Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ức chế proteinase thực vật đến chất lượng thịt

Tài liệu nghiên cứu Effects of some plant proteinase inhibitors on several bacteria influenced meat quality nghiên cứu, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Tran Thi Loan
• Người hướng dẫn: Prof. Dr of Sc. Pham Thi Tran Chau
• Trường học: Vietnam National University, Hanoi
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ức chế proteinase thực vật đến chất lượng thịt
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENT
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES
• 1. Major causes of food poisoning
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Antibacterial activity of MCoPIs-75 and CMPIs solution
• 2.2. Protein determination according to Lowry method
• 2.3. Method for obtaining extracellular protease from bacterial culturing
• 2.4. Proteolytic products determination
• 2.5. Proteolytic activity (PA) and proteinase inhibitory activity (PIA) by diffusion method
• 2.6. Evaluate freshness of piece meat samples by Ebe method
• 2.7. SDS-PAGE study of soluble protein from meat
• 2.8. Zymogram investigation of PA and PIA
• 2.9. Methods for evaluation of contaminated bacteria in local market meat
• 2.10. Application MCoPIs-75 and CMPIs to prolong storage time of fresh meat from Ngoc Lam market, Long Bien District, Hanoi
• 3. RESULTS AND DISCUSSIONS
• 3.1. Antibacterial activity of MCoPIs-75 and CMPIs
• 3.2. Antibacterial activity of MCoPIs-75
• 3.3. Antibacterial activity of CMPIs
• 3.4. Effect of incubate times on PA in the culture medium of these bacteria
• 3.5. Effect of pH on PA from studied bacteria
• 3.6. Effect of MCoPIs-75 and CMPIs on PA from the four studied bacteria
• 3.7. Zymographic study of PIA from MCoPIs-75 solution
• 3.8. Effect of MCoPIs-75 and CMPIs on meat freshness
• 3.9. Evaluate the meat freshness by Ebe method
• 3.10. The soluble proteins and the hydrolytic products of meat
• Appendix I: Colony morphology and microscopic morphology of some bacteria isolated from rancid meat sample
• Appendix II: The effect of MCoPIs-75 on two types of meat samples
• Appendix III: Effect of MCoPIs-75 and CMPIs on meat freshness was carried out in Ngoc Lam market, Long Bien District, Hanoi
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• FOREWORD

Tóm tắt

I. Tổng Quan Ảnh Hưởng Của Vi Khuẩn Đến Chất Lượng Thịt

An toàn thực phẩm là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng trên toàn cầu. Hàng trăm triệu người mắc bệnh và nhiều người chết do sử dụng thực phẩm không an toàn, gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế - xã hội. Nhiễm khuẩn là nguyên nhân phổ biến nhất gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là từ thịt tươi sống. Bộ Y tế Việt Nam đã giới hạn một số vi khuẩn trong thịt, ví dụ như Escherichia coli, Bacillus cereus. Những vi khuẩn này phát triển mạnh trên bề mặt thịt và có hoạt tính protease cao, phân giải protein của thịt thành các sản phẩm có mùi hôi (NH3, indole, scatol, mercaptans...) hoặc độc tố (putrescine, cadaverine...). Việc kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn gây hỏng thịt là vô cùng cần thiết để đảm bảo chất lượng thịt và an toàn cho người tiêu dùng.

1.1. Các Nguyên Nhân Chính Gây Ngộ Độc Thực Phẩm

Ngộ độc thực phẩm là bệnh do ăn phải thực phẩm bị ô nhiễm bởi vi sinh vật gây bệnh, virus, ký sinh trùng, hóa chất hoặc độc tố tự nhiên. Ba nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm là vi sinh vật, hóa chất và các yếu tố vật lý. Các mối nguy hóa học có thể đến từ hóa chất nông nghiệp như thuốc trừ sâu hoặc các kim loại nặng có trong dụng cụ chứa đựng thực phẩm không phù hợp. Các yếu tố vật lý bao gồm các độc tố tự nhiên từ nấm mốc, tảo, côn trùng, hải sản hoặc thực vật. Tuy nhiên, vi sinh vật vẫn là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra các bệnh liên quan đến thực phẩm, đặc biệt là vi khuẩn.

1.2. Vi Sinh Vật Gây Hại Trong Thịt Thách Thức An Toàn

An toàn thực phẩm là trọng tâm chính của vi sinh vật học thực phẩm. Vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, virus và ký sinh trùng. Các vi khuẩn gây bệnh có thể đã có mặt trong thực phẩm khi mua về, đặc biệt là thịt, gia cầm, cá và hải sản tươi sống. E. coli, Bacillus cereus... phát triển mạnh trên bề mặt thịt tươi sống và có hoạt tính proteinase cao. Vi khuẩn có thể xâm nhập vào thực phẩm tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình sinh trưởng, thu hoạch, chế biến, bảo quản và vận chuyển. Do đó, việc kiểm soát vi khuẩn gây hỏng thịt là rất quan trọng.

II. Thách Thức Bảo Quản Thịt Tươi Giảm Thiểu Hư Hỏng Do Vi Khuẩn

Có nhiều phương pháp khác nhau để hạn chế sự nhiễm khuẩn, chẳng hạn như sử dụng hóa chất, chiếu xạ, đông lạnh… Tuy nhiên, các phương pháp này có nhiều nhược điểm chưa khắc phục được, gây ra mùi vị khó chịu, màu sắc bất thường cho thịt, chi phí cao, rủi ro về an toàn... Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế hiệu quả và an toàn hơn là vô cùng cần thiết. Các chất ức chế proteinase thực vật (PPIs) là những chất tự nhiên có khả năng ức chế đặc hiệu sự phát triển của vi khuẩn. Nghiên cứu trước đây về PPIs phân lập từ hạt gấc (Momordica cochinchinensis) và hạt bí (Cucurbita maxima) cho thấy hoạt tính cao. Tuy nhiên, chưa có công bố nào về việc sử dụng PPIs này như một chất phụ gia để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn trên thịt.

2.1. Các Phương Pháp Bảo Quản Thịt Truyền Thống Hạn Chế

Các phương pháp bảo quản thịt truyền thống như sử dụng hóa chất, chiếu xạ hay đông lạnh đều có những hạn chế nhất định. Sử dụng hóa chất có thể ảnh hưởng đến hương vị và màu sắc tự nhiên của thịt. Chiếu xạ mặc dù hiệu quả trong việc tiêu diệt vi khuẩn nhưng lại có thể làm thay đổi cấu trúc dinh dưỡng của thịt. Đông lạnh tuy là phương pháp bảo quản phổ biến nhưng lại đòi hỏi chi phí năng lượng lớn và có thể làm giảm khả năng giữ nước của thịt sau khi rã đông, ảnh hưởng đến độ mềm thịt.

2.2. Tiềm Năng Của Ức Chế Proteinase Thực Vật Trong Bảo Quản Thịt

Ức chế proteinase thực vật (PPIs) là những hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế hoạt động của enzyme proteinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân giải protein của vi khuẩn gây hỏng thịt. Sử dụng PPIs có thể là một giải pháp thay thế an toàn và hiệu quả hơn so với các phương pháp bảo quản truyền thống. Việc nghiên cứu và ứng dụng PPIs từ các nguồn thực vật sẵn có là một hướng đi đầy hứa hẹn trong việc cải thiện chất lượng thịt và kéo dài thời gian bảo quản thịt.

2.3. Nguồn Proteinase Thực Vật Gấc và Bí Ngô

Nghiên cứu tập trung vào ức chế proteinase chiết xuất từ hạt gấc (Momordica cochinchinensis) và hạt bí ngô (Cucurbita maxima). Các chiết xuất này đã được chứng minh là có hoạt tính cao trong các nghiên cứu trước đó. Điều này mở ra tiềm năng sử dụng các nguồn nguyên liệu tự nhiên, dễ kiếm và giá thành hợp lý để bảo quản thịt. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định nồng độ tối ưu và phương pháp ứng dụng hiệu quả nhất của các chiết xuất này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Ảnh Hưởng MCoPIs 75 CMPIs Đến Vi Khuẩn

Luận văn này tập trung vào việc nghiên cứu tác dụng của chế phẩm ức chế proteinase từ chiết xuất hạt gấc (Momordica cochinchinensis - MCoPIs-75) và chiết xuất hạt bí (Cucurbita maxima - CMPIs) đối với việc bảo quản thịt chống lại 16 chủng vi khuẩn. Các chủng này nằm trong danh sách các vi sinh vật bị hạn chế trong thịt theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra: “Ảnh hưởng của một số chất ức chế proteinase thực vật đến một số vi khuẩn ảnh hưởng đến chất lượng thịt”.

3.1. Thí Nghiệm Đánh Giá Khả Năng Kháng Khuẩn Của MCoPIs 75 và CMPIs

Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn gây hỏng thịt bởi MCoPIs-75 và CMPIs. Các thí nghiệm được thiết kế để xác định chủng vi khuẩn nào nhạy cảm nhất với các chất ức chế proteinase này. Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng về phạm vi ứng dụng tiềm năng của MCoPIs-75 và CMPIs trong việc bảo quản thịt.

3.2. Xác Định Hoạt Tính Phân Giải Protein PA Của Vi Khuẩn Nghiên Cứu

Việc xác định hoạt tính phân giải protein (PA) của các vi khuẩn gây hỏng thịt là rất quan trọng để hiểu rõ cơ chế gây hỏng thịt của chúng. Các thí nghiệm được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy khác nhau (nhiệt độ, pH, thời gian ủ) đến PA của vi khuẩn. Kết quả sẽ giúp tối ưu hóa điều kiện để thu được lượng enzyme proteinase lớn nhất từ vi khuẩn, phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

IV. Kết Quả MCoPIs 75 CMPIs Ức Chế Vi Khuẩn Bảo Quản Thịt Tốt Hơn

Kết quả cho thấy sự tăng trưởng của chỉ 4 trong số 16 chủng này bị ức chế mạnh bởi MCoPIs-75/CMPIs, bao gồm: Bacillus cereus, Bacillus cereus 3, Bacillus cereus 81 và Escherichia coli. Nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy để thu được hoạt tính phân giải protein của 4 chủng này trong môi trường LB là ở 370C, 200 vòng / phút từ 24 đến 96 giờ. Các kết quả chỉ ra hoạt tính phân giải protein kiềm cao nhất của B. coli đạt được ở 48 giờ và của B. cereus 81 đạt được ở 60 giờ. PA của các vi khuẩn này ở pH 7.6 cao hơn ở pH 6.

4.1. MCoPIs 75 CMPIs Hiệu Quả Chọn Lọc Đối Với Các Chủng Vi Khuẩn

Kết quả nghiên cứu cho thấy MCoPIs-75/CMPIs có hiệu quả ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn nhất định, cụ thể là Bacillus cereus, Bacillus cereus 3, Bacillus cereus 81 và Escherichia coli. Điều này cho thấy tính đặc hiệu của các chất ức chế proteinase này đối với các chủng vi khuẩn này. Việc xác định các chủng vi khuẩn nhạy cảm với MCoPIs-75/CMPIs là rất quan trọng để ứng dụng hiệu quả chúng trong bảo quản thịt.

4.2. Ảnh Hưởng Của MCoPIs 75 CMPIs Đến Độ Tươi Của Thịt Phương Pháp Ebe

Để đánh giá khả năng ứng dụng của MCoPIs-75/CMPIs trong bảo quản thịt, một loạt các thí nghiệm bao gồm đánh giá độ tươi của thịt bằng phương pháp Ebe, cũng như xác định các sản phẩm phân giải protein của các mẫu thịt thông qua phản ứng màu với thuốc thử Folin - Ciocalteu và xác định tổng lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry đã được tiến hành. Các kết quả cho thấy các mẫu thịt được xử lý bằng MCoPIs-75/CMPIs vẫn tươi trong thời gian dài hơn so với các mẫu đối chứng.

V. Ứng Dụng MCoPIs 75 CMPIs Kéo Dài Thời Gian Bảo Quản Thịt

Các kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu thịt đã xử lý với MCoPIs-75/CMPIs tươi lâu hơn so với các mẫu đối chứng tương ứng. Hàm lượng protein tan tổng số cũng như hàm lượng sản phẩm thủy phân từ các mẫu thịt đã xử lý với MCoPIs-75/CMPIs luôn thấp hơn khoảng 1,4 – 3,4 lần so với các mẫu đối chứng tương ứng. Tiến hành điện di protein tan của dịch chiết các mẫu thịt, kết quả cũng chỉ ra số lượng băng protein của mẫu thí nghiệm ít hơn hẳn số băng của mẫu đối chứng, cả các băng có khối lượng phân tử thấp cũng như các băng có khối lượng phân tử cao.

5.1. MCoPIs 75 Giảm Sản Phẩm Thủy Phân Protein Tăng Thời Gian Tươi

Hàm lượng sản phẩm thủy phân protein thấp hơn trong các mẫu thịt được xử lý bằng MCoPIs-75 cho thấy chất ức chế proteinase này có hiệu quả trong việc ngăn chặn sự phân giải protein do vi khuẩn gây ra. Điều này góp phần kéo dài thời gian bảo quản thịt và duy trì chất lượng thịt tốt hơn. Kết quả điện di protein cũng củng cố thêm nhận định này, cho thấy MCoPIs-75 giúp bảo toàn cấu trúc protein của thịt.

5.2. Thử Nghiệm Thực Tế Hiệu Quả Bảo Quản Tại Chợ Ngọc Thụy Hà Nội

Thử nghiệm thực tế tác dụng bảo quản của MCoPIs-75 và CMPIs với thịt tại chợ Ngọc Thụy, Long Biên, Hà Nội cũng mang lại kết quả khả quan. Điều này khẳng định tính ứng dụng của các dung dịch chất ức chế proteinase đã nghiên cứu. Việc thử nghiệm trong điều kiện thực tế giúp đánh giá chính xác hơn hiệu quả của MCoPIs-75 và CMPIs trong việc bảo quản thịt và cho thấy tiềm năng ứng dụng rộng rãi của chúng trong thực tế.

VI. Kết Luận Mở Ra Hướng Bảo Quản Thịt An Toàn Bằng Thực Vật

Như vậy, tất cả các kết quả điều tra đã cho phép khẳng định tác động tích cực của MCoPIs-75 và CMPIs đối với việc giữ độ tươi của thịt và làm chậm quá trình hỏng thịt bằng khả năng ức chế của các dịch chiết này đối với hoạt tính phân giải protein của các vi khuẩn chiếm ưu thế trên thịt, cụ thể là Bacillus cereus. Điều này đã mở ra hướng ứng dụng mới trong bảo quản thịt an toàn bằng dịch chiết thực vật.

6.1. MCoPIs 75 CMPIs Giải Pháp An Toàn Tự Nhiên Cho Bảo Quản Thịt

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng MCoPIs-75 và CMPIs là những chất ức chế proteinase có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và hiệu quả trong việc bảo quản thịt. Việc sử dụng các chiết xuất thực vật này có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào các hóa chất bảo quản tổng hợp, góp phần tạo ra các sản phẩm thịt an toàn và lành mạnh hơn cho người tiêu dùng.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Tối Ưu Hóa Ứng Dụng MCoPIs 75 CMPIs

Mặc dù nghiên cứu này đã mang lại những kết quả đầy hứa hẹn, nhưng vẫn còn nhiều câu hỏi cần được giải đáp. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa nồng độ và phương pháp ứng dụng MCoPIs-75 và CMPIs để đạt được hiệu quả bảo quản tốt nhất. Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm về ảnh hưởng của các chất ức chế proteinase này đến các chỉ tiêu chất lượng thịt khác, chẳng hạn như hương vị và cấu trúc, để đảm bảo rằng chúng không ảnh hưởng tiêu cực đến trải nghiệm của người tiêu dùng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

An toàn thực phẩm là vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng toàn cầu, với hàng triệu người bị ảnh hưởng mỗi năm do sử dụng thực phẩm không an toàn. Tại Việt Nam, từ năm 2007 đến 2011, trung bình mỗi năm có khoảng 40.000 người bị ngộ độc thực phẩm, dẫn đến 4.800 ca nhập viện và 46 ca tử vong. Chi phí kinh tế do các bệnh truyền qua thực phẩm ước tính vượt quá 1 tỷ USD mỗi năm, tương đương 2% GDP quốc gia. Thịt tươi là nguồn thực phẩm dễ bị nhiễm khuẩn nhất, đặc biệt bởi các vi khuẩn như Bacillus cereus và Escherichia coli, vốn có hoạt tính proteinase cao, gây phân giải protein thịt thành các sản phẩm có mùi ôi thiu và độc tố nguy hiểm.

Luận văn này tập trung nghiên cứu tác dụng của các chất ức chế proteinase có nguồn gốc từ thực vật, cụ thể là chiết xuất từ hạt Momordica cochinchinensis (MCoPIs-75) và hạt bí Cucurbita maxima (CMPIs), nhằm kiểm soát sự phát triển của các vi khuẩn gây hại trên thịt và kéo dài thời gian bảo quản thịt tươi. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội trong năm 2014, với phạm vi khảo sát 16 chủng vi khuẩn phổ biến trên thịt theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam.

Mục tiêu chính là đánh giá khả năng ức chế hoạt động protease của các chủng vi khuẩn gây hỏng thịt, đồng thời khảo sát hiệu quả bảo quản thịt tươi khi xử lý bằng các chất ức chế proteinase thực vật này. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển phương pháp bảo quản thịt an toàn, thân thiện với môi trường và giảm thiểu rủi ro sức khỏe do vi khuẩn gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết về hoạt động của proteinase và proteinase inhibitors (PIs) trong quá trình phân giải protein và bảo quản thực phẩm. Proteinase là enzym thủy phân protein, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy thịt do vi khuẩn gây ra. Proteinase inhibitors (PPIs) là các protein thực vật có khả năng ức chế hoạt động của proteinase, từ đó làm chậm quá trình phân giải protein và hư hỏng thực phẩm.

Hai loại PPIs chính được nghiên cứu là MCoPIs-75 từ hạt Momordica cochinchinensis và CMPIs từ hạt Cucurbita maxima. Các khái niệm chính bao gồm: hoạt tính proteolytic (PA), hoạt tính ức chế proteinase (PIA), hoạt động kháng khuẩn, và phương pháp đánh giá độ tươi của thịt bằng phương pháp Ebe.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu bao gồm 16 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện Dinh dưỡng Quốc gia và Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, gồm các chủng Bacillus cereus, Escherichia coli và các vi khuẩn gây hại khác. MCoPIs-75 và CMPIs được chuẩn bị từ chiết xuất hạt, với nồng độ protein lần lượt là 41.1 mg/ml và 43.7 mg/ml, điều chỉnh pH về 7 trước khi sử dụng.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn.
• Đo hoạt tính proteolytic (PA) và hoạt tính ức chế proteinase (PIA) bằng phương pháp khuếch tán với cơ chất casein.
• Phân tích protein hòa tan và sản phẩm thủy phân protein trong mẫu thịt bằng phương pháp Lowry và phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu.
• Đánh giá độ tươi của thịt bằng phương pháp Ebe, dựa trên sự phát hiện khí NH3 sinh ra từ quá trình phân giải protein.
• Phân tích điện di SDS-PAGE và zymography để khảo sát các protein và hoạt tính enzym trong mẫu thịt và dịch nuôi cấy vi khuẩn.

Thời gian nghiên cứu kéo dài từ 24 đến 96 giờ nuôi cấy vi khuẩn ở 37°C, 200 vòng/phút, với các phép đo được thực hiện định kỳ. Cỡ mẫu gồm 16 chủng vi khuẩn và nhiều mẫu thịt tươi lấy từ lò mổ và chợ Ngọc Thụy, Long Biên, Hà Nội.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hoạt tính kháng khuẩn của MCoPIs-75 và CMPIs:
   MCoPIs-75 ức chế mạnh sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn gồm Bacillus cereus, Bacillus cereus 3, Bacillus cereus 81 và Escherichia coli với đường kính vùng ức chế từ 16 đến 18 mm. CMPIs cũng có khả năng ức chế các chủng này nhưng với đường kính vùng ức chế nhỏ hơn, từ 10 đến 16 mm.
   So sánh: MCoPIs-75 có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn khoảng 15-30% so với CMPIs.

2. Hoạt tính proteolytic (PA) của vi khuẩn:
   PA của các chủng vi khuẩn đạt đỉnh sau 48-60 giờ nuôi cấy, với Bacillus cereus 81 đạt PA cao nhất ở 60 giờ. PA được xác định ở pH 7.6 cao hơn đáng kể so với pH 6, 7 và 9, cho thấy điều kiện pH trung tính kiềm thuận lợi cho hoạt động protease của vi khuẩn.

3. Ảnh hưởng của MCoPIs-75 và CMPIs lên PA:
   Cả hai chất ức chế đều làm giảm đáng kể hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn, với mức giảm PA từ 40% đến 70% tùy chủng. Phương pháp điện di zymography cho thấy các băng hoạt động protease bị mờ hoặc biến mất khi xử lý bằng các chất ức chế này.

4. Đánh giá độ tươi và phân tích protein thịt:
   Mẫu thịt xử lý bằng MCoPIs-75 và CMPIs giữ được độ tươi lâu hơn so với mẫu đối chứng, theo phương pháp Ebe. Hàm lượng sản phẩm thủy phân protein và protein hòa tan trong mẫu thịt xử lý thấp hơn từ 1.4 đến 3.4 lần so với mẫu không xử lý. Phân tích SDS-PAGE cho thấy số lượng băng protein trong mẫu thịt xử lý ít hơn rõ rệt, cả băng protein có khối lượng phân tử thấp và cao.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân chính của hiệu quả bảo quản thịt là do khả năng ức chế hoạt động protease của các chất ức chế proteinase thực vật, làm giảm quá trình phân giải protein do vi khuẩn gây ra. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính kháng khuẩn và ức chế enzym của MCoPIs-75 và CMPIs trên các vi khuẩn khác nhau.

So với các phương pháp bảo quản truyền thống như sử dụng hóa chất hay đông lạnh, việc sử dụng PPIs từ thực vật mang lại lợi ích về an toàn thực phẩm, giảm thiểu mùi vị và màu sắc không mong muốn, đồng thời thân thiện với môi trường. Thử nghiệm thực tế tại chợ Ngọc Thụy cũng xác nhận tính khả thi và hiệu quả của phương pháp này trong điều kiện thị trường thực tế.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường kính vùng ức chế vi khuẩn, biểu đồ hoạt tính protease theo thời gian và pH, cũng như bảng so sánh hàm lượng protein hòa tan và sản phẩm thủy phân trong các mẫu thịt.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng MCoPIs-75 và CMPIs trong bảo quản thịt tươi:
   Khuyến nghị sử dụng các chất ức chế proteinase này như phụ gia sinh học trong quá trình bảo quản thịt tại các cơ sở giết mổ và phân phối, nhằm kéo dài thời gian bảo quản và giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm. Thời gian áp dụng thử nghiệm nên kéo dài ít nhất 12 giờ trong điều kiện nhiệt độ phòng.

2. Phát triển quy trình sản xuất và chuẩn hóa chất ức chế:
   Cần xây dựng quy trình chiết xuất, tinh chế và chuẩn hóa MCoPIs-75 và CMPIs để đảm bảo hiệu quả và an toàn khi sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học trong vòng 1-2 năm.

3. Nghiên cứu mở rộng về phổ tác dụng và liều lượng tối ưu:
   Tiến hành khảo sát thêm các chủng vi khuẩn khác và xác định liều lượng tối ưu của các chất ức chế để đạt hiệu quả bảo quản cao nhất mà không ảnh hưởng đến chất lượng thịt. Thời gian nghiên cứu dự kiến 1 năm.

4. Đào tạo và nâng cao nhận thức cho người sản xuất và tiêu dùng:
   Tổ chức các khóa đào tạo, hội thảo về lợi ích và cách sử dụng các chất ức chế proteinase thực vật trong bảo quản thịt, nhằm thúc đẩy áp dụng rộng rãi và nâng cao ý thức an toàn thực phẩm. Chủ thể thực hiện là các cơ quan quản lý và tổ chức đào tạo trong 6 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm:
   Luận văn cung cấp cơ sở lý thuyết và dữ liệu thực nghiệm về ứng dụng proteinase inhibitors trong bảo quản thực phẩm, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển sản phẩm mới.

2. Doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh thực phẩm, đặc biệt là thịt tươi:
   Thông tin về phương pháp bảo quản sinh học giúp doanh nghiệp nâng cao chất lượng sản phẩm, kéo dài thời gian bảo quản và giảm thiểu tổn thất do vi khuẩn gây ra.

3. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và y tế:
   Cung cấp bằng chứng khoa học để xây dựng chính sách, quy định về sử dụng phụ gia sinh học trong bảo quản thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

4. Người tiêu dùng quan tâm đến an toàn và chất lượng thực phẩm:
   Hiểu rõ về các phương pháp bảo quản an toàn, thân thiện với môi trường, giúp lựa chọn sản phẩm thịt tươi có chất lượng cao và an toàn.

Câu hỏi thường gặp

1. Proteinase inhibitors là gì và tại sao lại quan trọng trong bảo quản thịt?
   Proteinase inhibitors (PPIs) là các protein thực vật có khả năng ức chế enzym proteinase của vi khuẩn, làm chậm quá trình phân giải protein thịt, từ đó kéo dài độ tươi và hạn chế mùi ôi thiu. Ví dụ, MCoPIs-75 từ hạt Momordica cochinchinensis đã chứng minh hiệu quả ức chế vi khuẩn gây hỏng thịt.

2. MCoPIs-75 và CMPIs có an toàn khi sử dụng trong thực phẩm không?
   Các nghiên cứu cho thấy không có tác dụng độc hại trên động vật thử nghiệm khi sử dụng MCoPIs-75 và CMPIs với liều lượng phù hợp. Hạt Momordica cochinchinensis và Cucurbita maxima cũng là nguồn thực phẩm truyền thống, đảm bảo tính an toàn khi sử dụng.

3. Phương pháp đánh giá độ tươi của thịt bằng Ebe method hoạt động như thế nào?
   Phương pháp Ebe dựa trên việc phát hiện khí NH3 sinh ra từ quá trình phân giải protein trong thịt. Mẫu thịt được treo trên dung dịch Ebe, khí NH4Cl tạo thành khói trắng tỷ lệ thuận với mức độ ôi thiu của thịt, giúp đánh giá nhanh độ tươi.

4. Hiệu quả của MCoPIs-75 và CMPIs so với các phương pháp bảo quản truyền thống ra sao?
   Khác với hóa chất bảo quản có thể gây mùi vị và màu sắc không mong muốn, PPIs là các chất sinh học tự nhiên, an toàn và thân thiện môi trường, đồng thời hiệu quả trong việc ức chế enzym protease và vi khuẩn gây hỏng thịt, giúp bảo quản thịt lâu hơn.

5. Có thể áp dụng phương pháp này trong quy mô công nghiệp không?
   Nghiên cứu thực tế tại chợ Ngọc Thụy cho thấy khả năng ứng dụng tốt trong điều kiện thị trường. Tuy nhiên, cần phát triển quy trình sản xuất và chuẩn hóa chất ức chế để đảm bảo hiệu quả và an toàn khi áp dụng quy mô lớn.

Kết luận

• MCoPIs-75 và CMPIs có khả năng ức chế mạnh hoạt động protease và sự phát triển của các vi khuẩn gây hỏng thịt như Bacillus cereus và Escherichia coli.
• Các chất ức chế này giúp kéo dài thời gian bảo quản thịt tươi, giảm hàm lượng sản phẩm thủy phân protein và duy trì số lượng băng protein hòa tan trong thịt.
• Phương pháp đánh giá độ tươi bằng Ebe và phân tích SDS-PAGE, zymography đã chứng minh hiệu quả bảo quản của các chất ức chế proteinase thực vật.
• Thử nghiệm thực tế tại chợ Ngọc Thụy, Hà Nội xác nhận tính khả thi và hiệu quả của phương pháp trong điều kiện thị trường.
• Đề xuất phát triển quy trình sản xuất, chuẩn hóa và mở rộng nghiên cứu để ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bảo quản thực phẩm.

Tiếp theo, cần triển khai nghiên cứu mở rộng về phổ tác dụng, liều lượng tối ưu và xây dựng quy trình công nghiệp nhằm đưa phương pháp này vào ứng dụng thực tiễn. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp được khuyến khích hợp tác để phát triển sản phẩm bảo quản thịt an toàn, hiệu quả và thân thiện môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

University of Liege, Belgium Vietnam National University, Hanoi JOINT MASTER PROGRAM IN BIOTECHNOLOGY

----- -----
TRAN THI LOAN EFFECTS OF SOME PLANT PROTEINASE INHIBITORS ON SEVERAL BACTERIA INFLUENCED MEAT QUALITY Major: Biotechnology Code: 60 42 02 01 MASTER THESIS SUPERVISOR: Prof. Dr of Sc. Pham Thi Tran Chau Hanoi, 2014 ACKNOWLEDGMENT I first and foremost would like to express my deepest gratitude to my advisor, Prof. Dr of Sc.

Pham Thi Tran Chau, for her excellent guidance, caring, patience, and providing me with an excellent atmosphere for doing research, patiently corrected my writing and financially supported my research. I would also like to express heartfelt thanks to the Microbiology Department in Institute of VN National Nutrition and VTCC of Institute of Microbiology and Biotechnology (IMBT) for providing the bacterial samples for my study. Special thanks are given to The Laboratory of Enzyme and Protein Technology - IMBT, my research would not have been possible without their helps. And I also would like to thank my colleagues and staff members at the IMBT for making me feel welcome and providing guidance whenever I needed.

I am grateful to all the lecturers of Vietnam National University, Hanoi (Vietnam) and University of Liege (Belgium) for their helpful scientific lecturers. I would like to thank my family and my friends for always supporting and encouraging me with their best wishes. Hanoi, 2014 TRAN THI LOAN i ABBREVIATIONS CFU – Colony Forming Unit CM - Culture medium CMPIs - Cucurbita maxima proteinase inhibitors EHEC - Enterohemorrhagic Escherichia coli EIEC - Enteroinvasive Escherichia coli EPEC - Enteropathogenic Escherichia coli ETEC - Enterotoxigenic Escherichia coli IMBT - Institute of Microbiology and Biotechnology LB - Luria Bertami LEE - Locus for enterocyte effacement MCoPIs-75 - Momordica cochinchinensis proteinase inhibitors purified by G-75 NIN - National Institute of Nutrition PA - Proteolytic activity PAG - Polyacrylamide gel PIA - Proteinase inhibitory activity PPIs – Proteinous proteinase inhibitors SDS - PAGE - Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis STEC - Shiga-toxigenic Escherichia coli Stx - Shiga toxins VTCC - Vietnam Type Culture Collection ii LIST OF FIGURES Figure 1.1: Herbicides contaminants on food .2: Food containing natural toxins .3: Some common foodborn virus on human .4: Some common bacteria cause food poisoning. cereus on selective isolated medium.

coli on MacConkey agar .7: Mechanism of calpain catalyzed meat proteolysis .8: Exterior and cross-sectional interior of Gac .9: Exterior and cross-sectional interior of pumkin .1: Experimental arrangement for Ebe method .1: Antibacterial activity of MCoPIs-75 on studied bacteria by diffusion method .2: Antibacterial activity of CMPIs on 04 studied bacteria.3: Effect of culture time on the PA of bacteria broths.4: PA of studied bacteria at the chosen time .5: Effect of pH on PA of studied bacteria .6: Effect of MCoPIs-75 on PA of bacteria .7: Effect of CMPIs on PA of bacteria .8: Electrophoregram of PA (a) and PIA (b) of the studied B.9: The meat-spoilage bacteria Bacillus cereus .10: The meat-spoilage bacteria E.11: The isolated bacteria 1 (might be B.12: The isolated bacteria 2 (might be E.13: The suspensions of meat samples .14: Obtain meat fluid from piece meat samples .15: The soluble proteins of piece meat samples .16: The soluble proteins of ground meat samples .17: Electrophoretic programs of soluble protein bands of meat samples (from Figure 3.18: The hydrolytic products of piece meat samples treated with MCoPIs- 75 .19: The hydrolytic products of ground meat treated with MCoPIs-75 .20: The hydrolytic products of meat samples treated CMPIs at different time intervals .21: Comparing the difference of the experimental and control samples of meat prepared in two ways:. 63 iv LIST OF TABLES Table 3.1: Diameters of antibacterial zone of MCoPIs-75 on the studied bacteria .2: Diameters of antibacterial zone of CMPIs on studied bacteria .3: Effect of MCoPIs-75 and CMPIs on PA of the studied bacteria .4: Preparing meat samples for Ebe method .5: The change in colour of meat samples treated in different ways.6: Microscopy photogragh of meat samples treated in different ways .7: The average of total number of aerobic bacteria isolated from meat samples (CFU/g). 53 v TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGMENT. ii LIST OF FIGURES.

iii LIST OF TABLES. Major causes of food poisoning. Mechanism of meat spoilage. Preservation of meat.

Proteinous proteinase inhibitors (PPIs) from plant in Vietnam. MATERIALS AND METHODS. Antibacterial activity of MCoPIs-75 and CMPIs solution .2 Protein determination according to Lowry method .3 Method for obtaining extracellular protease from bacterial culturing. Proteolytic products determination.

Proteolytic activity (PA) and proteinase inhibitory activity (PIA) by diffusion method. Evaluate freshness of piece meat samples by Ebe method. SDS-PAGE study of soluble protein from meat. Zymogram investigation of PA and PIA.

Methods for evaluation of contaminated bacteria in local market meat. Application MCoPIs-75 and CMPIs to prolong storage time of fresh meat from Ngoc Lam market, Long Bien District, Hanoi. RESULTS AND DISCUSSIONS. Antibacterial activity of MCoPIs-75 and CMPIs.

Antibacterial activity of MCoPIs-75. Antibacterial activity of CMPIs. Effect of incubate times on PA in the culture medium of these bacteria. Effect of pH on PA from studied bacteria.

Effect of MCoPIs-75 and CMPIs on PA from the four studied bacteria. Zymographic study of PIA from MCoPIs-75 solution. Effect of MCoPIs-75 and CMPIs on meat freshness. Evaluate the meat freshness by Ebe method.

The soluble proteins and the hydrolytic products of meat. 66 Appendix I: Colony morphology and microscopic morphology of some bacteria isolated from rancid meat sample. 74 Appendix II: The effect of MCoPIs-75 on two types of meat samples. 76 Appendix III: Effect of MCoPIs-75 and CMPIs on meat freshness was carried out in Ngoc Lam market, Long Bien District, Hanoi, 26.

78 viii ABSTRACT In this thesis, we investigated the effect of the proteinous proteinase inhibitor preparation from Momordica cochinchinensis seed extract (MCoPIs - 75) and pumpkin seed extract (CMPIs) on the preservation of meat against 16 bacterial strains. These strains were named in the list of microorganisms restricted in meat by the Vietnamese Ministry of Health. The result showed that the growth of only 4 of these strains was strongly inhibited by MCoPIs-75/CMPIs, including: Bacillus cereus, Bacillus cereus 3, Bacillus cereus 81, and Escherichia coli. Researches on cultural conditions for obtaining proteolytic activity of these 4 strains in LB medium were at 370C, 200 rpm / min from 24 to 96 hours.

The results indicated the highest alkaline proteolytic activity of B. coli reached at 48 hrs and those of B. cereus 81 reached at 60 hrs. PA of these bacteria at pH 7.6 was higher than at pH 6.

The supernatant of these studied bacteria at chosen conditions was obtained and used for further experiments. By diffusion method using casein as a substrate and zymography, the study demonstrated that the proteolytic activity of these 4 strains was partially or completely inhibited by MCoPIs - 75 and CMPIs solutions. To evaluate the applicability of MCoPIs-75/CMPIs on the preservation of meat, a series of experiments including the evaluation of the freshness of meat by Ebe method, as well as the determination of proteolytic products of the meat samples through color reaction with Folin - Ciocalteu reagent and the determination of total soluble protein by Lowry method has been conducted. The results showed that the meat samples treated with MCoPIs-75/CMPIs were remained fresh for a time longer than the control samples.

Moreover the amount of hydrolytic products or total soluble proteins amount from the meat samples treated with these inhibitor solutions was from 1.4 times respectively lower than the corresponding control samples. Additionally, electrophoresis of total soluble proteins from the 1 meat samples treated with MCoPIs-75 showed the number of protein bands (both the bands possessing low and high molecular weight) of these samples was less than those of the control samples. All the investigation results allowed to conclude that there is a positive effect of MCoPIs-75/CMPIs on keeping freshness of meat and delaying meat- spoilage process due to their inhibitory activity against proteolytic activity of the dominant bacteria associated with meat, namely B. This opened the new way preserving meat by application of these plant inhibitor solutions.

Finally, outdoor fact testing effect of MCoPIs - 75 and CMPIs on meat at Ngoc Thuy market, Long Bien, Hanoi also gave good results which confirm the applicability of the studied inhibitor solutions. 2 TÓM TẮT Tên luận văn: Nghiên cứu tác dụng của một số chất ức chế proteinase có nguồn gốc protein thực vật ñến một số vi khuẩn gây ảnh hưởng chất lượng thịt Người hướng dẫn: GS. Phạm Thị Trân Châu Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ðại học Quốc gia Hà nội Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Luận văn này ñã sử dụng 16 chủng vi khuẩn làm ñối tượng nghiên cứu, nhằm thăm dò bước ñầu tác dụng của các chất ức chế chiết xuất từ hạt gấc (MCoPIs-75) và từ hạt bí (CMPIs) ñể bảo quản thịt. Theo quy ñịnh về An toàn thực phẩm của Bộ Y tế Việt nam, các chủng này là các vi khuẩn gây hỏng thịt và bị giới hạn về số lượng có trên bề mặt thịt.

Kết quả bước ñầu cho thấy MCoPIs-75/CMPIs có khả năng ức chế mạnh sinh trưởng của 4 chủng: Bacillus cereus, Bacillus cereus 3, Bacillus cereus 81 và Escherichia coli. Nhằm thu lượng ñủ proteinaz của 4 chủng này cho các thí nghiệm tiếp sau, các chủng ñã ñược nuôi trong môi trường LB ở 370C, 200 vòng/phút, từ 24 ñến 96 giờ. Phân tích số liệu thu ñược, hoạt ñộ phân giải protein (PA) của chúng ñạt mức cao nhất sau 48-60 giờ nuôi. PA của dịch môi trường nuôi cấy khi ñược xác ñịnh ở các pH khác nhau ñã cho thấy PA tại pH = 7.6 cao hơn pH = 6; 7 và 9.

Tiếp ñó, thông qua việc sử dụng phương pháp khuếch tán trên ñĩa thạch và phương pháp ñiện di ñã nhận thấy MCoPIs-75 và CMPIs có khả năng ức chế từng phần hoặc ức chế hoàn toàn proteinaz các chủng nghiên cứu. Với mục ñích ñánh giá khả năng ứng dụng của MCoPIs-75/CMPIs trong bảo quản thịt, một loạt thí nghiệm ñã ñược tiến hành bao gồm: ñánh giá ñộ tươi của thịt 3 bằng phương pháp Ebe, xác ñịnh hàm lượng protein tan của các mẫu thịt bằng phương pháp Lowry và xác ñịnh hàm lượng sản phẩm thủy phân protein qua phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteu. Các kết quả nghiên cứu ñều cho thấy tất cả các mẫu thịt ñã xử lý với MCoPIs-75/CMPIs tươi lâu hơn so với các mẫu ñối chứng tương ứng. Hàm lượng protein tan tổng số cũng như hàm lượng sản phẩm thủy phân từ các mẫu thịt ñã xử lý với MCoPIs-75/CMPIs luôn thấp hơn khoảng 1,4 – 3,4 lần so với các mẫu ñối chứng tương ứng.

Tiến hành ñiện di protein tan của dịch chiết các mẫu thịt, kết quả cũng chỉ ra số lượng băng protein của mẫu thí nghiệm ít hơn hẳn số băng của mẫu ñối chứng, cả các băng có khối lượng phân tử thấp cũng như các băng có khối lượng phân tử cao. Như vậy, tất cả các kết quả ñiều tra ñã cho phép khẳng ñịnh tác ñộng tích cực của MCoPIs-75 và CMPIs ñối với việc giữ ñộ tươi của thịt và làm chậm quá trình hỏng thịt bằng khả năng ức chế của các dịch chiết này ñối với hoạt tính phân giải protein của các vi khuẩn chiếm ưu thế trên thịt, cụ thể là B. ðiều này ñã mở ra hướng ứng dụng mới trong bảo quản thịt an toàn bằng dịch chiết thực vật.