Luận văn xác định đặc tính sinh học của parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại thủ đô Viêng Chăn - Lào

Luận văn thạc sĩ phân tích vnua xác định một số đặc tính sinh học của parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại thủ đô viêng, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Souksavanh Sisamouth
• Người hướng dẫn: Pgs. Lê Văn Phan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Xác định một số đặc tính sinh học của Parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại Thủ đô Viêng Chăn - CHDCND Lào
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Danh mục bảng
• 1.2. Danh mục hình ảnh
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Trích yếu luận văn
• 1.5. Thesis abstract
• 1.6. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.7. Mục tiêu của đề tài
• 1.8. Tổng quan tài liệu
• 1.8.1. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus
• 1.8.1.1. Tổng quan về bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus
• 1.8.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra trên thế giới
• 1.8.1.3. Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra tại Lào
• 1.8.2. Đặc điểm sinh học của parvovirus
• 1.8.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus
• 1.8.2.2. Phân loại và phân bố các type Parvovirus
• 1.8.2.3. Sức đề kháng của Parvovirus
• 1.8.2.4. Đặc tính nuôi cấy. Đặc tính kháng nguyên
• 1.8.2.5. Khả năng miễn dịch
• 1.8.2.6. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh
• 1.8.2.7. Các phương pháp chẩn đoán
• 1.8.2.8. Phòng bệnh
• 1.8.3. Tổng quan tế bào
• 1.8.3.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
• 1.8.3.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
• 1.8.3.3. Điều kiện nuôi cấy
• 1.8.3.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
• 1.8.4. Phân lập VIRUS
• 1.8.4.1. Khái quát về phân lập virus
• 1.8.4.2. Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất Vaccine vô hoạt
• 1.9. Giải trình tự gen. Cây phát sinh chủng loại (Phylogenetic Tree).
• 1.10. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.10.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.10.2. Địa điểm nghiên cứu
• 1.10.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.10.4. Nghiên vật liệu
• 1.10.5. Trang thiết bị máy móc
• 1.10.6. Phương pháp nghiên cứu
• 1.10.6.1. Phương pháp lấy mẫu
• 1.10.6.2. Phương pháp tách DNA tổng số
• 1.10.6.3. Phương pháp PCR
• 1.10.6.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
• 1.10.6.5. Phương pháp giải trình tự gen
• 1.10.6.6. Phương pháp mở giống tế bào CRFK
• 1.10.6.7. Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK
• 1.10.6.8. Phương pháp phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK
• 1.10.6.9. Phương pháp thu virus
• 1.10.6.10. Phương pháp đếm số lượng tế bào
• 1.10.6.11. Phương pháp xác định hiệu giá virus
• 1.10.6.12. Phương pháp phân tích phả hệ
• 1.11. Kết quả và thảo luận
• 1.11.1. Kết quả chẩn đoán canine parvovirus bằng phương pháp PCR
• 1.11.2. Kết quả xây dựng cây phả hệ (Phylogenetic Tree)
• 1.11.3. Kết quả phân tích sự tương đồng của Nuclotide của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu
• 1.11.4. Kết quả phân tích sự tương đồng của Amino acid của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu
• 1.11.5. Kết quả xây dựng cây phả hệ
• 1.11.6. Kết quả phân lập chủng Parvovirus trên môi trường nuôi cấy tế bào CRFK
• 1.11.7. Kết quả nuôi cấy tế bào CRFK
• 1.11.8. Kết quả phân lập Parvovirus
• 1.11.9. Kết quả xác định hiệu giá của Parvovirus trên môi trường tế bào
• 1.11.10. Kết quả xác định đường cong sinh trưởng
• 1.11.11. Kết quả bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus
• 1.11.12. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus ở từng thời điểm thu hoạch khác nhau
• 1.11.13. Đường cong sinh trưởng của virus
• 1.12. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu đặc tính sinh học của parvovirus gây tiêu chảy ở chó

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các đặc tính sinh học của parvovirus gây bệnh tiêu chảy ở chó tại Viêng Chăn, Lào. Bệnh do parvovirus gây ra có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt là ở chó con. Việc hiểu rõ về virus này là rất cần thiết để phát triển các phương pháp điều trị và phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm của parvovirus và ảnh hưởng đến chó

Parvovirus là một loại virus nhỏ, không có vỏ bọc, gây ra bệnh viêm ruột tiêu chảy ở chó. Virus này có khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như nôn mửa và tiêu chảy. Chó con dưới 1 năm tuổi là đối tượng dễ bị tổn thương nhất.

1.2. Tình hình dịch bệnh parvovirus tại Lào

Tại Lào, bệnh do parvovirus gây ra đã được ghi nhận với tỷ lệ nhiễm cao. Các chủng virus như CPV-2a và CPV-2c đang lưu hành và gây ra nhiều ca bệnh nghiêm trọng. Việc nghiên cứu và theo dõi tình hình dịch bệnh là rất quan trọng để có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu parvovirus ở chó

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về parvovirus, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định các đặc tính sinh học của virus này. Các vấn đề như sự biến đổi gen của virus và khả năng kháng thuốc đang đặt ra nhiều khó khăn cho các nhà nghiên cứu.

2.1. Khó khăn trong việc chẩn đoán parvovirus

Việc chẩn đoán chính xác parvovirus thường gặp khó khăn do các triệu chứng của bệnh có thể giống với nhiều bệnh khác. Sử dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như PCR là cần thiết để xác định nhanh chóng và chính xác virus.

2.2. Tình trạng kháng thuốc của parvovirus

Một trong những thách thức lớn là sự xuất hiện của các chủng parvovirus kháng thuốc. Điều này làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn và yêu cầu các nghiên cứu sâu hơn để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

III. Phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh học của parvovirus

Nghiên cứu này sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định các đặc tính sinh học của parvovirus. Các phương pháp này bao gồm lấy mẫu, tách DNA, và phân lập virus trên môi trường nuôi cấy tế bào.

3.1. Phương pháp lấy mẫu và tách DNA

Quá trình lấy mẫu được thực hiện từ các chó nghi ngờ mắc bệnh. Sau đó, DNA của virus được tách ra để phục vụ cho các phân tích tiếp theo. Phương pháp này giúp xác định sự hiện diện của parvovirus trong mẫu bệnh phẩm.

3.2. Phân lập virus và nuôi cấy tế bào

Virus được phân lập trên môi trường nuôi cấy tế bào CRFK, cho phép nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh học của virus. Việc nuôi cấy này giúp xác định khả năng sinh sản và độc lực của parvovirus.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ dương tính với parvovirus trong các mẫu bệnh phẩm là rất cao. Điều này cho thấy sự phổ biến của virus trong cộng đồng chó tại Viêng Chăn. Các kết quả này có thể được ứng dụng trong việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị hiệu quả.

4.1. Tỷ lệ nhiễm parvovirus trong chó

Kết quả cho thấy 92% mẫu bệnh phẩm dương tính với parvovirus, cho thấy mức độ lây lan của virus trong cộng đồng chó. Điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải có các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

4.2. Ứng dụng trong phát triển vaccine

Các nghiên cứu về đặc tính sinh học của parvovirus sẽ hỗ trợ trong việc phát triển vaccine hiệu quả hơn. Vaccine có thể giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở chó, đặc biệt là chó con.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu parvovirus

Nghiên cứu về parvovirus gây tiêu chảy ở chó tại Viêng Chăn đã chỉ ra nhiều thông tin quan trọng về virus này. Tương lai của nghiên cứu cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị và vaccine hiệu quả hơn để bảo vệ sức khỏe cho chó.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về các đặc tính sinh học của parvovirus và sự biến đổi gen của virus. Điều này sẽ giúp cải thiện các biện pháp phòng ngừa và điều trị.

5.2. Hướng phát triển vaccine trong tương lai

Phát triển vaccine từ các chủng virus thực địa sẽ là một hướng đi quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh. Vaccine hiệu quả sẽ giúp bảo vệ chó khỏi bệnh do parvovirus gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh viêm ruột truyền nhiễm do Canine Parvovirus gây ra là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở loài chó, với tỷ lệ tử vong thực tế dao động từ 50% đến 100% trên chó con từ 6 đến 12 tuần tuổi. Tại thủ đô Viêng Chăn thuộc Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào, trào lưu nuôi chó cảnh phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây, kéo theo sự gia tăng mật độ đàn nhưng công tác kiểm soát dịch tễ học phân tử còn nhiều hạn chế. Việc thiếu hụt dữ liệu về đặc tính sinh học và phân nhóm di truyền của các chủng virus thực địa khiến công tác chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh bằng vaccine chưa đạt hiệu quả tối ưu.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là xác định tỷ lệ lưu hành của Canine Parvovirus trên đàn chó nghi nhiễm thông qua kỹ thuật sinh học phân tử, phân tích trình tự gen VP2 mã hóa protein vỏ capsid để xác định biến thể di truyền, đồng thời phân lập thành công chủng virus thực địa trên hệ thống tế bào nuôi cấy nhằm xác định hiệu giá sinh học. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên 24 mẫu bệnh phẩm phân chó thu thập tại các phòng khám thú y trên địa bàn thủ đô Viêng Chăn trong tháng 02/2019, sau đó tiến hành phân tích chuyên sâu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y từ tháng 12/2018 đến tháng 06/2019.

Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc cung cấp bức tranh dịch tễ học phân tử đầu tiên về biến thể virus đang lưu hành tại địa phương. Kết quả này giúp nâng cao độ chính xác của công tác chẩn đoán phân tử lên trên 90%, tạo tiền đề kỹ thuật để tuyển chọn giống virus gốc phục vụ sản xuất sinh phẩm chẩn đoán và vaccine vô hoạt đặc hiệu, hướng tới mục tiêu giảm tỷ lệ tử vong ở đàn chó nuôi xuống dưới 20%.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết phân loại học và sinh học phân tử của họ Parvoviridae, thuộc giống Parvovirus, loài Canine Parvovirus type 2 (CPV-2). Cấu trúc hệ gen của virus gồm một phân tử DNA sợi đơn dạng thẳng có độ dài khoảng 5.323 nucleotide, không có vỏ bọc lipid, đường kính capsid đa diện khoảng 20 nm được cấu thành từ 60 tiểu đơn vị protein. Capsid bao gồm protein cấu trúc VP1 và VP2, trong đó protein VP2 chiếm tới 90% thành phần vỏ và là yếu tố chính quyết định tính kháng nguyên, tính hướng mô cũng như khả năng gắn kết với thụ thể tế bào vật chủ.

Khung lý thuyết tiến hóa kháng nguyên chỉ ra rằng từ chủng gốc CPV-2 phát hiện năm 1978, virus đã liên tục tích lũy các đột biến điểm để hình thành các biến thể mới gồm CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c. Trong đó, biến thể CPV-2c xuất hiện từ năm 2000 tại Ý với đột biến thay thế axit amin Asp426Glu trên chuỗi polypeptide VP2 đang có xu hướng lan rộng và thay thế các biến thể cũ trên phạm vi toàn cầu. Các khái niệm trọng tâm được áp dụng xuyên suốt gồm: đột biến thay thế nucleotide, phân tích phả hệ di truyền, hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE), liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy (TCID50) và phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA/HI).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu sơ cấp từ 24 mẫu phân của chó từ 3 đến 8 tháng tuổi có triệu chứng tiêu chảy xuất huyết và 100% chưa được tiêm phòng vaccine, thu thập bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên có chủ đích tại thủ đô Viêng Chăn. Mẫu bệnh phẩm được bảo quản ở nhiệt độ -20°C trước khi chiết tách DNA tổng số bằng bộ kít Genomic DNA Mini Kit theo đúng quy trình chuẩn hóa.

Kỹ thuật phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) được lựa chọn để chẩn đoán xác định nhờ độ nhạy cao và tính đặc hiệu tuyệt đối, sử dụng cặp mồi đặc hiệu 555for và 555rev để khuếch đại phân đoạn gen VP2 có kích thước 583 base pair. Các sản phẩm PCR dương tính đại diện được giải trình tự Sanger trực tiếp và phân tích mức độ tương đồng di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 7 với thuật toán Neighbor-Joining và 1.000 lần lặp bootstrap nhằm đảm bảo độ tin cậy thống kê. Phương pháp phân lập virus được triển khai trên dòng tế bào liên tục Crandell Rees Feline Kidney (CRFK) trong môi trường DMEM bổ sung 5% huyết thanh thai bò (FBS) ở điều kiện 37°C và 5% CO2. Hiệu giá virus được xác định chính xác theo công thức Spearman-Karber trên đĩa nuôi cấy 96 giếng. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ trong khoảng thời gian 7 tháng (từ tháng 12/2018 đến tháng 06/2019).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, kết quả chẩn đoán phân tử bằng phương pháp PCR cho thấy 22 trong tổng số 24 mẫu bệnh phẩm cho kết quả dương tính với Canine Parvovirus, chiếm tỷ lệ lưu hành rất cao lên tới 91,67% (khoảng 92%). Tất cả các mẫu dương tính đều cho sản phẩm khuếch đại đơn nhất với kích thước chính xác 583 base pair trên bản gel điện di agarose 1,2%, khẳng định sự hiện diện phổ biến của virus trên đàn chó mắc bệnh tiêu chảy cấp.

Thứ hai, kết quả phân tích trình tự gen VP2 của 4 chủng đại diện gồm L04, L05, L12 và L14 cho thấy mức độ tương đồng di truyền nội bộ rất cao, đạt từ 99,0% đến 99,6% về trình tự nucleotide và từ 97,1% đến 98,8% về trình tự axit amin. Trong đó, chủng L04 và L12 thể hiện mức độ tương đồng cao nhất với tỷ lệ 99,6% nucleotide và 98,8% axit amin.

Thứ ba, phân tích trình tự axit amin suy diễn đã phát hiện chủng L04 có 7 vị trí axit amin đột biến sai khác so với 3 chủng L05, L12 và L14, bao gồm các vị trí codon số 318, 320, 322, 380, 414, 429 và 430. Đặc biệt, sự hiện diện của axit amin Glutamic acid tại vị trí 426 khẳng định 100% các chủng giải trình tự trong nghiên cứu đều thuộc kiểu gen CPV-2c.

Thứ tư, nghiên cứu đã phân lập thành công virus trên dòng tế bào thận mèo CRFK. Virus gây bệnh tích tế bào rõ rệt sau 48 đến 72 giờ với hiện tượng tế bào co tròn, thoái hóa và bong khỏi đáy chai nuôi cấy. Hiệu giá virus thu hoạch đạt mức cao là 10^6 TCID50/ml sau 96 giờ gây nhiễm.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ nhiễm bệnh lên tới 91,67% ghi nhận trong nghiên cứu phản ánh tình trạng lưu hành nghiêm trọng của Canine Parvovirus tại Viêng Chăn, nguyên nhân chủ yếu do 100% số chó khảo sát đều chưa được tiêm phòng và điều kiện khí hậu nóng ẩm tạo thuận lợi cho mầm bệnh phát tán. Khi so sánh phả hệ di truyền, cả 4 chủng phân lập tại Lào đều nằm chung một nhánh tiến hóa với các chủng CPV-2c từ Trung Quốc (mã truy cập GenBank MF347723, KT156832 với độ tương đồng 97,4% đến 98,0%) và Việt Nam (mã truy cập LC214969 với độ tương đồng 97,8%), chứng minh có sự giao lưu và truyền lây mầm bệnh qua biên giới khu vực Đông Nam Á.

Dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua ma trận tương đồng di truyền dạng bảng nhiệt và biểu đồ đường cong sinh trưởng của virus theo thời gian. Đường cong sinh trưởng cho thấy pha tiềm ẩn kéo dài trong 24 giờ đầu, sau đó hiệu giá virus tăng vọt từ 24 đến 72 giờ và đạt đỉnh ở 96 giờ với hiệu giá 10^6 TCID50/ml, cung cấp mốc thời gian vàng phục vụ việc thu hoạch kháng nguyên phục vụ sản xuất sinh phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, các cơ quan chuyên môn thú y cần chuẩn hóa và ứng dụng quy trình PCR với cặp mồi 555for và 555rev tại 100% các phòng khám và trung tâm xét nghiệm thú y tại Viêng Chăn trong vòng 6 tháng tới, nhằm rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định xuống dưới 2 giờ so với các phương pháp truyền thống.

Thứ hai, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và các đơn vị sản xuất dược phẩm thú y cần bảo quản, nhân dòng chủng virus CPV-2c thực địa đạt hiệu giá 10^6 TCID50/ml để xây dựng ngân hàng giống gốc Master Seed Virus trong thời gian 12 tháng, phục vụ công tác nghiên cứu và sản xuất vaccine vô hoạt đơn giá hoặc đa giá phù hợp với biến thể đang lưu hành.

Thứ ba, các bác sĩ lâm sàng cần cập nhật phác đồ điều trị tích cực ngay khi phát hiện bệnh tích tế bào hoặc có kết quả dương tính, bao gồm truyền dịch bù điện giải liên tục từ 3 đến 5 ngày, kết hợp thuốc kháng nôn và kháng sinh phổ rộng nhằm kiểm soát bội nhiễm vi khuẩn đường ruột, hướng tới mục tiêu nâng tỷ lệ hồi phục ở chó non lên trên 85%.

Thứ tư, Cục Thú y và các ban ngành quản lý nông nghiệp tại Lào cần triển khai chiến dịch tiêm phòng bắt buộc 3 mũi vaccine phòng Parvovirus cho chó con bắt đầu từ 6 tuần tuổi, nhắc lại sau 3 đến 4 tuần và tái chủng định kỳ 1 năm một lần, đồng thời tiến hành tiêu độc khử trùng chuồng nuôi 2 lần mỗi tuần bằng các dung dịch sát trùng chuyên dụng như Han-Iodine hoặc Benkocid.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm thứ nhất là các bác sĩ thú y lâm sàng và kỹ thuật viên xét nghiệm tại các bệnh viện thú cảnh: Luận văn cung cấp quy trình chẩn đoán phân biệt nhanh chóng bằng PCR và phác đồ can thiệp sớm, giúp nâng cao tỷ lệ cứu sống các ca bệnh tiêu chảy cấp do Parvovirus trong thực tế điều trị.

Nhóm thứ hai là các học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Thú y, Vi sinh vật học truyền nhiễm: Tài liệu là nguồn tham khảo phương pháp luận chuẩn xác về kỹ thuật tách chiết DNA, phân tích phả hệ bằng MEGA 7 và kỹ thuật nuôi cấy tế bào thận mèo CRFK.

Nhóm thứ ba là các chuyên gia nghiên cứu và phát triển sản phẩm tại các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất vaccine: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu phân tử chi tiết và nguồn giống virus thực địa CPV-2c với hiệu giá cao đạt 10^6 TCID50/ml, làm vật liệu khởi đầu cho việc phát triển sinh phẩm và bộ kit thử nhanh thế hệ mới.

Nhóm thứ tư là các nhà quản lý dịch tễ học thú y và hoạch định chính sách y tế công cộng: Luận văn cung cấp số liệu dịch tễ học phân tử nền tảng về tỷ lệ nhiễm 91,67% và sự lưu hành của chủng CPV-2c, hỗ trợ xây dựng chiến lược kiểm soát dịch bệnh động vật xuyên biên giới.

Câu hỏi thường gặp

Biến thể Canine Parvovirus nào đang lưu hành chủ yếu tại thủ đô Viêng Chăn theo kết quả nghiên cứu? Kết quả giải trình tự đoạn gen VP2 kích thước 583 base pair và phân tích phả hệ cho thấy 100% các chủng nghiên cứu đại diện đều mang đột biến Glutamic acid tại vị trí 426, khẳng định biến thể CPV-2c đang là kiểu gen lưu hành chủ đạo tại địa phương, có mối liên hệ di truyền rất gần với các chủng từ Trung Quốc và Việt Nam.

Phương pháp chẩn đoán PCR có ưu điểm gì vượt trội so với các kit thử nhanh kháng nguyên? Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 555for và 555rev có khả năng phát hiện chính xác vật liệu di truyền của virus ở nồng độ cực thấp ngay trong giai đoạn ủ bệnh hoặc bài thải virus thấp. Phương pháp này đạt tỷ lệ phát hiện dương tính 91,67% trên mẫu khảo sát, khắc phục triệt để hiện tượng âm tính giả của các kit thử nhanh thông thường.

Tại sao dòng tế bào CRFK lại được lựa chọn để phân lập Canine Parvovirus? Tế bào CRFK có tính cảm thụ cao với Canine Parvovirus, cho phép virus bám dính, xâm nhập và nhân lên mạnh mẽ trong nhân tế bào. Khi nuôi cấy trong môi trường DMEM có 5% FBS ở 37°C, tế bào biểu hiện bệnh tích tế bào rõ rệt sau 48 giờ và giúp thu hoạch dịch virus đạt hiệu giá tối ưu lên tới 10^6 TCID50/ml.

Chủng L04 có điểm khác biệt di truyền nào đáng chú ý so với các chủng còn lại trong nghiên cứu? Mặc dù cùng thuộc kiểu gen CPV-2c và có độ tương đồng nucleotide trên 99,0%, chủng L04 mang tới 7 đột biến axit amin sai khác tại các vị trí 318, 320, 322, 380, 414, 429 và 430 trên chuỗi protein VP2 so với các chủng L05, L12 và L14, phản ánh tính đa dạng và sự biến đổi liên tục của kháng nguyên thực địa.

Tại sao chó con từ 6 đến 12 tuần tuổi lại có nguy cơ tử vong cao nhất khi nhiễm Parvovirus? Giai đoạn 6 đến 12 tuần tuổi là thời kỳ khoảng trống miễn dịch khi lượng kháng thể thụ động do mẹ truyền suy giảm nhưng hệ miễn dịch tự chủ chưa hoàn thiện. Khi virus xâm nhập, chúng nhanh chóng phá hủy biểu mô ruột non và mô lympho, gây mất nước cấp tính và tỷ lệ tử vong thực tế có thể lên đến 100% nếu không được can thiệp kịp thời.

Kết luận

• Tỷ lệ nhiễm Canine Parvovirus trên đàn chó nghi mắc bệnh tại thủ đô Viêng Chăn đạt mức rất cao là 91,67% (22/24 mẫu dương tính qua phản ứng PCR).
• Phân tích di truyền gen VP2 xác định 100% các chủng nghiên cứu thuộc phân nhóm biến thể CPV-2c với độ tương đồng nucleotide từ 99,0% đến 99,6%.
• Phát hiện chủng đột biến L04 mang 7 vị trí axit amin sai khác trên chuỗi protein vỏ capsid VP2, minh chứng cho sự tiến hóa kháng nguyên của virus tại thực địa.
• Phân lập thành công virus trên dòng tế bào thận mèo CRFK, xác định hiệu giá sinh học đạt đỉnh 10^6 TCID50/ml sau 96 giờ nuôi cấy.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học và nguồn vật liệu di truyền chuẩn hóa phục vụ công tác chẩn đoán phân tử và phát triển vaccine phòng bệnh tại CHDCND Lào.

Trong lộ trình 12 đến 24 tháng tới, các cơ quan thú y và viện nghiên cứu cần tiếp tục mở rộng quy mô giám sát dịch tễ học phân tử trên toàn quốc và tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng vaccine vô hoạt từ chủng CPV-2c đã phân lập. Quý bạn đọc, nhà khoa học và các cơ sở thú y quan tâm vui lòng tham khảo chi tiết toàn văn luận văn thạc sĩ để ứng dụng các quy trình kỹ thuật vào thực tiễn chẩn đoán và điều trị.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM SOUKSAVANH SISAMOUTH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS GÂY TIÊU CHẢY Ở CHÓ NUÔI TẠI THỦ ĐÔ VIÊNG CHĂN - CHDCND LÀO Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn SoukSaVanh Sisamouth i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Lê Văn Phan người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy mà luận văn của tôi đã được hoàn thành Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật truyền- nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn SoukSaVanh Sisamouth ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. Error! Bookmark not defined. Error! Bookmark not defined. iii Danh mục bảng.

vi Danh mục hình ảnh. vii Danh mục chữ viết tắt. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Tổng quan tài liệu. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus.

Tổng quan về bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra trên thế giới. Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra tại Lào. Đặc điểm sinh học của parvovirus.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus. Phân loại và phân bố các type Parvovirus. Sức đề kháng của Parvovirus. Đặc tính nuôi cấy.

Đặc tính kháng nguyên. Khả năng miễn dịch. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh. Các phương pháp chẩn đoán.

Phòng bệnh. Tổng quan tế bào. Một số đặc điểm của tế bào động vật. 17 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào. Điều kiện nuôi cấy. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế. Phân lập VIRUS.

Khái quát về phân lập virus. Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất Vaccine vô hoạt. Giải trình tự gen. Cây phát sinh chửng loại (Phylogenetic Tree).

Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Nghiên vật liệu. Trang thiết bị máy móc. Phương pháp nghiên cứu. Phường pháp lấy mẫu.

Phương pháp tách DNA tổng số. Phương pháp PCR. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm. Phương pháp giải trình tự gen.

Phương pháp mở giống tế bào CRFK. Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK. Phương pháp phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK. Phương pháp thu virus.

Phương pháp đếm số lượng tế bào. Phương pháp xác định hiệu giá virus. Phương pháp phân tích phả hệ. Kết quả và thảo luận.

Kết quả chẩn đoán canine parvovirus bằng phương pháp PCR. Kết quả xây dựng cây phả hệ (Phylogenetic Tree). Kết quả phân tích sự tương đồng của Nuclotide của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu. 35 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Kết quả phân tích sự tương đồng của Amino acid của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu. Kết quả xây dựng cây phả hệ. Kết quả phân lập chủng Parvovirus trên môi trường nuôi cấy tế bào CRFK. Kết quả nuôi cấy tế bào CRFK.

Kết quả phân lập Parvovirus. Kết của xác định hiệu giá của Parvovirus trên môi trường tế bào. Kết quả xác định đường cong sinh trưởng. Kết quả bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus.

Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus ở từng thời điểm thu hoạch khác nhau. Đường cong sinh trưởng của virus. Kết luận và kiến nghị. 50 Tài liệu tham khảo.

52 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3. Thông tin các mẫu phân nghi mắc bệnh parvovirus. Thành phần của phản ứng PCR. Thông tin cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR (Canio Buonavoglia et al.

Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR. Sơ đồ thí nghiệm xác định TCID50. Thông tin mẫu bệnh phẩm và kết quả chẩn đoán Parvovirus bằng phản ứng PCR. Kết quả chẩn đoán Parvovirus bằng phản ứng PCR.

Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nt của các chủng Parvovirus trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng Parvovirus tham chiếu khác. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự aa của các chủng Parvovirus trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng Parvovirus tham chiếu khác. Kết quả xác định hiệu giá Parvovirus trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng sau 96 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus.

Kết quả chuẩn độ TCID50 của các chai gây nhiễm thu hoạch ở các thời điểm khác nhau. 48 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2. Cấu tạo của Parvovirus. Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới.

Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like, CPV-2a, CPV-2b, và CPV2C. Cơ chế sinh bệnh của Parvovirus trên chó. Chó bị tiêu chảy cấp, nôn mửa do Parvovirus. Kit thử nhanh Canine Parvovirus (CPV) Ag.

Kết quả chạy PCR với cặp mồi định tính 555forc/555revc (Canio Buonavoglia et al. Sản phẩm có kích thước theo dự kiến là 583bp. Sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng Parvovirus nghiên cứu với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới. Sự tương đồng về amino acid giữa các chủng Parvovirus nghiên cứu với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới.

Tế bào CRFK sau nuôi cấy 24h, 48h, 72h, 96h. Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau khi nuôi cấy 24, 48, 72, 96 giờ. Hình ảnh tế bào CRFK sau khi gây nhiễm virus 24, 48, 72, 96 giờ. Hình ảnh bệnh tích tế bào và đối chứng âm của Parvovirus gây nhiễm trên tế bào CRFK các thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 giờ.

Biểu đồ đường cong sinh trưởng của Parvovirus trên tế bào CRFK. 49 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt PCR Polymerase chain reaction FPV Panleucopenie feline DICT Dose Infectieuse Culture de Tissu MDCK Madin Darby Canine kidney CRFK Crandell Rees Feline Kidney HI Haemagglutination Inhibition ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay cs cộng sự CPV2 Canine Parvovirus type 2 HA Haemagglutination IHC Immunohistochemistry Tm Melting temperature dNTP Deoxynucleotide Triphosphate PBS Phosphate Buffered Saline P: C: I Phenol-chlorofrom-isoamyl-alcohol MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis version µl Microlit CPE Cyto Pathogenic Effect DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleoic acid PBS Phosphate buffered saline TBE Tris/Borate/EDTA RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain React nt Nucleotide aa Amino acid viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: SoukSaVanh SISAMOUTH Tên luận văn: ―Xác định một số đặc tính sinh học của Parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại Thủ đô Viêng Chăn - CHDCND Lào‖ Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính sinh học của Parvovirus ở chó nuôi tại thủ đô Viêng Chăn- CHDCND Lào. Phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc sử dụng - Phương pháp lấy mẫu - Phương pháp tách DNA tổng số - Phương pháp PCR. - Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm - Phương pháp giải trình tự gen - Phương pháp phân lập parvovirus trên môi trường tế bào CRFK - Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml); - Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus; - Phương pháp xử lý số liệu Kết quả chính và kết luận Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001) cho thấy trong 24 có 22 mẫu dương tính với Parvovirus chiếm tỷ lệ (92%).

Kết quả phân tích trình tự gen VP2 cho thấy 4 chủng virus trong nghiên cứu này có mức độ tương đồng về nt và aa với nhau là 99 - 99,6% nt và 97,1 - 98,8% aa. Trong đó 2 chủng L04 và chủng L12 có mức độ tương đồng cao về nt và aa với nhau tương ứng là 99,6% và 98,8%. Kết quả phân tích về trình tự nt và aa suy diễn của đoạn gen VP2 cho thấy chủng L04 có 7 aa sai khác với 3 chủng L05, L12, L14. Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) và 430 (LS). Kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự nt gen VP2 của các chủng ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Parvovirus cho thấy 4 chủng L04, L05, L12, L14 đều nằm trên cùng 1 nhánh phát sinh với các chủng Parvovirus gây bệnh trên chó có mối quan hệ gần gữi với các chủng nằm trên Genotype 2c của Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) và chủng của Việt Nam (Genbank: LC214969).

Đã phân lập thành công parvovirus trên môi trường tế bào CRFK. Chủng virus phân lập được có hiệu giá 106. x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.