Luận văn thạc sĩ phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cllulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dạ cỏ động vật nhai lại, ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ môi trường hiệu quả.

• Tác giả: Hoàng Hải Yến
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Chí
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose
• 2.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật
• 2.1.2. Vi khuẩn phân giải cellulose
• 2.2. Enzyme từ vi sinh vật
• 2.2.1. Giới thiệu chung về cellulose
• 2.3. Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải
• 2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
• 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu
• 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.1.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
• 3.2.1. Môi trường sử dụng nghiên cứu
• 3.2.2. Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose: môi trường CMC (MT1)
• 3.2.3. Môi trường thử nghiệm khả năng phân giải cellulose (MT2)
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Tiến hành phân lập vi khuẩn
• 3.4.2. Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập
• 3.4.3. Xác định khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn
• 3.4.4. Đo mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD
• 3.4.5. Phương pháp thử khả năng phân giải cellulose bằng phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường thử nghiệm
• 3.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
• 3.4.7. Định danh vi khuẩn
• 3.4.8. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật (nấm mốc)
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose
• 4.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn
• 4.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose
• 4.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện môi trường
• 4.3. Thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon
• 4.4. Thử khả năng đồng hóa nguồn nitơ
• 4.5. Định danh sơ bộ vi khuẩn
• 4.6. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật khác (nấm mốc)
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vi khuẩn phân giải cellulose

Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose, một polysaccharide chính trong thành phần của tế bào thực vật. Cellulose chiếm khoảng 50% tổng số hydratcacbon trong thực vật, và việc phân giải cellulose là rất quan trọng trong chu trình carbon tự nhiên. Vi khuẩn này có thể được chia thành hai loại chính: vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn hiếu khí. Các vi khuẩn kỵ khí như Clostridium cellulovorans và Ruminococcus albus đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại. Vi khuẩn hiếu khí như Bacillus subtilis cũng có khả năng phân giải cellulose nhưng thường được tìm thấy trong môi trường khác. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này từ dạ cỏ động vật nhai lại có thể cung cấp nguồn enzyme cellulase cho nhiều ứng dụng trong công nghiệp và bảo vệ môi trường.

1.1. Tầm quan trọng của vi khuẩn phân giải cellulose

Vi khuẩn phân giải cellulose không chỉ giúp tiêu hóa thức ăn cho động vật nhai lại mà còn có vai trò quan trọng trong việc xử lý rác thải hữu cơ. Chúng giúp chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm dễ tiêu hóa như glucose, từ đó cung cấp năng lượng cho các sinh vật khác trong chuỗi thức ăn. Hơn nữa, enzyme cellulase từ vi khuẩn này có thể được ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, chế biến thực phẩm, và xử lý nước thải. Việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose có thể góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tối ưu hóa quy trình sản xuất trong nhiều lĩnh vực.

II. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

Quá trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dạ cỏ động vật nhai lại bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, mẫu dạ cỏ được thu thập và xử lý trong môi trường nuôi cấy thích hợp, thường là môi trường chứa carboxymethyl cellulose (CMC) để kích thích sự phát triển của vi khuẩn phân giải cellulose. Sau đó, các chủng vi khuẩn được phân lập thông qua các phương pháp như cấy trên môi trường thạch và thử nghiệm hoạt tính enzyme cellulase. Việc xác định khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn được thực hiện bằng cách đo mật độ quang (OD) và thử nghiệm đục lỗ thạch. Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao sẽ được tuyển chọn để nghiên cứu sâu hơn.

2.1. Các phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm

Các phương pháp nuôi cấy vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm cấy trên môi trường thạch và môi trường lỏng. Môi trường thạch cho phép quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, trong khi môi trường lỏng giúp đo lường hoạt tính enzyme. Thử nghiệm đục lỗ thạch là một phương pháp phổ biến để xác định khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ giúp xác định các chủng vi khuẩn tiềm năng cho việc sản xuất chế phẩm sinh học. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng cũng rất quan trọng để đạt được hiệu suất cao nhất trong quá trình phân lập.

III. Ứng dụng của chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose

Chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose có nhiều ứng dụng thực tiễn trong bảo vệ môi trường và sản xuất nông nghiệp. Một trong những ứng dụng quan trọng là trong xử lý rác thải hữu cơ, nơi enzyme cellulase giúp phân hủy cellulose trong các chất thải thực vật, từ đó giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Ngoài ra, chế phẩm này còn có thể được sử dụng trong sản xuất phân bón sinh học, giúp cải thiện chất lượng đất và tăng năng suất cây trồng. Việc ứng dụng enzyme cellulase trong công nghiệp chế biến thực phẩm cũng đang được nghiên cứu để nâng cao hiệu quả sản xuất và chất lượng sản phẩm.

3.1. Lợi ích kinh tế và môi trường

Việc sử dụng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose không chỉ mang lại lợi ích về mặt môi trường mà còn có giá trị kinh tế cao. Chúng giúp giảm chi phí xử lý rác thải và tăng hiệu quả sản xuất trong nông nghiệp. Hơn nữa, việc phát triển các sản phẩm sinh học từ vi khuẩn này có thể tạo ra cơ hội việc làm mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường. Sự phát triển bền vững trong nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm sẽ góp phần quan trọng vào việc bảo vệ tài nguyên thiên nhiên và cải thiện chất lượng cuộc sống.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn

Cellulose là hợp chất hữu cơ phong phú nhất trong sinh quyển, chiếm khoảng 35–50% tổng lượng sinh khối thực vật trên mặt đất. Trong nông nghiệp và sinh hoạt, lượng phế thải chứa cellulose thải ra môi trường rất lớn (rơm rạ, mùn cưa, giấy vụn, bã nông sản). Do cấu trúc polymer mạch thẳng gồm các gốc $\beta$-D-glucose liên kết chặt chẽ bằng liên kết hydro và liên kết $\beta$-1,4-glucoside, các chất thải hữu cơ chứa cellulose rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên, thường mất hơn tám tháng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới. Nếu bổ sung chế phẩm vi sinh vật giàu enzyme cellulase, thời gian phân hủy có thể rút ngắn chỉ còn khoảng một tháng.

Động vật nhai lại (trâu, bò) sở hữu dạ cỏ với dung tích lớn (60–100 lít), môi trường đệm ổn định (pH 6,4–7,5, nhiệt độ 39–41°C, độ ẩm 80–90%), tạo điều kiện tối ưu cho hệ vi sinh vật cộng sinh phát triển với mật độ $10^9 - 10^{10}$ tế bào/gam chất chứa. Nhờ hệ enzyme do vi sinh vật tiết ra, dạ cỏ có thể phân giải 60–65% lượng cellulose của thức ăn thô chỉ trong vòng 48 giờ. Do đó, việc khai thác, phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí bản địa từ dịch dạ cỏ để sản xuất chế phẩm sinh học là hướng đi thiết thực nhằm giải quyết bài toán ô nhiễm môi trường và tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao từ dịch dạ cỏ của động vật nhai lại, hướng tới ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ công tác xử lý chất thải và bảo vệ môi trường.

Yêu cầu và nhiệm vụ nghiên cứu

Văn bản xác định 4 nhiệm vụ cụ thể:

1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ dịch dạ cỏ động vật nhai lại (trâu, bò).
2. Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi cấy (nguồn cacbon, nguồn nitơ) nhằm tăng sinh khối và thu nhận chế phẩm enzyme.
3. Định danh sơ bộ chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và tính chất hóa sinh (nhuộm Gram).
4. Thử nghiệm khả năng nuôi cấy kết hợp giữa chủng vi khuẩn tuyển chọn với các chủng vi sinh vật khác (nấm mốc Aspergillus M17C).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn phân giải cellulose có trong dịch dạ cỏ của động vật nhai lại (trâu, bò).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 05/2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và mô hình khoa học

Khóa luận xây dựng trên các cơ sở lý thuyết vi sinh học và hóa sinh học chuyên ngành:

• Cấu trúc phân tử cellulose: Polymer mạch thẳng tạo thành từ 2.000–4.000 đơn vị $\beta$-D-glucose gắn với nhau qua liên kết $\beta$-1,4-glucoside. Đơn vị cấu trúc cơ bản là disaccharide cellobiose. Các chuỗi polymer liên kết với nhau bằng cầu hydro tạo thành các bó sợi microfibril bền vững.
• Phức hệ enzyme cellulase: Gồm 3 nhóm enzyme chính phối hợp tác động:
  1. Endo-$\beta$-D-glucanase (Endoglucanase / $C_x$): Cắt ngẫu nhiên các liên kết $\beta$-1,4 nội mạch trong vùng vô định hình, tạo ra các chuỗi oligosaccharide ngắn.
  2. Exo-$\beta$-D-glucanase / Cellobiohydrolase ($C_1$): Cắt dần từ đầu không khử của chuỗi cellulose giải phóng disaccharide cellobiose.
  3. $\beta$-glucosidase: Thủy phân cellobiose và cellodextrin thành monosaccharide glucose.
• Mô hình phân giải cellulose: Tác giả áp dụng sơ đồ cơ chế phân giải của Srinivasan (1973) để mô tả quá trình chuyển hóa từ cellulose tự nhiên qua dạng cellulose vô định hình, cellobiose đến glucose và cuối cùng thành các axit béo bay hơi (axetic, propionic, butyric, valeric).
• Hệ vi sinh vật dạ cỏ: Tổng quan về 3 nhóm vi sinh vật chính trong dạ cỏ gồm vi động vật (protozoa/tiên mao trùng), nấm dạ cỏ (Caecomyces, Neocallimastix, Piromyces) và vi khuẩn ($10^9 - 10^{10}$ tế bào/g, gồm các chi Butyrivibrio, Fibrobacter, Ruminococcus, Clostridium, Bacillus, Cellulomonas).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp phân lập và giữ giống: Pha loãng mẫu dịch dạ cỏ theo nồng độ bậc 10 (từ $10^{-1}$ đến $10^{-9}$), cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường thạch CMC, ủ ở 30°C trong 24–48 giờ. Cấy chuyển khuẩn lạc thuần khiết sang ống thạch nghiêng, cấy truyền định kỳ 2 tuần/lần và bảo quản giống ở 4–5°C.
• Phương pháp xác định hoạt tính cellulase:
  • Phương pháp đục lỗ thạch sơ bộ: Tạo lỗ thạch trên đĩa môi trường CMC, tra dịch nuôi cấy ($20,\mu\text{l}$), ủ 48 giờ ở 30°C, quan sát đường kính vòng phân giải.
  • Phương pháp thử nghiệm trên lá cỏ: Đánh giá khả năng phân hủy trực tiếp mô thực vật và xác định độ ẩm mẫu cỏ bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở 105°C; tính toán lượng nước bổ sung theo công thức cân bằng ẩm.
  • Phương pháp đục lỗ thạch với dịch enzyme thô: Đồng hóa sinh khối, ly tâm $3.000\text{ vòng/phút}$ trong 15 phút ở 30°C để thu dịch enzyme; tra $100,\mu\text{l}$ dịch enzyme vào giếng thạch ($d = 8\text{ mm}$), giữ ở 4°C trong 2 giờ để khuếch tán, ủ ở 30°C trong 24 giờ; hiện màu bằng thuốc thử Lugol (chứa $\text{I}_2/\text{KI}$); đo hiệu số đường kính vòng phân giải ($D - d$, tính bằng cm).
• Phương pháp theo dõi động thái tăng sinh: Nuôi cấy lắc trong môi trường CMC lỏng ở 37°C, tốc độ $100\text{ r/min}$, đo mật độ quang (OD) ở bước sóng $\lambda = 590\text{ nm}$ định kỳ mỗi 3 giờ từ 0 đến 36 giờ.
• Phương pháp tối ưu hóa môi trường nuôi cấy: Thay thế CMC bằng các nguồn cacbon đơn giản (glucose, saccharose từ 0,1g đến 1,0g) và bổ sung nguồn nitơ $(\text{NH}_4\text{NO}_3$ từ 0,25g đến 1,0g).
• Phương pháp định danh và nuôi cấy kết hợp: Nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi; nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn chọn lọc với nấm mốc Aspergillus M17C trên môi trường CMC, đếm khuẩn lạc (CFU/ml) theo phương pháp tiêu chuẩn ở các mốc thời gian 12h, 24h, 36h, 48h.
• Phương pháp xử lý số liệu: Thống kê sinh học bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2003.

Môi trường và hóa chất sử dụng

Loại môi trường / Hóa chất	Thành phần định lượng cho 1 lít	Thông số kỹ thuật
Môi trường CMC phân lập (MT1)	$(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$: 1,0 g; $\text{K}_2\text{HPO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$: 0,5 g; $\text{NaCl}$: 0,001 g; Carboxymethyl cellulose (CMC): 10,0 g; Agar: 15,0 g; Nước cất vừa đủ 1.000 ml.	$\text{pH} = 7,0$
Môi trường thử hoạt tính (MT2)	$\text{NaNO}_3$: 3,5 g; $\text{K}_2\text{HPO}_4$: 1,5 g; $\text{MgSO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$: 0,01 g; Agar: 20,0 g; Nước biển: 1.000 ml.	$\text{pH} = 6,5$
Thuốc thử Lugol	Nghiền 2 g $\text{KI}$ với 5–10 ml nước cất, hòa tan 1 g $\text{I}_2$, định mức đến 300 ml bằng nước cất, trữ trong lọ tối màu.	Phát hiện vòng phân giải

---

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của việc tận dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp giàu cellulose tại Việt Nam; phân tích vai trò của enzyme cellulase trong các ngành công nghiệp chế biến, dệt may, sản xuất nhiên liệu sinh học và xử lý môi trường. Xác định mục tiêu, yêu cầu kỹ thuật, ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn của đề tài trong việc nghiên cứu hệ vi khuẩn từ dạ cỏ động vật nhai lại.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tổng hợp toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về vi sinh vật và phức hệ enzyme cellulase:

• Hệ thống hóa các chủng vi khuẩn, nấm sợi và xạ khuẩn có khả năng phân hủy cellulose (như Bacillus subtilis, Cellulomonas fimi, Clostridium thermocellum, Ruminococcus albus, Trichoderma reesei, Aspergillus niger).
• Phân tích cấu trúc phân tử của enzyme cellulase, trong đó nhấn mạnh vai trò của vùng liên kết cellulose (Cellulose Binding Domain – CBD) giúp enzyme bám dính và xúc tác cắt đứt cấu trúc tinh thể cellulose.
• Nêu các nghiên cứu quốc tế tiêu biểu: Aihemaiti và cộng sự phân lập 84 chủng vi khuẩn từ dạ cỏ bò, cừu, lạc đà tại Tân Cương (Trung Quốc); Liang YL và cộng sự phân lập 245 chủng vi khuẩn hiếu khí tại khu bảo tồn cận nhiệt đới.
• Điểm qua tình hình trong nước: Nghiên cứu của Hà Thanh Toàn (Cần Thơ), Trịnh Đình Khá, Hoàng Quốc Khánh và Nghiêm Ngọc Minh về các chủng nấm sợi, xạ khuẩn phân giải cellulose.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn mẫu sinh học (dịch dạ cỏ trâu bò thu thập tại Thái Nguyên), hệ thống trang thiết bị thí nghiệm (máy đo quang phổ UV-VIS Labomed, tủ ấm Mitecom, máy lắc Jing Hong, tủ cấy Airtech, máy đo pH Hanna). Thiết lập quy trình 4 bước phân lập thuần khiết, công thức chuẩn bị môi trường CMC lỏng và đặc, công thức tính toán độ ẩm cơ chất, phương pháp đếm khuẩn lạc gián tiếp (CFU/ml), kỹ thuật đục lỗ thạch xác định chỉ số $D - d$ và phương pháp nuôi cấy kết hợp với nấm mốc.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình sàng lọc, tuyển chọn và tối ưu hóa môi trường:

• Từ các mẫu dịch dạ cỏ ban đầu, phân lập được 25 chủng vi khuẩn thuần khiết (ký hiệu T1, T2, B1 đến B23).
• Sơ tuyển hoạt tính phân giải cellulose trên môi trường CMC xác định được: 2 chủng không có hoạt tính (B19, B23), 8 chủng hoạt tính yếu (+), 12 chủng hoạt tính trung bình (++), và 3 chủng có hoạt tính mạnh (+++) gồm B12, B15, B20.
• Theo dõi động thái tăng trưởng (OD590) trong 36 giờ của 25 chủng: Các chủng đều bước vào pha cân bằng động trong khoảng 30–36 giờ nuôi cấy. Trong đó, 3 chủng B12, B15 và B20 có tốc độ sinh trưởng cao và mật độ quang tăng đều nhất (B20 đạt $\text{OD} = 0,390$; B15 đạt $\text{OD} = 0,350$; B12 đạt $\text{OD} = 0,341$ ở 36h).
• Đánh giá hoạt tính cellulase của dịch enzyme thô bằng phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường thử nghiệm: Hiệu số đường kính vòng phân giải ($D - d$) của chủng B12 đạt 1,2 cm, B15 đạt 1,0 cm và B20 đạt 1,2 cm. Chủng B20 được chọn là chủng tối ưu cho các khảo sát tiếp theo do ưu thế về khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme.
• Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn cacbon (glucose, saccharose) và nguồn nitơ $(\text{NH}_4\text{NO}_3)$ vào môi trường cơ bản để tối ưu hóa quá trình tích lũy sinh khối.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các kết quả đạt được về số lượng chủng phân lập, định danh sơ bộ và các thông số tối ưu của chủng vi khuẩn B20; kiến nghị các nội dung nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học.

---

Kết quả và đóng góp thực tiễn

Kết quả định lượng chính từ thực nghiệm

1. Kết quả phân lập và sàng lọc sơ bộ: Đã phân lập thành công 25 chủng vi khuẩn từ dịch dạ cỏ trâu, bò. Đa số các chủng có khuẩn lạc hình tròn hoặc bầu dục nhỏ li ti, mặt trơn mịn, màu trắng sữa hoặc trắng ngà.

Phân loại hoạt tính cellulase	Ký hiệu quy ước	Số lượng chủng	Danh sách chủng
Không có hoạt tính	$-$	2	B19, B23
Hoạt tính yếu	$+$	8	T1, T2, B4, B6, B8, B9, B10, B11
Hoạt tính trung bình	$++$	12	B1, B2, B3, B5, B7, B13, B14, B16, B17, B18, B21, B22
Hoạt tính mạnh	$+++$	3	B12, B15, B20

2. Khảo sát mật độ quang học (OD590) của các chủng vi khuẩn tiêu biểu: Quá trình theo dõi mật độ tế bào ở bước sóng 590 nm trong 36 giờ nuôi lắc cho thấy sự khác biệt rõ nét giữa các chủng:

Chủng vi khuẩn	0h	6h	12h	18h	24h	30h	36h	Nhận xét động thái
B12	0,152	0,202	0,259	0,296	0,299	0,316	0,341	Tăng trưởng nhanh, đều
B15	0,105	0,189	0,194	0,228	0,308	0,342	0,350	Tăng mạnh từ sau 18h
B20	0,199	0,247	0,303	0,321	0,333	0,373	0,390	Mật độ cao nhất toàn bộ dải đo
B10 (yếu)	0,072	0,073	0,080	0,089	0,098	0,107	0,103	Tăng sinh rất kém
B16 (trung bình)	0,121	0,124	0,144	0,146	0,134	0,133	0,125	Đạt đỉnh sớm rồi suy thoái

3. Hoạt tính enzyme cellulase của 3 chủng triển vọng: Thử nghiệm đục lỗ thạch với dịch enzyme ly tâm ($3.000\text{ vòng/phút}$) cho kết quả đường kính vòng thủy phân ($D - d$):
   • Chủng B12: $D - d = 1,2\text{ cm}$ ($12\text{ mm}$).
   • Chủng B15: $D - d = 1,0\text{ cm}$ ($10\text{ mm}$).
   • Chủng B20: $D - d = 1,2\text{ cm}$ ($12\text{ mm}$).

Giải pháp và đóng góp của đề tài

• Đóng góp học thuật: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn B20 từ hệ vi sinh vật dạ cỏ bản địa tại vùng Thái Nguyên có khả năng đồng hóa cellulose trên môi trường CMC và thích ứng tốt trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm.
• Giá trị ứng dụng: Cung cấp nguồn giống vi sinh vật có hoạt tính sinh học ổn định làm tiền đề để phối trộn với nấm mốc sinh cellulase (như Aspergillus M17C), hướng tới chế tạo chế phẩm sinh học xử lý nhanh rác thải nông nghiệp và bảo vệ môi trường nông thôn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Mức độ định danh chủng vi khuẩn mới dừng lại ở bước phân loại sơ bộ dựa trên hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào qua nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa cơ bản, chưa thực hiện giải trình tự gene 16S rRNA để xác định chính xác tên loài và vị trí phân loại học.
• Hoạt tính enzyme cellulase mới được đánh giá định tính và bán định lượng qua đường kính vòng phân giải ($D - d$), chưa tiến hành tinh sạch enzyme và chưa định lượng hoạt độ enzyme bằng các đơn vị hoạt độ chuẩn (như phương pháp đo lượng đường khử giải phóng DNS theo đơn vị U/ml).
• Thử nghiệm nuôi cấy kết hợp và lên men tạo chế phẩm mới thực hiện ở quy mô bình tam giác trong phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ trên quy mô đống ủ thực địa.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiến hành phân tích sinh học phân tử (tách chiết ADN, phản ứng PCR và giải trình tự gene 16S rRNA) để định danh chính xác đến mức loài cho chủng vi khuẩn B20.
• Nghiên cứu tinh sạch phức hệ enzyme cellulase, khảo sát các thông số động học enzyme ($K_m, V_{max}$), pH tối thích, nhiệt độ tối thích và tính bền nhiệt của enzyme.
• Hoàn thiện công thức phối chế đa chủng vi sinh vật (vi khuẩn B20 và nấm sợi Aspergillus M17C), tối ưu hóa chất mang (chất độn hữu cơ/khoáng) để tạo chế phẩm sinh học dạng bột hoặc dạng lỏng có thời hạn bảo quản cao, ứng dụng thử nghiệm xử lý rơm rạ và bã thải hữu cơ quy mô bán công nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn trong các lĩnh vực:

• Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh vật học, Khoa học Môi trường và Chăn nuôi – Thú y.
• Nội dung tham khảo hữu ích:
  • Quy trình kỹ thuật chi tiết về lấy mẫu, bảo quản dịch dạ cỏ và phân lập vi sinh vật kỵ khí/hiếu khí trên môi trường tuyển chọn CMC.
  • Bộ công thức môi trường chuyên dụng (môi trường CMC MT1, môi trường MT2 thử hoạt tính trong nước biển nhân tạo) và quy trình thử hoạt tính cellulase bằng kỹ thuật đục lỗ thạch xử lý bằng Lugol.
  • Chuỗi dữ liệu thực nghiệm về động thái tăng trưởng (giá trị OD590) của 25 chủng vi khuẩn dạ cỏ, làm tài liệu đối sánh cho các nghiên cứu sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tác giả đã phân lập được bao nhiêu chủng vi khuẩn và có bao nhiêu chủng thể hiện hoạt tính phân giải cellulose?
Từ mẫu dịch dạ cỏ trâu bò, tác giả phân lập được tổng cộng 25 chủng vi khuẩn (ký hiệu từ T1 đến T2, B1 đến B23). Qua kiểm tra sơ bộ trên môi trường CMC, có 23 chủng thể hiện khả năng phân giải cellulose ở các mức độ khác nhau và 2 chủng hoàn toàn không có hoạt tính (B19 và B23).

2. Tiêu chí nào được dùng để tuyển chọn chủng vi khuẩn tối ưu nhất trong nghiên cứu?
Việc tuyển chọn trải qua 3 bước đánh giá liên tiếp: (1) Khảo sát sơ bộ vòng phân giải và khả năng làm thay đổi màu sắc mô lá cỏ; (2) Đo mật độ quang học OD ở bước sóng 590 nm từ 0h đến 36h để chọn các chủng có tốc độ sinh trưởng mạnh nhất; (3) Đo hiệu số đường kính vòng phân giải ($D - d$) của dịch enzyme thô sau ly tâm bằng phương pháp đục lỗ thạch. Kết hợp các tiêu chí trên, chủng B20 được chọn vì đạt giá trị OD590 cao nhất (0,390 ở 36h) và có hiệu số $D - d = 1,2\text{ cm}$.

3. Vì sao môi trường dạ cỏ động vật nhai lại được chọn làm nguồn phân lập vi khuẩn phân giải cellulose?
Dạ cỏ có dung tích lớn (60–100 lít), độ ẩm cao (80–90%), pH ổn định (6,4–7,5) nhờ hệ đệm nước bọt, nhiệt độ thích hợp (39–41°C) và chứa mật độ vi khuẩn rất lớn ($10^9 - 10^{10}\text{ tế bào/g}$). Hệ vi sinh vật dạ cỏ có khả năng phân giải 60–65% lượng cellulose của thức ăn thô chỉ trong vòng 48 giờ, tạo nguồn cung cấp các chủng vi khuẩn sinh cellulase mạnh.

4. Môi trường CMC (MT1) dùng để phân lập vi khuẩn có thành phần hóa học gồm những gì?
Theo bảng công thức của đề tài, 1 lít môi trường CMC (MT1) có $\text{pH} = 7,0$, bao gồm: 1,0 g $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$; 0,5 g $\text{K}_2\text{HPO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$; 0,001 g $\text{NaCl}$; 10,0 g Carboxymethyl cellulose (CMC) và 15,0 g Agar.

5. Đề tài đã thử nghiệm nuôi cấy kết hợp chủng vi khuẩn tuyển chọn với vi sinh vật nào?
Tác giả đã tiến hành thử nghiệm nuôi cấy kết hợp chủng vi khuẩn B20 tuyển chọn với chủng nấm mốc Aspergillus (ký hiệu M17C) trên môi trường CMC ở độ pha loãng $10^{-8}$, theo dõi mật độ và sự phát triển của khuẩn lạc ở các mốc thời gian 12h, 24h, 36h và 48h để đánh giá khả năng cộng sinh không đối kháng giữa hai loài.

---

Kết luận

Khóa luận của sinh viên Hoàng Hải Yến đã hoàn thành các mục tiêu thực nghiệm về phân lập và sàng lọc hệ vi khuẩn phân giải cellulose từ dịch dạ cỏ trâu, bò tại tỉnh Thái Nguyên. Qua quy trình đánh giá đa chỉ tiêu từ mật độ tăng sinh OD590 đến thử nghiệm khuếch tán enzyme qua lỗ thạch, nghiên cứu đã chọn lọc được chủng vi khuẩn triển vọng B20 có hoạt tính cellulase ổn định ($D - d = 1,2\text{ cm}$) và khả năng sinh trưởng vượt trội. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu vi sinh học thực nghiệm và nguồn giống tiềm năng phục vụ việc nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học xử lý rác thải hữu cơ trong công tác bảo vệ môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, ngành Công nghệ Sinh học đang phát triển rất mạnh mẽ, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực của đời sống như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế [26, 27]. Một số enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay như protease, amylase, pectinase, glucooxydase, cellulase. Trong số đó cellulase là enzyme nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì chúng có thế ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau như trong quá trình chuyển hóa chất liệu chứa cellulose, công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trường [7, 23]. Đặc biệt trong ngành công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học, cellulase đang được nghiên cứu và phát triển để giải quyết vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [28].

Nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú, khoảng một nửa hợp chất cacbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 35-50% lượng sinh khối thực vật. Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật. Hệ thống phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn. Tuy nhiên trong khoảng thời gian ngắn (48h) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ (vi khuẩn kỵ khí) có thể phân giải 60 - 65 % cellulose [4].

Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đã và đang rất được quan tâm. n 2 Từ những luận điểm trên chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường”. Mục tiêu của đề tài Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu những loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại, ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường. Yêu cầu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dịch dạ cỏ động vật nhai lại.

- Tối ưu hóa điều kiện lên men để thu sinh khối và thu chế phẩm enzyme. - Định danh sơ bộ về chủng vi khuẩn mà mình phân lập được dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải… - Thử khả năng khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật khác. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học.

- Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học trong bảo vệ môi trường. - Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực.

n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose 2. Giới thiệu về vi sinh vật [12] Vi sinh vật là một thế giới sinh vật vô cùng nhỏ bé mà ta không thể quan sát bằng mắt thường. Nó phân bố ở khắp mọi nơi, trong đất, trong nước, trong không khí, trong thực phẩm… Vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng trong thiên nhiên cũng như trong cuộc sống của con người, từ xa xưa, con người ta đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hàng ngày như làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm và các quá trình làm rượu.

Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi sinh vật thì nó được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả hơn, ví dụ như chế vacxin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh và các dược phẩm quan trọng khác, vi sinh vật được ứng dụng trong bảo vệ môi trường, chế tạo phân bón sinh học thuốc bảo vệ thực vật không gây độc hại cho môi trường, bảo vệ cân bằng sinh thái. Ngoài những vi sinh vật có lợi còn có một số vi sinh vật gây hại gây bệnh cho người, động vật, thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô nhiễm các nguồn nước, đất và không khí… • Định nghĩa Vi sinh vật là những cơ thể vô cùng nhỏ bé, mà mắt thường không nhìn thấy được, chỉ có thể quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi. • Ứng dụng của vi sinh vật. - Trong lĩnh vưc y tế: công nghệ vi sinh đã đóng góp trong việc tìm kiếm nhiều loại dược phẩm quan trọng, chuẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh hiểm nghèo cho con người, gia súc, gia cầm như vacxin, insulin, interferon, chất kháng sinh.

n 4 - Trong lĩnh vực nông nghiệp: cải tạo giống cây trồng, sản xuất chế phẩm (phân bón), sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong bảo vệ thực vật. - Trong lĩnh vực bảo quản chế biến: hệ vi sinh vật trong thực phẩm và công nghệ bảo quản chế biến thực phẩm. - Trong lĩnh vực công nghiệp: ứng dụng vi sinh vật lên men, nhân sinh khối tế bào sản phẩm như sản xuất protein đơn bào, sản xuất bột ngọt, bia, rượu, cồn, nước ngọt có ga. - Trong vấn đề năng lượng và bảo vệ môi trường: sản xuất cồn làm nguồn năng lượng thay xăng dầu chạy xe các loại, tạo khí sinh học (biogas), trong bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi trường.

Trong vấn đề bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong việc xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi trường. Đây là vấn đề cấp thiết trên toàn cầu hiện nay. Vi khuẩn phân giải cellulose 2. Dạ cỏ động vật nhai lại Dung tích dạ cỏ khoảng 60÷100 lít, niêm mạc dạ cỏ có nhiều gờ nổi lên làm tăng thêm diện tích.

Dạ cỏ không có tuyến bài tiết HCL và dịch vị mà chỉ tiết dịch nhày. Tiêu hóa trong dạ cỏ chủ yếu nhờ enzyme của vi sinh vật cư trú trong đó. Môi trường dạ cỏ với các đặc điểm thiết yếu cho sự lên men vi sinh vật đó là: có độ ẩm cao (80-90%), độ pH cao (6,4-7,5), độ pH dạ cỏ tương đối ổn định, luôn luôn được đệm bởi bicarbonate và phosphates của nước bọt, nhiệt độ khoảng 39-410C, luôn luôn được nhào trộn bởi sự co bóp của dạ cỏ, dòng dinh dưỡng lưu thông liên tục. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ra khỏi dạ cỏ và các cơ chất được nạp vào thông qua thức ăn ăn vào hàng ngày, n 5 có sự chế tiết vào dạ cỏ những chất cần thiết cho vi sinh vật phát triển và khuếch tán ra ngoài những sản phẩm tạo ra trong dạ cỏ.

Ðiều này làm cho áp suất thẩm thấu của dạ cỏ luôn ổn định. Thời gian thức ăn tồn lưu trong dạ cỏ kéo dài tạo điều kiện cho vi sinh vật công phá. Những điều kiện đó là lý tưởng cho sự phát triển của vi sinh vật dạ cỏ. Ðiều này được đánh giá bởi sự phong phú về chủng loại và mật độ vi sinh vật.

Môi trường dạ cỏ được kiểm soát và điều khiển bởi nhiều yếu tố như: số lượng và chất lượng thức ăn ăn vào, nhào trộn theo chu kỳ thông qua co bóp dạ cỏ, nước bọt và nhai lại, khuyếch tán và chế tiết vào dạ cỏ, hấp thu dinh dưỡng từ dạ cỏ, chuyển dịch các chất xuống bộ máy tiêu hóa [1]. Hệ vi sinh vật dạ cỏ Hệ vi sinh vật cộng sinh trong dạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và thường gọi chung là vi sinh vật dạ cỏ. Hệ vi sinh vật dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là: vi thực vật, nấm và vi động vật. • Vi động vật: số lượng 200.000/ml, chủ yếu là động vật nguyên sinh, quan trọng nhất là lớp tiên mao trùng, giống Entodinium diplodinium có số lượng lớn nhất.

• Nấm: gồm nấm men và nấm mốc, nấm kỵ khí ở dạ cỏ như: Caecomyces communis, Neocallimastix frontalis, Neocallimastix patriciarum, Piromyces communis. • Vi thực vật: chủ yếu là các vi khuẩn, chúng có tới trên 200 loài, số lượng lớn, 109 vi khuẩn trên 1 gam chất chứa trong dạ cỏ. Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù chúng được nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng. Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ.

Tính từ năm 1941 là năm Hungate công bố những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật dạ cỏ đến nay đã có tới hơn 200 n 6 loài vi khuẩn dạ cỏ đã được mô tả (Theodorou và France, 1993). Tổng số vi khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ. Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoảng 25-30%, số còn lại bám vào các mẩu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa. Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng.

Sau đây là một số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính: - Vi khuẩn phân giải cellulose. - Vi khuẩn phân giải hemixenlulose. - Vi khuẩn phân giải gluxit. - Vi khuẩn phân giải ure và vi khuẩn sử dụng NH3.

- Vi khuẩn sử dụng các axit hữu cơ tạo ra trong dạ cỏ. - Vi khuẩn phân giải protein và dẫn xuất của protein. - Vi khuẩn tạo metan (CH4). - Vi khuẩn tổng hợp vitamin (B12).

Sự phân chia cũng chỉ là tương đối vì nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân giải nhiều cơ chất khác, ngoài khả năng phân giải chúng còn tổng hợp chất dinh dưỡng khác nhau cho bản thân chúng mà cuối cùng là nguồn dinh dưỡng cho động vật nhai lại [1]. Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm có số lượng rất lớn trong dạ cỏ của những gia súc sử dụng khẩu phần giàu cellulose.