợp chất thuộc nhóm flavonoid nhƣ naringin, hesperidin,. Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng 1 các biện pháp canh tác, chăm sóc nhằm nâng cao năng suất thu hoạch của các loài cây thuộc chi Citrus luôn đƣợc quan tâm. Bên cạnh đó, sự sinh trƣởng của cây Citrus có thể bị kìm hãm bởi các loại bệnh do nấm gây ra, phổ biến là bệnh vàng lá thối rễ do nấm Fusarium sp., bệnh mốc xanh do nấm Alternaria sp. Bệnh do nấm gây ra thƣờng rất khó phòng trừ vì nấm có khả năng tồn tại lâu trong đất.
Hiện nay, hƣớng ứng dụng vi sinh vật nội sinh vừa có khả năng sinh chất kích thích sinh trƣởng thực vật, vừa có khả năng kháng nấm trong nông- lâm nghiệp rất đƣợc quan tâm nghiên cứu. Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn và xác định ảnh hƣởng của chủng vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của một số loài cây thuộc chi Citrus”. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về vi sinh vật nội sinh 1.
Khái niệm vi sinh vật nội sinh Vi khuẩn nội sinh thực vật ("Endophytic bacteria") hiểu theo nghĩa đen là vi khuẩn cƣ trú bên trong cây ("endo" = bên trong; "phyton" = cây). Vi sinh vật nội sinh là vi khuẩn có lợi thực vật phát triển mạnh bên trong thực vật và có thể cải thiện sự phát triển của thực vật trong điều kiện bình thƣờng và khắc nghiệt. Vi sinh vật nội sinh có thể đƣợc truyền từ cây bố mẹ sang thế hệ cây con (hệ sợi nấm ăn sâu vào phôi của hạt cây mẹ) hoặc lan truyền trong quần thể cây chủ thông qua bào tử vi sinh vật nội sinh (Suryanarayana, 2013; Tadych et al. Vi khuẩn nội sinh thực vật hiện diện phổ biến trong hầu hết tất cả các loài thực vật, chúng sống tiềm ẩn hoặc tích cực xâm chiếm nội mô thực vật một cách cục bộ hoặc hệ thống (Hallmann et al.
Vi khuẩn nội sinh bắt nguồn từ các cộng đồng vi khuẩn biểu sinh vùng rễ và lá, cũng nhƣ từ hạt hoặc các vật liệu nhân giống vô tính. Sự phân bố của vi sinh vật nội sinh trong cơ thể thực vật Nhiều nghiên cứu cho rằng vùng rễ là nguồn vi khuẩn nội sinh chính, từ đó chúng xâm chiếm vào bên trong mô tế bào thực vật (Verma et al. Vì vậy, vi khuẩn nội sinh thƣờng đƣợc phát hiện ở rễ với mật độ cao ngay từ những giai đoạn đầu của sự phát triển (McInroy và Kloepper, 1995) [30]. Rễ đƣợc xem là vị trí ƣa thích nhất cho vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào cây, từ đó vi khuẩn tiếp tục xâm nhập vào bên trong cơ thể thực vật.
Vi khuẩn nội sinh xâm chiếm tế bào nội mô từ các vị trí nhƣ bề mặt rễ, lông hút, chóp rễ và điểm phát sinh rễ bên (Verma et al. Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào cây thông qua các khe hở tự nhiên nhƣ: khí khổng, thủy 3 khổng (hydathode) và các lỗ xốp nhỏ trên mô thực vật. Vi khuẩn nội sinh có thể di chuyển một cách hệ thống bên trong cây, do đó, về mặt lý thuyết có thể làm cân bằng mật độ vi khuẩn bên trong cây. Thông thƣờng vi khuẩn nội sinh thƣờng tập trung với mật độ thấp ở các bộ phận khí sinh, nguyên nhân có thể là điều kiện môi trƣờng ở các mô này ít thích hợp hơn cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh do sự biến động trong ngày lớn về nhiệt độ, hàm lƣợng nƣớc, dinh dƣỡng và tia UV.
Ngƣợc lại, hệ thống rễ dƣờng nhƣ tạo ra một môi trƣờng sống ổn định hơn, nơi mà nhiệt độ và hàm lƣợng nƣớc ổn định cho vi khuẩn cƣ trú (McInroy và Kloepper, 1995) [30]. Sau khi xâm nhập đƣợc vào bên trong cây chủ, vi khuẩn nội sinh sẽ cƣ trú ở các ổ nội sinh (endophytic niche). Các ổ nội sinh sẽ bảo vệ vi khuẩn nội sinh khỏi các tác động xấu từ môi trƣờng, đồng thời giúp chúng xâm chiếm và thiết lập bên trong tế bào, mô thực vật. Những vi khuẩn nội sinh thƣờng xâm chiếm khoảng gian bào và đƣợc phân lập từ tất cả các bộ phận của cây nhƣ rễ, thân, lá, quả và kể cả hạt (Oliveira et al.
Các vi sinh vật nội sinh có khả năng tăng cƣờng sức đề kháng và khả năng sống sót của cây chủ đối với các loại sâu bệnh, với các tác nhân liên quan đến nƣớc, nhiệt, đất nghèo dinh dƣỡng, muối và các động vật ăn cỏ (Pablo et al. Các vi sinh vật nội sinh có khả năng giúp cây chủ ngăn chặn các mầm bệnh hay các sinh vật ký sinh bằng cách cô lập chúng, cô lập mô bị xâm nhiễm và loại trừ thông qua cạnh tranh với các mầm bệnh hay các sinh vật sử dụng thực vật làm thức ăn (Kuldau el at. Một số nấm và vi khuẩn nội sinh đã đƣợc chứng minh là tăng cƣờng sự sinh trƣởng và cải thiện sức chống chịu ở thực vật (Pablo et al. Mật độ vi khuẩn nội sinh trong rễ thay đổi tùy theo từng loài cây chủ.
Với thực vật hai lá mầm, mật độ tối đa là 105 CFU/g rễ, trong khi thực vật một lá mầm có mật độ cao hơn đáng kể, 107 - 108CFU/g rễ (Dong et al. Tuy nhiên, nguyên nhân của hiện tƣợng này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ) [23]. Theo Dong và cs, 2003, việc nghiên cứu chủng vi khuẩn nội sinh nhiễm vào thực vật đã đƣa đến một số kết luận sau: (i) chỉ cần một vài tế bào cũng đủ 4 để vi khuẩn nội sinh xâm nhập đƣợc vào bên trong cây; (ii) chủng có khả năng xâm nhiễm tốt có thể xâm chiếm nội mô của nhiều loài thực vật khác nhau; (iii) các chủng liên quan gần có thể khác biệt rất lớn về khả năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật [23]. Vai trò của vi khuẩn nội sinh đối với thực vật 1.
Vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định nitơ Nitơ phân tử đƣợc cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng liên kết III bền vững N≡ N. Nitơ là yếu tố dinh dƣỡng hạn chế nhất cho sự phát triển của thực vật mặc dù trong khí quyển, chúng chiếm tới 78% thể tích không khí (Gupta et al. Tuy nhiên, chúng tồn tại dƣới dạng khí N2, thực vật không có khả năng đồng hóa trực tiếp đƣợc. Các vi sinh vật cố định đạm có khả năng hút đạm (N2) trong không khí và biến đổi đạm từ dạng cây trồng không hấp thụ đƣợc (N2) thành dạng đạm mà cây trồng hấp thụ đƣợc nhờ sự xúc tác của enzyme nitrogenase [7], [9].
Vi khuẩn cố định nitơ có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N2 và cung cấp một lƣợng nitơ đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà khoa học, các nhóm vi sinh vật cố định đạm (BNF- biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240 x 106 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lƣợng nitơ mà cả thế giới sản xuất bằng con đƣờng hóa học [13]. Vi khuẩn cố định nitơ là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N2 dồi dào trong không khí ( 79%) thành nitơ dạng ammone (NH4+) cung cấp cho cây [4], [5]. Vi khuẩn cố định Nitơ đƣợc chia thành 2 nhóm: nhóm vi khuẩn sống cộng sinh, nhóm vi khuẩn sống tự do [14].
Vi khuẩn nội sinh có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật Auxin là một chất kích thích sinh trƣởng có thể đƣợc tổng hợp bởi thực vật, trong đó IAA có vai trò trong qua trình phát triển tế bào nhƣ tăng trƣởng tế bào, phân chia, hình thành rễ (Ann và Broek, 1998). Tuy nhiên, sự tăng trƣởng 5 của thực vật lại chịu sự tác động không nhỏ từ nguồn auxin bên ngoài, đặc biệt là auxin đƣợc tổng hợp bởi các vi sinh vật có ích trong đất. Trong đó các vi sinh vật đƣợc phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cây trồng có khả năng tổng hợp IAA cao (Arshad và Frankenberger, 1998). Theo Loper và Schroth (1986) thì có đến 80% các chủng vi sinh vật đƣợc phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cây trồng có khả năng tổng hợp auxin [5].