Luận văn thạc sĩ thiết kế đầu dò adn cho kỹ thuật lai dot blot

Luận văn thạc sĩ về thiết kế đầu dò ADN ứng dụng trong kỹ thuật lai dot blot giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả phân tích mẫu.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hường
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN
• 1.2. NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
• 1.3. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic
• 1.4. Các phương pháp đánh dấu đầu dò
• 1.5. MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
• 1.6. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KỸ THUẬT LAI PHA RẮN
• 1.7. ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
• 1.8. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.8.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 1.8.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế đầu dò
• 2.2. Phương pháp PCR
• 2.3. Quá trình lai điểm
• 2.3.1. Biến tính và cố định ADN trên màng nylon (Roche)
• 2.3.2. Tiền lai và lai
• 2.3.3. Phát hiện đầu dò
• 2.3.4. Quá trình lai điểm ngược
• 2.3.5. Hoạt hóa màng nylon (Pall)
• 2.3.6. Cố định đầu dò trên màng nylon (Pall)
• 2.3.7. Tiền lai và lai
• 2.3.8. Phát hiện đầu dò đánh dấu biotin
• 2.4. Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm
• 2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro
• 2.6. Phương pháp điện di
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM
• 3.1.1. Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M
• 3.2. So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG
• 3.2.1. Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng
• 3.2.2. Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích và trình tự đối chứng
• 3.3. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƯỢC
• 3.3.1. Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin
• 3.3.2. Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngược
• 3.3.3. Kết quả lai điểm ngược phát hiện đột biến trên gen β-globin
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về luận văn thạc sĩ thiết kế đầu dò ADN

Luận văn thạc sĩ về thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot là một nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực di truyền học. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của ADN mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện các đột biến di truyền. Kỹ thuật lai dot blot được biết đến với khả năng phát hiện nhanh chóng và chính xác các trình tự ADN mong muốn, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán bệnh lý.

1.1. Định nghĩa và vai trò của đầu dò ADN trong nghiên cứu

Đầu dò ADN là một đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp với trình tự đích trong quá trình lai. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và định lượng các đoạn ADN cụ thể, từ đó giúp xác định các đột biến di truyền. Việc thiết kế đầu dò ADN chính xác là yếu tố quyết định đến thành công của kỹ thuật lai.

1.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật lai dot blot

Kỹ thuật lai dot blot được phát triển từ những năm 1970 và đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu di truyền. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhiều trình tự ADN cùng lúc, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí trong nghiên cứu. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã làm cho kỹ thuật này ngày càng trở nên phổ biến.

II. Vấn đề và thách thức trong thiết kế đầu dò ADN

Mặc dù kỹ thuật lai dot blot mang lại nhiều lợi ích, nhưng việc thiết kế đầu dò ADN cũng gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như độ dài, tỷ lệ GC, và tính đặc hiệu của đầu dò đều ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng lai. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là rất cần thiết để đạt được độ nhạy và độ chính xác cao trong phát hiện.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của đầu dò ADN

Độ dài của đầu dò ADN thường nằm trong khoảng 18-100 bp. Tỷ lệ GC cũng rất quan trọng, vì tỷ lệ này ảnh hưởng đến độ ổn định của liên kết giữa đầu dò và trình tự đích. Nếu tỷ lệ GC quá thấp, khả năng bắt cặp sẽ giảm, dẫn đến kết quả không chính xác.

2.2. Thách thức trong việc phát hiện đột biến di truyền

Việc phát hiện các đột biến di truyền thông qua kỹ thuật lai dot blot gặp phải nhiều khó khăn. Các đột biến nhỏ có thể không được phát hiện nếu đầu dò không được thiết kế chính xác. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các đầu dò mới với độ nhạy cao là rất cần thiết.

III. Phương pháp thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot

Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot bao gồm nhiều bước quan trọng. Các bước này bao gồm xác định trình tự đích, lựa chọn đầu dò phù hợp, và tối ưu hóa các điều kiện phản ứng. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác.

3.1. Quy trình xác định trình tự đích

Quy trình xác định trình tự đích bắt đầu bằng việc phân tích các đoạn ADN có liên quan đến bệnh lý. Các trình tự này cần được lựa chọn dựa trên các nghiên cứu trước đó và dữ liệu gen hiện có. Việc xác định chính xác trình tự đích là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong thiết kế đầu dò.

3.2. Lựa chọn và tối ưu hóa đầu dò

Sau khi xác định được trình tự đích, bước tiếp theo là lựa chọn đầu dò phù hợp. Đầu dò cần có độ dài và tỷ lệ GC thích hợp để đảm bảo khả năng bắt cặp tốt. Các điều kiện phản ứng cũng cần được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy cao nhất trong phát hiện.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật lai dot blot trong nghiên cứu

Kỹ thuật lai dot blot đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt là trong chẩn đoán bệnh lý di truyền. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến, từ đó hỗ trợ trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kỹ thuật này có thể được áp dụng hiệu quả trong việc xác định các bệnh lý như ung thư, bệnh di truyền, và các bệnh truyền nhiễm.

4.1. Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh lý di truyền

Kỹ thuật lai dot blot đã được sử dụng để phát hiện các đột biến di truyền liên quan đến nhiều bệnh lý khác nhau. Việc phát hiện sớm các đột biến này giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu rủi ro cho bệnh nhân.

4.2. Kết quả nghiên cứu và tiềm năng phát triển

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng kỹ thuật lai dot blot có thể phát hiện đồng thời nhiều đột biến trong một mẫu. Điều này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán. Tiềm năng phát triển của kỹ thuật này trong tương lai là rất lớn, đặc biệt trong lĩnh vực y học cá nhân hóa.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu thiết kế đầu dò ADN

Nghiên cứu thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực di truyền học. Kỹ thuật này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng các đột biến mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và khoa học.

5.1. Tóm tắt những đóng góp của nghiên cứu

Nghiên cứu đã đóng góp vào việc phát triển kỹ thuật lai dot blot, từ đó nâng cao khả năng phát hiện các đột biến di truyền. Những kết quả đạt được sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các đầu dò ADN mới với độ nhạy và độ chính xác cao hơn. Việc áp dụng công nghệ mới trong thiết kế đầu dò cũng sẽ giúp nâng cao hiệu quả của kỹ thuật lai dot blot trong nghiên cứu và chẩn đoán.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh y học hiện đại phát triển nhanh chóng, việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân tử ngày càng trở nên thiết yếu trong chẩn đoán và nghiên cứu bệnh lý. Kỹ thuật lai điểm (dot blot) là một phương pháp lai axit nucleic kinh điển, được sử dụng phổ biến nhờ thao tác đơn giản, chi phí thấp và khả năng xử lý đồng thời nhiều mẫu với nhiều trình tự đích khác nhau. Tại Việt Nam, kỹ thuật này đã được ứng dụng trong định type virus HPV liên quan đến ung thư cổ tử cung, tuy nhiên việc ứng dụng trong phát hiện đột biến di truyền còn hạn chế. Luận văn tập trung thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot nhằm phát hiện sai khác nucleotide trong các bệnh lý di truyền, đặc biệt là bệnh β-thalassemia – một bệnh di truyền phổ biến với tỷ lệ người mang đột biến từ 1,5% đến 25% tại Việt Nam.

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học và các trung tâm nghiên cứu thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong giai đoạn 2011-2013. Mục tiêu chính là thiết lập quy trình lai điểm phân biệt trình tự ADN tương đồng chỉ sai khác nhau tại một số vị trí nucleotide và phát triển kỹ thuật lai điểm ngược (reverse dot blot) để phát hiện các đột biến điểm phổ biến trên gen β-globin. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền tại các phòng thí nghiệm cận lâm sàng, góp phần thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong y học Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc phân tử ADN: ADN là polymer gồm các nucleotide liên kết phosphodieste, với nguyên tắc bổ sung bazơ nitơ (A-T, G-C) tạo thành chuỗi xoắn kép. Sự biến tính và hồi tính của ADN sợi kép là cơ sở cho kỹ thuật lai axit nucleic.
• Nguyên tắc kỹ thuật lai axit nucleic: Phân tử đích (ADN hoặc ARN) được biến tính thành sợi đơn, lai với đầu dò có trình tự tương đồng cao. Đầu dò được đánh dấu bằng các chất như biotin hoặc digoxigenin để phát hiện sự lai.
• Kỹ thuật lai điểm (dot blot) và lai điểm ngược (reverse dot blot): Dot blot cho phép phát hiện trình tự đích trên nhiều mẫu cùng lúc, còn reverse dot blot cố định đầu dò trên màng để phát hiện nhiều trình tự đích trong một mẫu. Kỹ thuật này phù hợp để phát hiện đột biến điểm với độ nhạy và đặc hiệu cao.
• Đặc điểm đầu dò oligonucleotide: Đầu dò dài 18-100 bp, tỷ lệ GC 40-60%, tránh trình tự lặp lại và cấu trúc kẹp tóc để đảm bảo lai đặc hiệu.
• Hệ thống đánh dấu không phóng xạ gián tiếp: Sử dụng biotin liên kết với streptavidin alkaline phosphatase hoặc digoxigenin liên kết với kháng thể anti-DIG để phát hiện tín hiệu màu, an toàn và dễ quan sát.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Sử dụng plasmid chứa các đoạn ADN mẫu (đoạn C, T, M) và 30 mẫu máu người bệnh β-thalassemia được cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương.
• Thiết kế đầu dò: Đoạn M (225 bp, gồm 3 lần lặp lại đoạn 75 bp) làm đầu dò phân biệt đoạn C và T. Ba cặp đầu dò oligo (mỗi cặp gồm đầu dò bình thường và đột biến) được thiết kế để phát hiện đột biến tại codon 17, 26 và 41-42 trên gen β-globin.
• Phương pháp phân tích: Khuếch đại ADN bằng PCR, đánh dấu đầu dò bằng biotin hoặc digoxigenin, lai điểm và lai điểm ngược trên màng nylon Biodyne C đã hoạt hóa bằng EDC. Phát hiện tín hiệu bằng phản ứng enzym alkaline phosphatase với cơ chất tạo màu.
• Cỡ mẫu và chọn mẫu: 30 mẫu bệnh phẩm β-thalassemia được chọn ngẫu nhiên, đảm bảo đại diện cho các đột biến phổ biến tại Việt Nam.
• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ 2011 đến 2013, bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, thiết kế đầu dò, tối ưu hóa điều kiện lai, đánh giá hiệu quả kỹ thuật và ứng dụng trên mẫu thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khuếch đại và đánh dấu đầu dò M thành công: Đoạn M được khuếch đại với kích thước khoảng 380 bp, đánh dấu hiệu quả bằng biotin và digoxigenin, cho tín hiệu rõ ràng trên gel polyacrylamide 8%.
2. Phân biệt trình tự C và T bằng kỹ thuật lai điểm: Đầu dò M đặc hiệu với đoạn C, không lai với đoạn T có 7 nucleotide sai khác, chứng tỏ khả năng phân biệt trình tự tương đồng cao với độ đặc hiệu trên 95%.
3. Phát hiện đồng thời 3 đột biến β-thalassemia bằng lai điểm ngược: Ba cặp đầu dò oligo phát hiện chính xác các đột biến tại codon 17, 26 và 41-42 trên 30 mẫu bệnh phẩm, kết quả tương đồng 100% với phương pháp giải trình tự và PCR đa mồi.
4. So sánh hiệu quả đánh dấu biotin và DIG: Cả hai chất đánh dấu đều cho tín hiệu rõ ràng, tuy nhiên biotin có ưu thế về độ nhạy và dễ sử dụng trong phát hiện enzym.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy kỹ thuật lai điểm và lai điểm ngược với đầu dò oligo được thiết kế phù hợp có thể phát hiện chính xác các đột biến điểm trên gen β-globin, phù hợp với mục tiêu sàng lọc bệnh β-thalassemia. Việc sử dụng màng nylon Biodyne C hoạt hóa bằng EDC giúp cố định đầu dò hiệu quả, tăng độ bền và độ nhạy của phản ứng lai. So với các nghiên cứu trước đây, phương pháp này tiết kiệm chi phí, thao tác đơn giản và có thể xử lý số lượng mẫu lớn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại các nước đang phát triển.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh tín hiệu lai giữa các mẫu đột biến và mẫu bình thường, bảng tổng hợp kết quả lai điểm ngược với kết quả giải trình tự để minh chứng độ chính xác. Kỹ thuật này cũng mở rộng khả năng ứng dụng trong phát hiện các đột biến khác và các bệnh di truyền đa dạng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai kỹ thuật lai điểm ngược trong sàng lọc di truyền tại các bệnh viện: Đào tạo nhân viên kỹ thuật, trang bị thiết bị cần thiết để áp dụng quy trình trong vòng 12 tháng nhằm nâng cao năng lực chẩn đoán sớm bệnh β-thalassemia.
2. Phát triển bộ kit lai điểm ngược đa đột biến: Thiết kế thêm các đầu dò cho các đột biến phổ biến khác trên gen β-globin và các gen liên quan, hoàn thiện bộ kit trong 18 tháng để phục vụ xét nghiệm thường quy.
3. Nâng cao nhận thức và hợp tác nghiên cứu: Tổ chức hội thảo, tập huấn cho các chuyên gia di truyền học và y học phân tử về kỹ thuật lai điểm, thúc đẩy hợp tác nghiên cứu đa trung tâm trong 2 năm tới.
4. Ứng dụng kỹ thuật lai điểm trong các bệnh di truyền khác: Mở rộng nghiên cứu thiết kế đầu dò cho các bệnh di truyền phổ biến khác như α-thalassemia, thiếu hụt men G6PD, nhằm đa dạng hóa ứng dụng kỹ thuật trong 3 năm tiếp theo.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và giảng viên di truyền học: Nắm bắt kỹ thuật lai điểm và lai điểm ngược, áp dụng trong nghiên cứu phát hiện đột biến gen và đào tạo sinh viên.
2. Bác sĩ và kỹ thuật viên phòng xét nghiệm y học phân tử: Áp dụng quy trình lai điểm ngược để chẩn đoán các bệnh di truyền phổ biến, nâng cao hiệu quả xét nghiệm.
3. Các trung tâm sàng lọc di truyền và bệnh viện: Triển khai kỹ thuật để sàng lọc sớm các bệnh di truyền, giảm thiểu chi phí và thời gian xét nghiệm.
4. Công ty công nghệ sinh học và sản xuất kit xét nghiệm: Tham khảo để phát triển bộ kit lai điểm ngược đa đột biến, đáp ứng nhu cầu thị trường trong nước và quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật lai điểm khác gì so với PCR truyền thống?
   Lai điểm cho phép phát hiện nhiều mẫu cùng lúc với chi phí thấp và thao tác đơn giản, trong khi PCR tập trung khuếch đại ADN với độ nhạy cao nhưng thường chỉ xử lý từng mẫu riêng biệt.

2. Đầu dò oligo được thiết kế như thế nào để đảm bảo tính đặc hiệu?
   Đầu dò dài 18-100 bp, tỷ lệ GC 40-60%, tránh trình tự lặp lại và cấu trúc kẹp tóc, đồng thời thiết kế sao cho không có hơn 70% tương đồng với vùng không phải trình tự đích để giảm lai không đặc hiệu.

3. Tại sao sử dụng màng nylon Biodyne C trong kỹ thuật lai điểm ngược?
   Màng nylon Biodyne C có khả năng gắn đầu dò oligo hiệu quả nhờ nhóm carboxyl hoạt hóa, tăng độ bền và độ nhạy của phản ứng lai, đồng thời dễ bảo quản và sử dụng lâu dài.

4. Ưu điểm của đánh dấu biotin so với digoxigenin là gì?
   Biotin có độ nhạy cao, dễ sử dụng với hệ thống streptavidin alkaline phosphatase, cho tín hiệu mạnh và ổn định hơn, phù hợp với nhiều ứng dụng trong phòng thí nghiệm.

5. Kỹ thuật lai điểm ngược có thể áp dụng cho các bệnh di truyền khác ngoài β-thalassemia không?
   Có thể, kỹ thuật này linh hoạt trong thiết kế đầu dò để phát hiện nhiều đột biến điểm khác nhau, phù hợp với các bệnh di truyền đa dạng như α-thalassemia, thiếu hụt men G6PD, xơ nang...

Kết luận

• Thiết kế thành công đầu dò ADN cho kỹ thuật lai điểm phân biệt trình tự tương đồng với độ đặc hiệu cao.
• Thiết lập quy trình lai điểm ngược phát hiện đồng thời ba đột biến phổ biến trên gen β-globin với độ chính xác 100% so với giải trình tự.
• So sánh đánh dấu biotin và digoxigenin cho thấy biotin có ưu thế về độ nhạy và tính tiện dụng.
• Kỹ thuật lai điểm và lai điểm ngược phù hợp để ứng dụng trong sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền tại Việt Nam.
• Đề xuất triển khai kỹ thuật trong các phòng xét nghiệm, phát triển bộ kit đa đột biến và mở rộng ứng dụng cho các bệnh di truyền khác.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các trung tâm y học phân tử áp dụng kỹ thuật lai điểm ngược, đồng thời nghiên cứu mở rộng đầu dò cho các đột biến khác nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và sàng lọc di truyền trong cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, chúng ta đƣợc sống trong thời kỳ với nền y học phát triển nhanh chóng. Sự tiến bộ của y học hiện đại luôn song hành mối liên hệ khăng khít giữa tri thức y học và sự phát triển vƣợt trội trong công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng. Điều này giúp chúng ta có cái nhìn tổng quan hơn về bệnh lý cùng những am hiểu sâu rộng về cơ sở phân tử của bệnh. Trong đó, những hiểu biết về bệnh ở mức độ phân tử hỗ trợ đắc lực trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh và có ý nghĩa đặc biệt trong nghiên cứu các thế hệ thuốc mới - thuốc điều trị đích.

Nền tảng về cơ sở học phân tử của bệnh là yếu tố thúc đẩy những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và ngƣợc lại. Xu hƣớng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lƣợng mẫu phân tích lớn nhƣ: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen. Đáng chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát triển của phƣơng pháp lai ADN. Đây là một kỹ thuật kinh điển nhƣng vẫn đƣợc sử dụng khá phổ biến nhờ vào những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ thao tác đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp, có thể xác định đồng thời nhiều đột biến với số lƣợng mẫu lớn và đặc biệt phù hợp với các nƣớc đang phát triển.

Ở nƣớc ta hiện nay kỹ thuật lai điểm đã đƣợc ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung. Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc xác định những đột biến di truyền vẫn còn rất ít hoặc chƣa đƣợc công bố. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide trong các bệnh lý di truyền. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN Dựa vào hình ảnh nhiễu xạ tia X (Franklin R., 1952) và thông tin bắt cặp các bazơ (Chargaff E., 1950), hai nhà khoa học Watson J. đã đề xuất mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử ADN (1953).

Trƣớc công bố này đã có một số nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tìm hiểu về cấu trúc và chức năng của ADN. Đầu tiên phải kể đến công trình tách chiết ADN từ nhân tinh trùng cá hồi của Miescher F. Cùng thời điểm đó, Mendel G. phát hiện ra quy luật phân ly và tổ hợp của các "nhân tố di truyền" thông qua thí nghiệm lai ở cây đậu Hà Lan.

cung cấp bằng chứng cho thấy ADN mang thông tin di truyền trong thí nghiệm biến nạp ở vi khuẩn [1]. Đến nay, chúng ta đã biết rõ ADN là những phân tử axit nucleic đƣợc tìm thấy trong tế bào của phần lớn các loài sinh vật. Thông tin có mặt trong ADN "chỉ dẫn" tế bào tổng hợp các loại protein quyết định các đặc điểm sinh học và có khả năng di truyền cho thế hệ sau. "Chìa khóa" của tất cả các chức năng đó thể hiện trong cấu trúc của đại phân tử này.

ADN là những phân tử trùng phân (polymer) đƣợc cấu tạo từ các đơn phân (monomer) deoxyribonucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần cơ bản: bazơ nitơ, đƣờng pentose và nhóm phosphate. Trong đó, bazơ nitơ là dẫn xuất của purine gồm adenine (A) và guanine (G), hoặc dẫn xuất của pirimidine gồm thymine (T), cytosine (C). Sự có mặt của nhóm phosphate làm cho các phân tử ADN thƣờng tích điện âm và có tính axit [41].

Bốn loại deoxyribonucleotide trong thành phần ADN khác nhau về loại bazơ nitơ (A, G, T, C), giống nhau về cấu trúc đƣờng pentose và nhóm phosphate. Vị trí các nguyên tử cacbon trên mạch vòng của đƣờng pentose đƣợc đánh số từ 1' đến 5'. Các nucleotide liên kết với nhau bởi cầu nối phosphodieste giữa nhóm hydroxyl ở vị trí 3' với nhóm phosphate ở vị trí 5' của hai phân tử đƣờng [41]. Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Hình 1: (A) Mô hình chuỗi xoắn kép, (B) liên kết hydro và phosphodieste trong phân tử ADN [77].

Trong phân tử ADN sợi đôi, hai mạch polynucleotide liên kết với nhau bởi liên kết hydro hình thành giữa các nucleotide đối diện trên hai mạch theo nguyên tắc bổ sung: giữa A và T có hai liên kết, giữa G và C có ba liên kết (Hình 1) [1]. Liên kết hydro là liên kết hóa học yếu xảy ra giữa nguyên tử hydro và nguyên tử tích điện âm nhiều hơn nhƣ oxy, nitơ và flo. Các nguyên tử tham gia có thể nằm trên cùng một phân tử hoặc trên các phân tử khác. Liên kết hydro có tính định hƣớng, trở nên mạnh nhất khi hai nguyên tử tham gia ở vị trí đối diện trực tiếp với nhau.

Nếu góc liên kết vƣợt quá 300 thì lực liên kết yếu đi nhiều [1]. Vì vậy, để có cấu trúc ADN sợi kép thì một mạch phải chạy theo chiều 5' → 3', còn mạch kia chạy theo chiều ngƣợc lại là 3' → 5'. NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC Phân tử ADN sợi kép có thể tách thành hai mạch đơn dƣới tác dụng của các yếu tố gây biến tính nhƣ kiềm, urê hoặc nhiệt độ cao [68]. Khi đó các liên kết hydro giữa hai mạch đơn bị bẻ gãy nhƣng không ảnh hƣởng tới các liên kết phosphodieste của khung ADN.

Nếu các tác nhân biến tính bị loại bỏ và duy trì điều kiện môi trƣờng thích hợp, hai mạch đơn có thể liên kết tạo cặp trở lại (hồi tính ADN) (Hình Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 2) [4]. Trong trƣờng hợp hai mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tƣơng đồng, chúng có thể bắt cặp tạo nên phân tử lai. Hiện tƣợng tái bắt cặp nhƣ trên đƣợc gọi là quá trình lai phân tử [7]. Đến nay, nhiều kỹ thuật lai đã đƣợc phát triển nhằm phát hiện trình tự quan tâm nhờ tạo ra các phân tử axit nucleic có trình tự tƣơng đồng với nó.

Mức độ tƣơng đồng giữa hai trình tự thể hiện ở nhiệt độ cần thiết để gây biến tính 50% phân tử dạng sợi kép (nhiệt độ nóng chảy Tm - temperature melting) [71]. Giá trị Tm của mỗi phân tử ADN phụ thuộc vào thành phần, tỷ lệ, vị trí sắp xếp của các cặp nucleotide. Nếu có cùng số cặp bazơ, phân tử ADN có tỷ lệ GC càng cao thì Tm càng lớn và ngƣợc lại. Ngoài ra, phân tử ADN có số đoạn trình tự lặp lại càng nhiều thì nhiệt độ biến tính Tm càng giảm.

Nồng độ muối và sự có mặt của các chất gây biến tính nhƣ formamide cũng ảnh hƣởng đến giá trị Tm. Đối với hệ gen của động vật có vú (chứa khoảng 40% GC), ADN bị biến tính ở giá trị Tm xấp xỉ 870C trong điều kiện sinh lý [58]. Thông thƣờng, phản ứng tạo nên phân tử lai đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn Tm 250C. Hình 2: Sự biến tính và hồi tính của phân tử ADN sợi kép [41].

Hiê ̣n nay, kỹ thuật lai đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng để phát hiện sự có mặt , xác định vị trí hoặc định lƣợng đoạn axit nucleic quan tâm [13, 43]. Trình tự axit nucleic quan tâm đƣợc gọi là phân tử đích. Đoạn ADN hoặc ARN có độ tƣơng đồng cao với phân tử đích gọi là đầu dò. Đầu dò đƣợc đánh dấu Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học để phát hiện kết quả lai giữa đầu dò và phân tử đích.

Trong trƣờng hợp phân tử đích hoặc đầu dò ở dạng sợi kép, chúng phải đƣợc tách mạch tạo dạng sợi đơn trƣớc khi tiến hành phản ứng lai. Khi đó, ngoài sự bắt cặp giữa phân tử đích và đầu dò còn có sự tái bắt cặp của các phân tử sợi đôi cùng nguồn gốc (Hình 3). Các bƣớc cơ bản của kỹ thuật lai bao gồm: chuẩn bị và đánh dấu đầu dò, chuẩn bị phân tử đích, biến tính các trình tự ở dạng sợi kép rồi tiến hành lai. Nhƣ vậy, một trong các bƣớc đầu tiên và quan trọng nhất, quyết định đến kết quả của phản ứng lai là thiết kế đầu dò.

Hình 3: Các phân tử sợi kép hình thành trong phản ứng lai axit nucleic [58]. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic Đầu dò là một phân tử axit nucleic có độ tƣơng đồng cao với trình tự đích (ADN hoă ̣c ARN) [5, 8]. Các ADN dùng làm đầu dò phổ biến có nguồn gốc từ ADNc (complementary DNA), ADN tƣơng đồng khác loài hoặc trình tự nucleotide suy diễn dựa vào trình tự axit amin đã biết [58, 65]. Thông thƣờng, trình tự ADN đƣợc nhân dòng trong tế bào chủ, từ đó sản xuất lƣợng lớn đầu dò [53, 65].

Đầu dò Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp nhƣ vậy gọi là đầu dò nhân dòng. Sự ra đời của kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã hỗ trợ đắc lực cho viê ̣c sản xuất đầ u dò bởi có thể đồ ng thời khuế ch đaị và đánh dấ u nhờ sƣ̉ du ̣ng nucleotide đánh dấ u[31, 75]. Một phƣơng pháp khác để sản xuất đầu dò ADN là tổng hợp hóa học (đầu dò oligo) [7, 32]. Mặc dù phƣơng pháp này yêu cầu sự hiểu biết chi tiết về trình tự đích nhƣng đầu dò thu đƣợc ở dạng sợi đơn, không tự bắt cặp bổ sung nên chúng đƣợc sử dụng nhiều hơn đầu dò nhân dòng [11, 37].

Đầu dò oligo đƣợc thiết kế dựa vào các trình tự nằm trong gen hoặc những trình tự có sẵn tuỳ vào mục đích của từng thí nghiệm và các thông tin đã có [51, 58]. Mô ̣t đầ u dò oligo có thể bắ t că ̣p hoàn toàn với trình tự đích và đủ dài để ngăn chặn việc lai không đặc hiệu với những trình tự liên quan khác.