Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn streptomyces orientalis 4912

Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912, góp phần phát triển dược phẩm kháng sinh.

• Tác giả: Chu Thanh Bình
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Phương Nhuệ
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Nâng Cao Khả Năng Sinh Tổng Hợp Vancomyxin
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN
• 1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin
• 1.1.2. Đặc tính của vancomyxin
• 1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin
• 1.2. ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH CỦA VANCOMYXIN
• 1.3. STREPTOMYCES ORIENTALIS VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN
• 1.4. SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN Ở XẠ KHUẨN
• 1.5. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VANCOMYXIN
• 1.6. NGHIÊN CỨU DUY TRÌ VÀ NÂNG CAO HIỆU SUẤT CHỦNG GIỐNG SẢN XUẤT VANCOMYXIN
• 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VANCOMYXIN
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. CHỦNG GIỐNG VI SINH VẬT
• 2.2. MÔI TRƯỜNG
• 2.3. CÁC DUNG DỊCH ĐỆM
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Bảo quản giống
• 2.4.2. Xác định đặc điểm sinh học
• 2.4.3. Xác định sinh khối
• 2.4.4. Xác định hoạt tính kháng sinh
• 2.4.5. Phương pháp lên men
• 2.4.6. Phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm
• 2.4.7. Thu nhận tế bào trần xạ khuẩn
• 2.4.8. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh bằng xử lý UV và N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG)
• 2.4.9. Xây dựng đường cong sống sót
• 2.4.10. Xác định sự biến đổi hình thái khuẩn lạc và hoạt tính kháng sinh
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG STREPTOMYCES ORIENTALIS 4912
• 3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy
• 3.1.2. Đặc điểm hình thái
• 3.1.3. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.
• 3.1.4. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S.
• 3.1.5. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S.
• 3.1.6. Nâng cao HTKS của chủng S. orientalis 4912 bằng phương pháp gây đột biến dùng tia UV và N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG)
• 3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BIẾN CHỦNG STREPTOMYCES ORIENTALIS 4912-81-61
• 3.2.1. Tối ưu hóa quy trình lên men biến chủng S.
• 3.2.2. Lựa chọn môi trường nhân giống
• 3.2.3. Lựa chọn môi trường lên men
• 3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S.
• 3.2.5. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 trong thiết bị lên men Bioflo
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng sinh tổng hợp vancomyxin

Khả năng sinh tổng hợp vancomyxin là một trong những vấn đề quan trọng trong nghiên cứu kháng sinh hiện nay. Vancomyxin, một chất kháng sinh glycopeptit, được sản xuất chủ yếu từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis. Việc nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin không chỉ giúp tăng hiệu suất sản xuất mà còn giảm giá thành sản phẩm, đáp ứng nhu cầu điều trị ngày càng tăng của bệnh nhân. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin và các phương pháp cải thiện hiệu suất sản xuất.

1.1. Đặc điểm sinh học của Streptomyces orientalis

Streptomyces orientalis là một trong những chủng vi sinh vật quan trọng trong sản xuất vancomyxin. Chủng này có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường nuôi cấy đặc biệt và có khả năng sản xuất kháng sinh cao. Nghiên cứu về đặc điểm sinh học của chủng này sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp vancomyxin.

1.2. Lịch sử phát triển và ứng dụng vancomyxin

Vancomyxin được phát hiện lần đầu vào năm 1956 và đã trở thành một trong những kháng sinh quan trọng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc. Việc hiểu rõ lịch sử phát triển và ứng dụng của vancomyxin sẽ giúp nhận thức được tầm quan trọng của việc nâng cao khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh này.

II. Vấn đề và thách thức trong sinh tổng hợp vancomyxin

Mặc dù vancomyxin có nhiều ứng dụng trong điều trị, nhưng việc sản xuất kháng sinh này vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như hiệu suất sinh tổng hợp thấp, chi phí sản xuất cao và sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc là những yếu tố cần được giải quyết. Nghiên cứu này sẽ phân tích các thách thức chính trong quá trình sản xuất vancomyxin và đề xuất các giải pháp khả thi.

2.1. Hiệu suất sinh tổng hợp vancomyxin thấp

Một trong những vấn đề lớn nhất trong sản xuất vancomyxin là hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Nghiên cứu cho thấy rằng các yếu tố như môi trường nuôi cấy, điều kiện lên men và đặc điểm di truyền của chủng vi sinh vật có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh này.

2.2. Chi phí sản xuất cao

Chi phí sản xuất vancomyxin hiện tại vẫn còn cao, điều này gây khó khăn cho việc tiếp cận thuốc cho bệnh nhân. Việc tìm kiếm các nguyên liệu rẻ hơn và tối ưu hóa quy trình sản xuất là cần thiết để giảm giá thành sản phẩm.

III. Phương pháp nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin

Để nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Các phương pháp này bao gồm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, điều chỉnh điều kiện lên men và sử dụng công nghệ sinh học hiện đại. Nghiên cứu này sẽ trình bày chi tiết các phương pháp chính và hiệu quả của chúng trong việc nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin.

3.1. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp vancomyxin. Việc điều chỉnh các thành phần dinh dưỡng, pH và nhiệt độ có thể giúp tăng cường khả năng sinh tổng hợp kháng sinh này. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết có thể làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất.

3.2. Sử dụng công nghệ sinh học hiện đại

Công nghệ sinh học hiện đại như kỹ thuật biến đổi gen và xử lý đột biến có thể giúp cải thiện khả năng sinh tổng hợp vancomyxin. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng các phương pháp này có thể tạo ra các chủng vi sinh vật mới với khả năng sản xuất kháng sinh cao hơn.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp vancomyxin không chỉ có ý nghĩa lý thuyết mà còn có ứng dụng thực tiễn quan trọng. Việc nâng cao khả năng sản xuất vancomyxin sẽ giúp đáp ứng nhu cầu điều trị kháng sinh trong y tế. Nghiên cứu này sẽ trình bày các kết quả thực nghiệm và ứng dụng của chúng trong sản xuất kháng sinh.

4.1. Kết quả thực nghiệm về sinh tổng hợp vancomyxin

Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men có thể làm tăng đáng kể khả năng sinh tổng hợp vancomyxin. Kết quả cho thấy rằng các chủng vi sinh vật được cải thiện có thể sản xuất kháng sinh với hiệu suất cao hơn.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong sản xuất kháng sinh tại Việt Nam, giúp giảm chi phí và tăng cường khả năng tiếp cận thuốc cho bệnh nhân. Việc phát triển quy trình sản xuất vancomyxin hiệu quả sẽ góp phần quan trọng trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu vancomyxin

Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp vancomyxin đã chỉ ra nhiều tiềm năng và thách thức. Việc nâng cao khả năng sản xuất kháng sinh này không chỉ giúp đáp ứng nhu cầu điều trị mà còn mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu và phát triển kháng sinh trong tương lai. Cần tiếp tục nghiên cứu và áp dụng các công nghệ mới để cải thiện hiệu suất sản xuất và giảm chi phí.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu vancomyxin

Nghiên cứu vancomyxin có ý nghĩa quan trọng trong bối cảnh kháng thuốc ngày càng gia tăng. Việc phát triển các phương pháp sản xuất hiệu quả sẽ giúp đảm bảo nguồn cung kháng sinh cho điều trị.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu kháng sinh

Tương lai của nghiên cứu kháng sinh sẽ tập trung vào việc phát triển các công nghệ mới và cải tiến quy trình sản xuất. Việc áp dụng công nghệ sinh học và các phương pháp hiện đại sẽ là chìa khóa để nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin và các kháng sinh khác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam là một trong những quốc gia nhập khẩu thuốc lớn nhất thế giới, với giá trị nhập khẩu thuốc hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, trong đó kháng sinh chiếm thị phần tiêu thụ cao. Dự kiến đến năm 2020, nhu cầu thuốc của cả nước sẽ vượt 1,5 tỷ USD mỗi năm, với kháng sinh chiếm khoảng 30%. Vancomyxin, một kháng sinh nhóm glycopeptit, được sản xuất từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis, đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng. Tuy nhiên, hiệu suất sản xuất vancomyxin hiện nay còn thấp, chỉ đạt khoảng 3,7 g/l trong quy mô công nghiệp, dẫn đến giá thành cao gấp 10-20 lần so với các kháng sinh nhóm penicillin hoặc cephalosporin.

Luận văn tập trung nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912, nhằm hướng tới sản xuất kháng sinh phù hợp với nguyên liệu sẵn có, chi phí thấp và điều kiện khí hậu Việt Nam. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với mục tiêu cụ thể gồm: nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng, nâng cao hoạt tính kháng sinh, tối ưu môi trường và điều kiện lên men. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào chủng S. orientalis 4912, với các thí nghiệm lên men trong điều kiện phòng thí nghiệm và thiết bị lên men Bioflo 110, trong khoảng thời gian nghiên cứu từ năm 2010 đến 2012.

Việc nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp vancomyxin không chỉ góp phần giảm giá thành sản phẩm mà còn đáp ứng nhu cầu điều trị các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do vi khuẩn kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy phát triển công nghiệp hóa dược trong nước, phù hợp với mục tiêu phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020 theo Quyết định số 61/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về sinh tổng hợp kháng sinh nhóm glycopeptit, đặc biệt là vancomyxin, được tổng hợp bởi xạ khuẩn Streptomyces orientalis. Các khái niệm chính bao gồm:

• Cơ chế sinh tổng hợp vancomyxin: Vancomyxin được tổng hợp qua con đường không ribosom (nonribosomal peptide synthetase - NRPS), với sự tham gia của các enzyme phức tạp như adenyl hóa, epime hóa và thioesterase, tạo thành chuỗi heptapeptit và các biến đổi tiếp theo như glycozyl hóa, halogen hóa để tạo phân tử hoạt tính.
• Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin: Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của tổng hợp peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn Gram dương bằng cách gắn vào đoạn N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin, ngăn cản liên kết chéo peptit, làm giảm tính bền vững của thành tế bào.
• Ảnh hưởng của môi trường lên quá trình sinh tổng hợp: Nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nitơ, khoáng chất và độ thông khí ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis.
• Phương pháp gây đột biến và tuyển chọn chủng siêu sản xuất: Sử dụng tia UV và hóa chất MNNG để tạo đột biến tế bào trần và bào tử, nhằm nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng Streptomyces orientalis 4912 được nhập từ Công ty TG Biotech (Hàn Quốc). Các vi sinh vật kiểm định gồm Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Sarcina lutea M5, Staphylococcus aureus 209P và Escherichia coli PA2.
• Phương pháp phân tích:
  • Xác định đặc điểm sinh học và hình thái bằng kính hiển vi quang học và điện tử.
  • Đo hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp cục thạch, đục lỗ thạch và khoanh giấy lọc.
  • Gây đột biến bằng tia UV (cường độ 8x10^3 ergs/cm^2/giây, bước sóng 260 nm) với thời gian chiếu từ 5 đến 80 giây.
  • Gây đột biến bằng hóa chất MNNG (nồng độ 0,1-1 mg/ml) trong đệm TM pH 8, xử lý 10-120 phút.
  • Thu nhận tế bào trần bằng xử lý lysozym 1 mg/ml trong 60-70 phút, bổ sung glyxin 0,4% trong môi trường nuôi cấy.
  • Lên men trong bình tam giác 500 ml trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút, nhiệt độ 28°C, thời gian 120 giờ.
  • Lên men quy mô nhỏ bằng thiết bị Bioflo 110, điều chỉnh oxy hòa tan (dO2) ở các mức dưới 10%, 10-20%, 20-30%, 30-40% bằng thay đổi tốc độ khuấy 500-900 vòng/phút.
• Timeline nghiên cứu: Từ năm 2010 đến 2012, bao gồm các giai đoạn chuẩn bị giống, khảo sát đặc điểm sinh học, gây đột biến, tối ưu môi trường và điều kiện lên men, đánh giá hiệu suất sinh tổng hợp vancomyxin.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đặc điểm sinh học và hình thái chủng S. orientalis 4912: Chủng phát triển tốt trên môi trường Gauze 1 và Gauze 2, khuẩn lạc có màu sắc thay đổi theo môi trường, không sinh sắc tố tan. Bào tử có dạng hình trụ, kích thước 0,5-1 x 2-3 μm, kết thành chuỗi dài 15-20 bào tử.
2. Hoạt tính kháng sinh trên các môi trường khác nhau: Chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên môi trường 48 với đường kính vòng vô khuẩn lên đến 16 mm đối với Bacillus subtilis ATCC 6633, trong khi trên môi trường Gauze 1 không sinh kháng sinh.
3. Tối ưu điều kiện tạo tế bào trần (TBT): Thời gian nuôi cấy 48 giờ, xử lý lysozym 1 mg/ml trong 60-70 phút và bổ sung glyxin 0,4% trong môi trường nuôi cấy cho hiệu quả tạo TBT cao nhất, đạt khoảng 12 x 10^5 tế bào trần/ml.
4. Gây đột biến nâng cao hoạt tính kháng sinh: Xử lý tế bào trần bằng tia UV và MNNG tạo ra các biến chủng có hoạt tính kháng sinh tăng từ 10% đến 60% so với chủng gốc. Đường cong sống sót cho thấy tỷ lệ sống sót giảm theo thời gian chiếu tia UV và nồng độ MNNG, giúp xác định điều kiện gây đột biến tối ưu.
5. Ảnh hưởng của oxy hòa tan trong lên men: Khi điều chỉnh oxy hòa tan trong khoảng 20-30% (tốc độ khuấy 500-800 vòng/phút), sinh khối và hoạt tính kháng sinh đạt cao nhất, với hiệu suất vancomyxin lên đến khoảng 11,5 g/l sau 120 giờ lên men, tăng gần 3 lần so với quy mô công nghiệp hiện tại.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng S. orientalis 4912 có đặc điểm sinh học ổn định, phù hợp cho sản xuất vancomyxin trong điều kiện Việt Nam. Việc tối ưu môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men, đặc biệt là bổ sung glyxin và xử lý tế bào bằng lysozym, giúp tăng hiệu quả tạo tế bào trần, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình gây đột biến và nâng cao hoạt tính kháng sinh.

Phương pháp gây đột biến bằng tia UV và MNNG đã chứng minh hiệu quả trong việc tạo ra các biến chủng siêu sản xuất vancomyxin, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về cải tiến chủng giống trong công nghiệp kháng sinh. Việc điều chỉnh oxy hòa tan trong quá trình lên men cũng đóng vai trò quan trọng, giúp cân bằng giữa sinh trưởng sinh khối và tổng hợp kháng sinh, tránh tạo sản phẩm phụ không mong muốn.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, hiệu suất vancomyxin đạt được trong nghiên cứu này cao hơn đáng kể so với mức 3,7 g/l trong sản xuất công nghiệp hiện tại, cho thấy tiềm năng ứng dụng thực tiễn lớn. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong sống sót tế bào sau xử lý đột biến, biểu đồ hoạt tính kháng sinh trên các môi trường khác nhau và biểu đồ biến động oxy hòa tan trong quá trình lên men.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình gây đột biến bằng tia UV và MNNG cho chủng S. orientalis 4912 nhằm tạo ra các biến chủng siêu sản xuất vancomyxin, tăng hiệu suất lên ít nhất 11 g/l trong vòng 2 năm, do các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực hiện.
2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy với bổ sung glyxin 0,4% và xử lý tế bào bằng lysozym 1 mg/ml trong 60-70 phút để nâng cao hiệu quả tạo tế bào trần, hỗ trợ quá trình đột biến và lên men, áp dụng ngay trong quy trình sản xuất thử nghiệm.
3. Điều chỉnh điều kiện lên men, đặc biệt là duy trì oxy hòa tan trong khoảng 20-30% bằng cách kiểm soát tốc độ khuấy và sục khí trong thiết bị lên men Bioflo 110, nhằm tối ưu sinh khối và hoạt tính kháng sinh, triển khai trong vòng 1 năm.
4. Xây dựng quy trình sản xuất vancomyxin quy mô pilot từ 500 đến 1000 kg/năm dựa trên chủng biến đổi và điều kiện lên men tối ưu, phối hợp với các doanh nghiệp dược trong nước để giảm giá thành sản phẩm, thực hiện trong 3 năm tới.
5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ cho các đơn vị sản xuất dược phẩm trong nước nhằm nâng cao năng lực sản xuất vancomyxin, góp phần thực hiện mục tiêu sản xuất 50% tổng số thuốc trong nước đến năm 2025.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chi tiết về sinh tổng hợp vancomyxin, kỹ thuật gây đột biến và tối ưu điều kiện lên men.
2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và kháng sinh trong nước: Áp dụng quy trình nâng cao hiệu suất sản xuất vancomyxin, giảm giá thành và nâng cao chất lượng sản phẩm.
3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế, công nghiệp dược: Tham khảo để xây dựng chiến lược phát triển công nghiệp hóa dược, giảm nhập khẩu thuốc kháng sinh.
4. Các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và công nghệ lên men: Áp dụng kỹ thuật xử lý tế bào trần, gây đột biến và kiểm soát điều kiện lên men trong nghiên cứu và sản xuất các kháng sinh khác.

Câu hỏi thường gặp

1. Vancomyxin là gì và tại sao nó quan trọng?
   Vancomyxin là kháng sinh nhóm glycopeptit, được sản xuất từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis, có tác dụng mạnh với vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các chủng kháng methicillin. Nó được xem là "thuốc cuối cùng" trong điều trị các nhiễm trùng kháng thuốc.

2. Tại sao cần nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của S. orientalis?
   Hiệu suất sản xuất vancomyxin hiện còn thấp (khoảng 3,7 g/l), dẫn đến giá thành cao. Nâng cao hiệu suất giúp giảm chi phí sản xuất, đáp ứng nhu cầu điều trị và phát triển công nghiệp dược trong nước.

3. Phương pháp gây đột biến nào được sử dụng trong nghiên cứu?
   Nghiên cứu sử dụng tia UV và hóa chất MNNG để gây đột biến tế bào trần và bào tử, giúp tạo ra các biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao hơn chủng gốc từ 10% đến 60%.

4. Điều kiện lên men nào tối ưu cho sản xuất vancomyxin?
   Nhiệt độ 28°C, pH khoảng 6,5-7,5, bổ sung glyxin 0,4%, xử lý tế bào bằng lysozym 1 mg/ml, và duy trì oxy hòa tan trong khoảng 20-30% là điều kiện tối ưu giúp tăng sinh khối và hoạt tính kháng sinh.

5. Làm thế nào để áp dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất công nghiệp?
   Cần xây dựng quy trình sản xuất pilot dựa trên chủng biến đổi và điều kiện lên men tối ưu, phối hợp với doanh nghiệp dược trong nước để chuyển giao công nghệ, giảm giá thành và nâng cao chất lượng sản phẩm.

Kết luận

• Chủng Streptomyces orientalis 4912 có đặc điểm sinh học ổn định, phù hợp cho sản xuất vancomyxin trong điều kiện Việt Nam.
• Tối ưu môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men, đặc biệt bổ sung glyxin và xử lý tế bào bằng lysozym, giúp tăng hiệu quả tạo tế bào trần và nâng cao hoạt tính kháng sinh.
• Gây đột biến bằng tia UV và MNNG tạo ra các biến chủng siêu sản xuất vancomyxin, nâng cao hiệu suất lên đến 11,5 g/l, gấp gần 3 lần so với quy mô công nghiệp hiện tại.
• Điều chỉnh oxy hòa tan trong quá trình lên men là yếu tố quan trọng để cân bằng sinh trưởng và tổng hợp kháng sinh.
• Khuyến nghị xây dựng quy trình sản xuất pilot và chuyển giao công nghệ nhằm phát triển sản xuất vancomyxin trong nước, góp phần giảm nhập khẩu và nâng cao năng lực công nghiệp hóa dược.

Hành động tiếp theo: Triển khai quy trình gây đột biến và tối ưu lên men trong quy mô pilot, phối hợp với doanh nghiệp dược để phát triển sản phẩm thương mại, đồng thời đào tạo nhân lực và hoàn thiện quy trình kiểm soát chất lượng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nƣớc nhập khẩu thuốc nhiều nhất thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, trong đó kháng sinh chiếm thị phần tiêu thụ cao. Dự kiến đến năm 2020, cả nƣớc sẽ cần mỗi năm hơn 1,5 tỷ USD tiền thuốc, trong đó kháng sinh chiếm 30%. Theo Quyết định số 61/2007/QĐ- TTg ngày 07/5/2007 của Thủ tƣớng Chính phủ phê duyệt “Chương trình Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020” thì mục tiêu của chƣơng trình là: “Nghiên cứu tạo ra những công nghệ có chất lƣợng cao phù hợp với điều kiện sản xuất ở trong nƣớc, làm chủ và ứng dụng công nghệ hiện đại của nƣớc ngoài, tiến tới chủ động việc sản xuất thuốc chữa bệnh trong nƣớc”. Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết.

Vancomyxin là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo ra các loại kháng sinh bán tổng hợp với đặc tính chữa bệnh cao và chọn lọc. Chất kháng sinh này đƣợc sản xuất nhờ xạ khuẩn Streptomyces orientalis. Việc nâng cao khả năng sinh kháng sinh vancomyxin của chủng và hạ giá thành sản phẩm là rất cần thiết. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis” với các nội dung chính nhƣ sau: 1.

Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S. Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S. Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng và điều kiện lên men chủng S. 10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Mục tiêu: Nâng cao hoạt tính kháng sinh vancomyxin của xạ khuẩn S. orientalis 4912 hƣớng tới sản xuất kháng sinh này phù hợp với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và điều kiện môi trƣờng khí hậu của Việt Nam. 11 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN 1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, đƣợc Eli Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S.

orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh ra [45]. Ban đầu CKS này đƣợc gọi là hợp chất 05865, nhƣng sau đó đã đƣợc đặt tên là vancomyxin (do bắt nguồn từ “Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”). Năm 1958, CKS này đƣợc đƣa vào điều trị thử nghiệm trên ngƣời. Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đƣa vancomyxin vào sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện.

Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin là metixilin đƣợc đƣa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm xuống trong một thời gian. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S. auureus kháng metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh glycopeptit đƣợc lựa chọn trong phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng nhiều loại KS thông dụng gây ra. Lúc đó vancomyxin đƣợc ví nhƣ một loại thần dƣợc hay phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin gây nên.

Vancomyxin đã mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng kháng penixilin của các chủng Staphylococcus. Sau khi những nghi ngờ này đƣợc dẫn chứng bằng những số liệu cụ thể thì liệu pháp này đƣợc điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22], [28], [36], [56]. Vancomyxin đƣợc sử dụng trong vòng hơn 30 năm mà không có những dẫn chứng đáng kể nào về sự kháng thuốc. Nhƣng sự lạm dụng trong việc dùng vancomyxin đã làm con ngƣời phải đối mặt trƣớc một thực tế là sự xuất hiện và gia tăng ngày càng nhiều của các chủng vi khuẩn kháng lại CKS từng đƣợc xem nhƣ hy vọng cuối cùng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm hiểm nghèo.

Chủng vi sinh vật kháng vancomyxin đầu tiên đƣợc công bố vào cuối những năm 1980 và sau đó số lƣợng này tăng lên không ngừng. Do sự xuất hiện của những chủng vi sinh 12 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] vật kháng vancomyxin, nhu cầu tìm kiếm các CKS thay thế với mục đích ngăn chặn mối hiểm họa cho sức khỏe cộng đồng luôn luôn đƣợc thúc đẩy. Tuy nhiên, kể từ khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomyxin đã luôn lôi cuốn sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học chủ yếu, từ đó biến đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ƣu việt [37], [52], [58].

Dạng vancomyxin HCl đầu tiên đã đƣợc Eli Lilly đƣa ra thị trƣờng dƣới tên thƣơng mại là Vancoxyn. Giấy chứng nhận quyền sử dụng sản phẩm này hết hạn vào đầu những năm 1980. Ngày nay, các dạng thuốc mang đặc tính chung của vancomyxin đƣợc đƣa ra dƣới nhiều tên thƣơng mại khác nhau. Năm 2004, Eli Lilly đã đăng ký bản quyền cho Vancoxyn với ViroPharma tại Mỹ, Flynn Pharma tại Anh và Aspen Pharmacare tại Úc [58].

Vancomyxin không những là một loại thuốc kháng sinh sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng rất có hiệu quả, mà còn là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo các loại kháng sinh bán tổng hợp đang rất đƣợc quan tâm. Ngày nay, tầm quan trọng của vancomyxin vẫn đƣợc khẳng định, chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện khi kết hợp với các CKS nhóm - lactam [10], [69]. Cho đến nay, trên thị trƣờng ít nhất đã có 10 biệt dƣợc chứa vancomyxin do nhiều hãng thuốc nổi tiếng trên thế giới sản xuất nhƣ: Diatraxin (Dista, Tây Ban Nha), Hanomyxin (Samjin, Hàn Quốc), Lyphoxyn (Fujisawa, Mỹ), Vancoxyn (Lilly, Mỹ), Vancoxyna (Lilly, Mỹ), Vancoled (Lederle, Mỹ), Vancor (Andria, Mỹ), Vancolin, Vancomyxin (Dakota Pharm, Pháp), Voncon (Lilly, Mỹ) [72]. Đặc tính của vancomyxin Vancomyxin có công thức tổng quát C66H75Cl2N9O24.

Trong phân tử có chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học đƣợc thể hiện ở hình 1. Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên lõi glycol và các trung tâm còn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58]. Cấu trúc hóa học lập thể quyết định cơ chế hoạt động của vancomyxin. Vancomyxin có một chuỗi hexapeptit đã glycozyl hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại nhƣ chloro-β- 13 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin, N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64].

Cấu trúc hóa học của vancomyxin [58], [71] Trọng lƣợng phân tử của vancomyxin là 1449,3 Da. Các phân tử vancomyxin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomyxin là một chất vô định hình, không màu sắc và có tính chất lƣỡng tính [40]. Vancomyxin ở dạng clohydrat hòa tan rất tốt trong nƣớc, hòa tan vừa phải trong methanol, hòa tan ít trong rƣợu bậc cao, clorofoc, etylaxetat, butylaxetat, axeton và este. Giá trị pKa của vancomyxin là 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7.

Theo những phân tích cơ bản đã chỉ ra rằng phân tử vancomyxin chứa khoảng 1,17% nitơ và 4,26% clo. Vancomyxin bền trong nƣớc ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37oC trong 6 ngày, sau 6 ngày khả năng ức chế vi khuẩn còn 10%. Ở nhiệt độ phòng (khoảng 22oC) độ bền sẽ bị giảm sau 2- 6 ngày. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ nâng nhẹ (trên 22oC) thì sự phân hủy có thể quan sát đƣợc [4], [40].

CKS này có thể hòa tan trong nƣớc tại pH 7 (khoảng 1 mg/ml) và hòa tan tốt hơn ở pH kiềm (khoảng pH 8,5 – 9,0). Vancomyxin bền ở dạng rắn và trong dịch lỏng tại nhiệt độ lớn hơn 70oC trong khoảng pH từ 2,5-9,0. Nhờ đặc điểm lƣỡng tính, vancomyxin phản ứng với axit vô cơ nhƣ: HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác… [36], [40]. Vancomyxin có 3 hệ thống vòng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm OH trong đó có 3 nhóm phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7,2.

Vancomyxin khác 14 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] với các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit khác bởi cấu trúc phức tạp. Sự khác biệt này thể hiện trong cấu trúc của vancomyxin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai (nhƣ đƣờng glucoza …) để tạo nên các vancomyxin bán tổng hợp có hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng. Đây là hƣớng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ KS mới có hoạt tính cao và chọn lọc [34], [58]. Theo “Sổ tay Kháng sinh” của Navashin, S., 1974, 1 mg vancomyxin dạng sunphat chuẩn cần đạt 1007 đơn vị hay một đơn vị vancomyxin dạng sunphat tƣơng đƣơng 0,993 mcg.

Khi tiêm tĩnh mạch chuột nhắt trắng theo chuẩn dƣợc, độ nhạy độc của vancomyxin HCl biểu hiện ở LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) đƣợc tìm thấy trong khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg. Ngƣời ta thƣờng sử dụng vancomyxin khi biết hoặc nghi ngờ về khả năng nhiễm trùng máu, hoặc sử dụng cho các bệnh nhân bị viêm xƣơng, viêm khớp, nhiễm trùng da và mô mềm [4], [10], [56]. Tác dụng của vancomyxin cao hơn khi kết hợp với các CKS khác (ví dụ KS nhóm β-lactam) trong điều trị một số loại vi sinh vật có thể thay đổi cấu trúc thành tế bào để kháng lại vancomyxin [28], [58]. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh vật thông qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào.

Vị trí mà các tác nhân tấn công vào thành tế bào là lớp peptidoglycan. Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động, kết qủa tế bào bị chết [33]. Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]: - Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các bƣớc sinh tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất.

Sự ức chế các chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy tiền chất của tế bào chất. Đây là một cơ chế không 15 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] thƣờng xuyên xảy ra đối với một tác nhân kháng vi sinh vật bao gồm việc sử dụng cơ chất thay vì điều khiển hoạt tính của enzyme sinh tổng hợp.