Luận văn: Tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vaccine vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở lợn - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Nghiên cứu phát triển vaccine vô hoạt PRRS từ virus phân lập Việt Nam. Phương pháp sản xuất, đánh giá hiệu quả bảo vệ và ứng dụng chủng ngừa.

• Tác giả: Phạm Văn Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Bá Hiên
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
• Đề tài: Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus PRRS thuộc họ Arteriviridae gây ra. Bệnh lần đầu được phát hiện tại Mỹ năm 1987 và xuất hiện ở châu Âu năm 1990. Tại châu Á, virus PRRS được ghi nhận tại Hàn Quốc và Nhật Bản năm 1998. Từ năm 2005, bệnh lan rộng trên toàn thế giới. Năm 2006, biến chủng PRRS có độc lực cao bùng phát tại Trung Quốc, gây đại dịch ở 10 tỉnh phía Nam với hơn hai triệu lợn ốm và khoảng 400.000 con chết. Dịch tiếp tục lan rộng sang các nước Đông Nam Á bao gồm Việt Nam, Campuchia, Lào, Ấn Độ. Ở Việt Nam, bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn. Các triệu chứng lâm sàng bao gồm sảy thai ở lợn nái, lợn con sơ sinh chết, hô hấp khó khăn ở lợn hậu bị và thịt. Tỷ lệ chết có thể lên đến 100% ở lợn con sơ sinh. Virus lây lan qua đường hô hấp, tiếp xúc trực tiếp và đường sinh dục. Bệnh tích đặc trưng gồm viêm phổi kẽ, xuất huyết và hoại tử lympho. Phòng chống PRRS đòi hỏi biện pháp tổng hợp gồm vệ sinh, cách ly và tiêm phòng vacxin.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus PRRS

Virus PRRS thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, là virus RNA sợi đơn có vỏ bọc. Virus có bộ gen khoảng 15 kilobase mã hóa chín khung đọc mở (ORF). ORF1a và ORF1b mã hóa protein sao chép. ORF2-7 mã hóa protein cấu trúc gồm GP2, GP3, GP4, GP5, M và N. Protein GP5 và M là protein vỏ chính đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập tế bào và gây miễn dịch bảo hộ. Virus PRRS có hai kiểu gen: genotype 1 (châu Âu) và genotype 2 (Bắc Mỹ). Biến chủng có độc lực cao HP-PRRSV xuất hiện năm 2006 có đặc điểm đột biến trong vùng nsp2. Virus nhân lên trong đại thực bào phế nang và gây ức chế miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào.

1.2. Tình hình lưu hành virus PRRS tại Việt Nam

Virus PRRS lần đầu được ghi nhận tại Việt Nam vào năm 2007, liên quan đến biến chủng HP-PRRSV có nguồn gốc từ Trung Quốc. Dịch bùng phát mạnh tại nhiều tỉnh thành phía Bắc và phía Nam, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Các nghiên cứu phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm lợn ốm, lợn sảy thai trên khắp cả nước cho thấy virus PRRS lưu hành rộng rãi với nhiều biến chủng khác nhau. Tỷ lệ nhiễm virus PRRS trong đàn lợn tại Việt Nam dao động từ 20-80% tùy theo khu vực và điều kiện chăn nuôi. Việc phân lập và đặc trưng chủng virus bản địa là cơ sở quan trọng để phát triển vacxin phòng bệnh phù hợp với điều kiện thực tế trong nước. Các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam thuộc genotype 2, có sự đa dạng về trình tự di truyền.

II. Phân tích thách thức trong sản xuất vacxin phòng PRRS

Sản xuất vacxin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đối mặt nhiều thách thức lớn. Virus PRRS có đặc tính kháng nguyên phức tạp với sự biến đổi di truyền cao giữa các chủng. Miễn dịch bảo hộ do vacxin tạo ra thường không đủ mạnh và không kéo dài. Vacxin nhược độc có nguy cơ tái độc lực và lây lan ra môi trường. Vacxin vô hoạt tạo miễn dịch dịch thể nhưng kém hiệu quả trong việc kích hoạt miễn dịch tế bào. Kháng thể trung hòa đóng vai trò quan trọng trong bảo hộ nhưng virus PRRS kích thích tạo kháng thể trung hòa chậm và yếu. Virus có cơ chế trốn tránh miễn dịch bằng cách biến đổi epitop bề mặt. Protein GP5 là mục tiêu chính của kháng thể trung hòa nhưng epitop của protein này có tính biến đổi cao. Sự khác biệt về kiểu gen giữa các chủng virus làm giảm hiệu quả bảo hộ chéo của vacxin. Do đó, việc nghiên cứu vacxin từ chủng virus phân lập tại Việt Nam là cần thiết để đảm bảo hiệu quả phòng bệnh tại địa phương. Cần tối ưu hóa quy trình sản xuất vacxin vô hoạt để tăng tính miễn dịch.

2.1. Hạn chế của các loại vacxin PRRS hiện có

2.2. Tính cần thiết của nghiên cứu vacxin từ chủng virus bản địa

Việc nghiên cứu tạo vacxin từ chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn. Chủng virus bản địa có trình tự di truyền phù hợp với virus lưu hành thực tế trong nước. Vacxin từ chủng virus bản địa tạo miễn dịch bảo hộ tốt hơn so với vacxin nhập khẩu từ chủng virus nước ngoài. Nghiên cứu tạo giống gốc virus trên tế bào là bước quan trọng để sản xuất vacxin với số lượng lớn. Giống gốc cần có tính ổn định di truyền, khả năng nhân lên cao trên tế bào nuôi cấy. Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt cần được tối ưu hóa về nồng độ chất vô hoạt, liều lượng kháng nguyên và tá dược bổ trợ. Nghiên cứu đánh giá tính an toàn, tính miễn dịch và hiệu quả bảo hộ trên lợn thực nghiệm là bắt buộc trước khi đưa vacxin vào sản xuất thương mại. Kết quả nghiên cứu góp phần chủ động nguồn vacxin phòng bệnh PRRS tại Việt Nam.

III. Phương pháp nghiên cứu tạo giống gốc và vacxin vô hoạt PRRS

Nghiên cứu tạo giống gốc virus PRRS bắt đầu bằng quá trình phân lập chủng virus từ mẫu bệnh phẩm lợn ốm tại Việt Nam. Mẫu bệnh phẩm gồm huyết thanh, phổi, hạch bạch huyết được thu thập từ lợn có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ PRRS. Virus được phân lập bằng cách nuôi cấy trên tế bào MARC-145 hoặc tế bào đại thực bào phế nang. Sau nhiều lần truyền qua tế bào, virus được chọn lọc dựa trên khả năng gây biến đổi tế bào (CPE). Chủng virus phân lập được xác định bằng kỹ thuật RT-PCR và giải trình tự gen. Giống gốc virus được đánh giá tính ổn định qua nhiều lần truyền tiếp. Quá trình sản xuất vacxin vô hoạt sử dụng virus nhân lên trên tế bào với số lượng lớn. Virus được thu hoạch từ dịch nuôi cấy tế bào khi CPE đạt tối đa. Chất vô hoạt formaldehyde hoặc BEI được sử dụng để bất hoạt virus. Vacxin được bổ trợ tá dược nhũ dầu để tăng tính miễn dịch. Đánh giá vô hoạt bằng cách tiêm vacxin lên tế bào và quan sát CPE. Vacxin được kiểm tra vô trùng, an toàn trước khi thử nghiệm trên lợn.

3.1. Quy trình tạo giống gốc virus PRRS trên tế bào

Quy trình tạo giống gốc virus PRRS tuân thủ nghiêm ngặt các bước kỹ thuật. Mẫu bệnh phẩm được xử lý vô khuẩn, nghiền và pha loãng với môi trường nuôi cấy tế bào. Tế bào MARC-145 được trồng trong bình nuôi cấy hoặc đĩa nhiều ngăn. Virus được truyền lên tế bào với liều lượng phù hợp và ủ ở 37°C, 5% CO2. Sau 5-7 ngày, quan sát CPE dưới kính hiển vi. Dịch nuôi cấy chứa virus được thu hoạch khi CPE đạt 70-80%. Virus được truyền tiếp qua tế bào mới để tăng số lượng và chọn lọc chủng có khả năng nhân lên cao. Giống gốc được trữ đông ở -80°C hoặc trong nitơ lỏng. Đặc tính của giống gốc được đánh giá bằng định lượng virus TCID50, giải trình tự gen và kiểm tra tính đồng nhất. Giống gốc đạt tiêu chuẩn được dùng làm nguyên liệu sản xuất vacxin quy mô lớn.

3.2. Kỹ thuật sản xuất vacxin vô hoạt và đánh giá tính miễn dịch

Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt PRRS bao gồm nhiều bước kỹ thuật. Virus được nuôi cấy trên tế bào trong hệ thống bioreactor quy mô lớn. Dịch nuôi cấy thu được chứa virus với nồng độ cao, thường đạt 10^6-10^7 TCID50/mL. Virus được vô hoạt bằng formaldehyde 0,1-0,2% hoặc BEI 2 mM ở nhiệt độ 4°C trong 24-48 giờ. Tính vô hoạt được xác nhận bằng truyền virus lên tế bào ba lần liên tiếp. Vacxin được trộn với tá dược nhũ dầu theo tỷ lệ 1:1 hoặc 2:1 (dầu:nước). Kiểm tra chất lượng vacxin gồm vô trùng, an toàn, độc tính. Đánh giá tính miễn dịch trên lợn thỏ thực nghiệm bằng ELISA đo kháng thể huyết thanh và phản ứng trung hòa. Thử nghiệm bảo hộ bằng công cường độc virus sống sau tiêm phòng 3-4 tuần. Vacxin hiệu quả phải giảm triệu chứng lâm sàng và giảm virus máu sau công cường độc.

IV. Kết luận và ứng dụng vacxin PRRS trong chăn nuôi

Nghiên cứu đã tạo được giống gốc virus PRRS từ chủng virus phân lập tại Việt Nam trên tế bào MARC-145. Giống gốc có tính ổn định di truyền, khả năng nhân lên cao với nồng độ virus đạt trên 10^6 TCID50/mL. Vacxin vô hoạt được sản xuất từ giống gốc này đảm bảo các tiêu chí vô trùng, an toàn và vô hoạt hoàn toàn. Kết quả thử nghiệm trên lợn thỏ cho thấy vacxin kích thích tạo kháng thể kháng PRRS đo được bằng ELISA. Kháng thể trung hòa được phát hiện ở nhóm lợn tiêm vacxin sau hai mũi. Thử nghiệm công cường độc chứng minh vacxin có khả năng bảo hộ, giảm tỷ lệ lợn ốm và giảm triệu chứng lâm sàng. Vacxin từ chủng virus bản địa có ưu điểm phù hợp với virus lưu hành thực tế tại Việt Nam. Quy trình sản xuất vacxin có thể áp dụng quy mô công nghiệp.Ứng dụng vacxin trong thực tế giúp giảm thiệt hại kinh tế do PRRS gây ra. Chủ động nguồn vacxin nội địa giảm phụ thuộc vào nhập khẩu. Kết quả nghiên cứu là cơ sở để phát triển vacxin thương mại phục vụ ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam.

4.1. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vacxin trên lợn thực nghiệm

Thử nghiệm đánh giá hiệu quả bảo hộ được tiến hành trên lợn thỏ PRRS âm tính. Lợn được chia thành nhóm tiêm vacxin và nhóm đối chứng. Nhóm tiêm vacxin được tiêm bắp hai mũi cách nhau 3-4 tuần với liều lượng 2 mL vacxin/mũi. Lợn được theo dõi phản ứng sau tiêm gồm thân nhiệt, ăn uống, biểu hiện lâm sàng. Máu được thu thập định kỳ để đo kháng thể bằng ELISA và phản ứng trung hòa virus. Sau 4 tuần tiêm mũi thứ hai, tất cả lợn được công cường độc với virus PRRS sống qua đường mũi. Lợn được theo dõi 14-21 ngày sau công cường độc. Đánh giá tiêu chí gồm triệu chứng lâm sàng, thân nhiệt, tăng trọng, virus máu và kháng thể. Kết quả cho thấy nhóm tiêm vacxin giảm đáng kể triệu chứng hô hấp và sốt. Tỷ lệ virus máu thấp hơn và thời gian nhiễm trùng ngắn hơn so với nhóm đối chứng.

4.2. Triển vọng thương mại hóa và ứng dụng trong thực tế sản xuất

Kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng thương mại hóa vacxin vô hoạt PRRS sản xuất tại Việt Nam. Quy trình sản xuất vacxin có thể áp dụng tại các nhà máy sản xuất vacxin thú y trong nước. Ngu nguyên liệu sản xuất gồm tế bào, giống gốc virus và tá dược đều có sẵn trong nước. Giá thành sản xuất vacxin nội địa thấp hơn vacxin nhập khẩu từ 30-50%. Vacxin được sử dụng cho lợn nái hậu bị trước phối giống 4-6 tuần và lợn nái đang khai thác. Lịch tiêm phòng gồm hai mũi cơ bản cách nhau 3-4 tuần, sau đó nhắc lại mỗi 4-6 tháng. Vacxin cần được bảo quản ở 2-8°C, hạn sử dụng 12-18 tháng.Ứng dụng vacxin kết hợp với biện pháp quản lý trại, vệ sinh khử trùng và cách ly đàn mới nhập. Nghiên cứu tiếp tục cần đánh giá hiệu quả bảo hộ trên quy mô trại lớn. Cần theo dõi sự biến đổi di truyền của virus PRRS lưu hành để cập nhật chủng vacxin phù hợp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN Mang l■i tr■ nghi■m m■i m■ cho ng■■i dùng, công ngh■ hi■n th■ hi■n ■■i, b■n online không khác gì so v■i b■n g■c. B■n có th■ phóng to, thu nh■ tùy ý. NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Bá Hiên TS.

Nguyễn Văn Cảm NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 Mangh■n Luôn 123doc Th■a Xu■t Sau Nhi■u khi h■■ng phát thu■n l■i event cam s■ nh■n m■t tr■ t■ h■u k■t s■ thú nghi■m t■i ýxác n■m t■■ng m■t d■ng v■, là s■ nh■n■■i, website ra mang event kho m■i 1. t■ot■ th■ m■■■ng l■i c■ng ki■m d■n 123doc CH■P ■■u ■■ng vi■n nh■ng cho ti■n h■■ã kh■ng ng■■i NH■N quy■n th■ng thi■t chia t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c. s■ l■i b■■c v■i■I■U ti■n vàchuy■n t■t công h■n mua 123doc online kh■ng nh■t ■■nh 2.000 ngh■ bán KHO■N sang b■ng luôn cho tài hi■n ng■■i li■u ph■n luôn tài TH■A tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thông dùng. ■■u ■ tin tríhi■n THU■N hi■u c■ c■a ■■i, t■t h■i Khi qu■ mình Vi■t xác c■ khách gia b■n nh■t, minh trong l■nh Nam.

t■ng Chào online hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác m■ng tín kho■n tr■ nh■p không tài phong v■c caothành b■n chính ■■n email nh■t. tài online khác chuyên li■u thành tínb■n Mong gì cho d■ng, và v■i so■ã ■■ng nghi■p, viên kinh t■t 123doc.net! v■i mu■n công c■a c■ doanh b■n các hoàn mang ngh■ 123doc ký g■c. thành v■i h■o, Chúng l■i thông B■n và ■■ ■■n 123doc.netLink cho viên Tính n■p có tôi tin, c■ng c■a cao th■ cung ti■n ngo■i■■ng tính website. phóng th■i vào c■p ■i■m ng■,.Khách trách xác tài D■ch xã to,kho■n th■c nhi■m h■i ■■i thutháng V■ nh■ m■t s■ c■a■■■c (nh■ hàng tùy ■■■c ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ý.

cóg■i t■ng th■ tài 123doc v■ mô ■■a nguyên b■n d■ ng■■i t■ dàng s■ v■■t d■■i■■■c tri dùng. ch■ tra■ây) th■c m■c email c■u M■c h■■ng quý 100.000 cho tài b■n tiêu báu, li■u■ã b■n, ■■ng nh■ng hàng ■■u phong m■t l■■t tùyquy■n cách truy thu■c phú, ky,■a c■a c■p chính l■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau xác, các vuingày, n■p lòng “■i■u nhanh giàu■■ng ti■n s■ tr■ giá Kho■n chóng. h■u trên thành tr■ ■■ng nh■p 2.000 website Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u mình viên mu■n S■ ■■ng online và D■ng click t■o l■n■i■u ký, D■ch vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam,■ây ■ã 200 cho cung các các (sau ■âynh■ng g■iwebsite c■p users ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■ithu li■u t■t■■c nh■t nh■p. T■it■i không t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, ■i■m, vì v■y tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm trên ki■m tôi th■ ■■i racóthu■c tr■■ng th■nh■m c■p top ■áp ngo■i 3nh■t ■KTTSDDV ■ng Google.

Nh■n nhu c■utheo chiaquy■t danh s■ tàihi■u .li■udo ch■t c■ng ■■ng l■■ng vàbình ki■mch■n ti■n là online. website ki■m ti■n online hi■u qu■ và uy tín nh■t. Mangh■n Luôn 123doc Th■a Xu■t Sau Nhi■u khi h■■ng phát thu■n l■i event s■ cam nh■n m■t tr■ t■ h■u k■t s■ thú nghi■m t■i ýxác n■m t■■ng m■t d■ng v■, là s■ nh■n■■i, website ra mang event kho m■i 1. t■ot■ th■ m■■■ng l■i c■ng ki■m d■n 123doc CH■P ■■u ■■ng vi■n nh■ng cho ti■n h■■ã kh■ng ng■■i NH■N quy■n th■ng thi■t chia t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c.

s■ l■i b■■c v■i■I■U ti■n vàchuy■n t■t công h■n mua 123doc online kh■ng nh■t ■■nh 2.000 ngh■ bán KHO■N sang b■ng luôn cho tài hi■n ng■■i li■u ph■n luôn tài TH■A tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thông dùng. ■■u ■ tin tríhi■n THU■N hi■u c■ c■a ■■i, t■t h■i Khi qu■ mình Vi■t xác c■ khách gia b■n nh■t, minh trong l■nh Nam. t■ng Chào online hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác m■ng tín kho■n tr■ nh■p không tài phong v■c caothành b■n chính ■■n email nh■t. tài online khác chuyên li■u thành tínb■n Mong gì cho d■ng, và v■i so■ã ■■ng nghi■p, viên kinh t■t 123doc.net! v■i mu■n công c■a c■ doanh b■n các hoàn mang ngh■ 123doc ký g■c.

thành v■i h■o, Chúng l■i thông B■n và ■■ ■■n 123doc.netLink cho viên Tính n■p có tôi tin, c■ng c■a cao th■ cung ti■n ngo■i■■ng tính website. phóng th■i vào c■p ■i■m ng■,.Khách trách xác tài D■ch xã to,kho■n th■c nhi■m h■i ■■i thutháng V■ nh■ m■t s■ c■a■■■c (nh■ hàng tùy ■■■c ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ý. cóg■i t■ng th■ tài 123doc v■ mô ■■a nguyên b■n d■ ng■■i t■ dàng s■ v■■t d■■i■■■c tri dùng. ch■ tra■ây) th■c m■c email c■u M■c h■■ng quý 100.000 cho tài b■n tiêu báu, li■u■ã b■n, ■■ng nh■ng hàng ■■u phong m■t l■■t tùyquy■n cách truy thu■c phú, ky,■a c■a c■p chính l■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau xác, các vuingày, n■p lòng “■i■u nhanh giàu■■ng ti■n s■ tr■ giá Kho■n chóng.

h■u trên thành tr■ ■■ng nh■p 2.000 website Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u mình viên mu■n S■ ■■ng online và D■ng click t■o l■n■i■u ký, D■ch vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam,■ây ■ã 200 cho cung các các (sau ■âynh■ng g■iwebsite c■p users ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■ithu li■u t■t■■c nh■t nh■p. T■it■i không t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, ■i■m, vì v■y tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm trên ki■m tôi th■ ■■i racóthu■c tr■■ng th■nh■m c■p top ■áp ngo■i 3nh■t ■KTTSDDV ■ng Google. Nh■n nhu c■utheo chiaquy■t danh s■ tàihi■u .li■udo ch■t c■ng ■■ng l■■ng vàbình ki■mch■n ti■n là online. website ki■m ti■n online hi■u qu■ và uy tín nh■t.

Luônh■n 123doc Th■a Xu■t Sau khi h■■ng phát thu■n cam nh■n m■tt■k■t s■ t■i ýxác n■m t■■ng d■ng là s■ nh■n■■i, website ra mang 1. t■o ■■ng t■l■i c■ng d■n 123doc CH■P ■■u ■■ng nh■ngh■■ã NH■N quy■n th■ng chia t■ng ki■mCÁC s■s■ l■i b■■c■I■U ti■n vàchuy■n t■t mua online kh■ng nh■t bán KHO■N■■nh sang b■ng cho tài ng■■i li■u ph■n tài TH■A v■li■u hàngthông dùng. ■■u tríTHU■N hi■u c■atin Khi qu■ mình Vi■t xác khách nh■t, minh trong Nam. Chào hàng uy tài l■nh Tác m■ng tín kho■n tr■ phong v■c caothành b■n ■■n email nh■t.

tàichuyên li■u thành b■n Mong và v■i ■ã ■■ng nghi■p, viên kinh 123doc.net! mu■n c■a doanh hoàn mang 123doc kýonline. v■i h■o, Chúng l■ivà ■■ ■■n 123doc.netLink cho Tính n■p tôi c■ng cao cung ti■n ■■ng tính th■i vào c■p ■i■m trách xác tài D■ch xãkho■n th■c nhi■m ■■i h■itháng V■m■t s■ c■a■■■c (nh■ ■■■c ngu■n 5/2014; 123doc, v■i g■i t■ng tài 123doc v■ mô ■■a nguyên b■n ng■■i t■s■ v■■t d■■i■■■c tri dùng. ch■ ■ây) th■c m■c email M■c h■■ng quý 100.000 chob■n tiêu báu, ■ã b■n, ■■ng nh■ng hàng ■■u phong l■■t tùyquy■n truy thu■c phú, ky,■a c■a c■pl■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau các vuingày, n■p lòng “■i■u giàu■■ng ti■n s■ tr■ giá Kho■n h■u trên thành tr■ ■■ng nh■p 2.000 website Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u mình viên mu■n S■ ■■ng online và D■ng click t■o l■n■i■u ký, D■ch vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam,■ây ■ã 200 cho cung các các (sau ■âynh■ng g■iwebsite c■p users ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■ithu li■u t■t■■c nh■t nh■p. T■it■i không t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, ■i■m, vì v■y tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm trên ki■m tôi th■ ■■i racóthu■c tr■■ng th■nh■m c■p top ■áp ngo■i 3nh■t ■KTTSDDV ■ng Google.

Nh■n nhu c■utheo chiaquy■t danh s■ tàihi■u .li■udo ch■t c■ng ■■ng l■■ng vàbình ki■mch■n ti■n là online. website ki■m ti■n online hi■u qu■ và uy tín nh■t. Luônh■n Th■a Xu■t Sau Nhi■u 123doc Mangkhi h■■ng phát thu■n l■i event cam s■ nh■n m■t tr■ t■ h■u k■t s■ thú nghi■m t■i ýxác n■m t■■ng m■t d■ng v■, là s■ nh■n■■i, website ra mang event kho m■i 1. t■ot■ th■ m■■■ng l■i c■ng ki■m d■n 123doc CH■P ■■u ■■ng vi■n nh■ng cho ti■n h■■ã kh■ng ng■■i NH■N quy■n th■ng thi■t chia t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c.

s■ l■i b■■c v■i■I■U ti■n vàchuy■n t■t công h■n mua 123doc online kh■ng nh■t ■■nh 2.000 ngh■ bán KHO■N sang b■ng luôn cho tài hi■n ng■■i li■u ph■n luôn tài TH■A tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thông dùng. ■■u ■ tin tríhi■n THU■N hi■u c■ c■a ■■i, t■t h■i Khi qu■ mình Vi■t xác c■ khách gia b■n nh■t, minh trong l■nh Nam. t■ng Chào online hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác m■ng tín kho■n tr■ nh■p không tài phong v■c caothành b■n chính ■■n email nh■t. tài online khác chuyên li■u thành tínb■n Mong gì cho d■ng, và v■i so■ã ■■ng nghi■p, viên kinh t■t 123doc.net! v■i mu■n công c■a c■ doanh b■n các hoàn mang ngh■ 123doc ký g■c.

thành v■i h■o, Chúng l■i thông B■n và ■■ ■■n 123doc.netLink cho viên Tính n■p có tôi tin, c■ng c■a cao th■ cung ti■n ngo■i■■ng tính website. phóng th■i vào c■p ■i■m ng■,.Khách trách xác tài D■ch xã to,kho■n th■c nhi■m h■i ■■i thutháng V■ nh■ m■t s■ c■a■■■c (nh■ hàng tùy ■■■c ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ý. cóg■i t■ng th■ tài 123doc v■ mô ■■a nguyên b■n d■ ng■■i t■ dàng s■ v■■t d■■i■■■c tri dùng. ch■ tra■ây) th■c m■c email c■u M■c h■■ng quý 100.000 cho tài b■n tiêu báu, li■u■ã b■n, ■■ng nh■ng hàng ■■u phong m■t l■■t tùyquy■n cách truy thu■c phú, ky,■a c■a c■p chính l■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau xác, các vuingày, n■p lòng “■i■u nhanh giàu■■ng ti■n s■ tr■ giá Kho■n chóng.

h■u trên thành tr■ ■■ng nh■p 2.000 website Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u mình viên mu■n S■ ■■ng online và D■ng click t■o l■n■i■u ký, D■ch vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam,■ây ■ã 200 cho cung các các (sau ■âynh■ng g■iwebsite c■p users ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■ithu li■u t■t■■c nh■t nh■p. T■it■i không t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, ■i■m, vì v■y tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm trên ki■m tôi th■ ■■i racóthu■c tr■■ng th■nh■m c■p top ■áp ngo■i 3nh■t ■KTTSDDV ■ng Google. Nh■n nhu c■utheo chiaquy■t danh s■ tàihi■u .li■udo ch■t c■ng ■■ng l■■ng vàbình ki■mch■n ti■n là online. website ki■m ti■n online hi■u qu■ và uy tín nh■t.

u■t phát Nhi■u Mang Luôn 123doc Th■a Xu■t Sau khi h■n h■■ng phát thu■n l■i event s■ cam nh■n t■ m■t tr■ t■ h■u ýk■t s■ thú nghi■m t■i ýt■■ng xác n■m t■■ng m■t d■ng v■, là s■ nh■n■■i, website ra mang event t■o kho m■i 1. t■ot■ ■■ng c■ng th■ m■ l■i c■ng ki■m d■n ■■ng 123doc CH■P ■■u ■■ng vi■n nh■ng cho ti■n h■■ã kh■ng ng■■i NH■N quy■n th■ng thi■t chia ki■m t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c. ti■n s■ l■i b■■c v■i■I■U ti■n vàchuy■n t■t công online h■n mua 123doc online kh■ng nh■t ■■nh 2.000 ngh■ bán KHO■N b■ng sang b■ng luôn cho tài hi■n tài ng■■i li■u ph■n luôn tài TH■A li■u tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thông dùng. trí hi■u hi■n■■u ■ tin THU■N hi■u c■ c■a ■■i, qu■ t■t h■i Khi qu■ mình Vi■t xác c■ khách gia nh■t, b■n nh■t, minh trong l■nh Nam.

t■ng Chào online uy hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác tín m■ng tín kho■n tr■ cao nh■p không tài phong v■c caothành b■n chính nh■t.