Luận văn thạc sĩ phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cllulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dạ cỏ động vật nhai lại, ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ môi trường hiệu quả.

• Tác giả: Hoàng Hải Yến
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Chí
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose
• 2.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật
• 2.1.2. Vi khuẩn phân giải cellulose
• 2.2. Enzyme từ vi sinh vật
• 2.2.1. Giới thiệu chung về cellulose
• 2.3. Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải
• 2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
• 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng (vật liệu) nghiên cứu
• 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.1.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
• 3.2.1. Môi trường sử dụng nghiên cứu
• 3.2.2. Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose: môi trường CMC (MT1)
• 3.2.3. Môi trường thử nghiệm khả năng phân giải cellulose (MT2)
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Tiến hành phân lập vi khuẩn
• 3.4.2. Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập
• 3.4.3. Xác định khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn
• 3.4.4. Đo mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD
• 3.4.5. Phương pháp thử khả năng phân giải cellulose bằng phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường thử nghiệm
• 3.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
• 3.4.7. Định danh vi khuẩn
• 3.4.8. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật (nấm mốc)
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose
• 4.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn
• 4.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose
• 4.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện môi trường
• 4.3. Thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon
• 4.4. Thử khả năng đồng hóa nguồn nitơ
• 4.5. Định danh sơ bộ vi khuẩn
• 4.6. Thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật khác (nấm mốc)
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vi khuẩn phân giải cellulose

Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose, một polysaccharide chính trong thành phần của tế bào thực vật. Cellulose chiếm khoảng 50% tổng số hydratcacbon trong thực vật, và việc phân giải cellulose là rất quan trọng trong chu trình carbon tự nhiên. Vi khuẩn này có thể được chia thành hai loại chính: vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn hiếu khí. Các vi khuẩn kỵ khí như Clostridium cellulovorans và Ruminococcus albus đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại. Vi khuẩn hiếu khí như Bacillus subtilis cũng có khả năng phân giải cellulose nhưng thường được tìm thấy trong môi trường khác. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này từ dạ cỏ động vật nhai lại có thể cung cấp nguồn enzyme cellulase cho nhiều ứng dụng trong công nghiệp và bảo vệ môi trường.

1.1. Tầm quan trọng của vi khuẩn phân giải cellulose

Vi khuẩn phân giải cellulose không chỉ giúp tiêu hóa thức ăn cho động vật nhai lại mà còn có vai trò quan trọng trong việc xử lý rác thải hữu cơ. Chúng giúp chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm dễ tiêu hóa như glucose, từ đó cung cấp năng lượng cho các sinh vật khác trong chuỗi thức ăn. Hơn nữa, enzyme cellulase từ vi khuẩn này có thể được ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, chế biến thực phẩm, và xử lý nước thải. Việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose có thể góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tối ưu hóa quy trình sản xuất trong nhiều lĩnh vực.

II. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

Quá trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dạ cỏ động vật nhai lại bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, mẫu dạ cỏ được thu thập và xử lý trong môi trường nuôi cấy thích hợp, thường là môi trường chứa carboxymethyl cellulose (CMC) để kích thích sự phát triển của vi khuẩn phân giải cellulose. Sau đó, các chủng vi khuẩn được phân lập thông qua các phương pháp như cấy trên môi trường thạch và thử nghiệm hoạt tính enzyme cellulase. Việc xác định khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn được thực hiện bằng cách đo mật độ quang (OD) và thử nghiệm đục lỗ thạch. Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao sẽ được tuyển chọn để nghiên cứu sâu hơn.

2.1. Các phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm

Các phương pháp nuôi cấy vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm cấy trên môi trường thạch và môi trường lỏng. Môi trường thạch cho phép quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, trong khi môi trường lỏng giúp đo lường hoạt tính enzyme. Thử nghiệm đục lỗ thạch là một phương pháp phổ biến để xác định khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ giúp xác định các chủng vi khuẩn tiềm năng cho việc sản xuất chế phẩm sinh học. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng cũng rất quan trọng để đạt được hiệu suất cao nhất trong quá trình phân lập.

III. Ứng dụng của chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose

Chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose có nhiều ứng dụng thực tiễn trong bảo vệ môi trường và sản xuất nông nghiệp. Một trong những ứng dụng quan trọng là trong xử lý rác thải hữu cơ, nơi enzyme cellulase giúp phân hủy cellulose trong các chất thải thực vật, từ đó giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Ngoài ra, chế phẩm này còn có thể được sử dụng trong sản xuất phân bón sinh học, giúp cải thiện chất lượng đất và tăng năng suất cây trồng. Việc ứng dụng enzyme cellulase trong công nghiệp chế biến thực phẩm cũng đang được nghiên cứu để nâng cao hiệu quả sản xuất và chất lượng sản phẩm.

3.1. Lợi ích kinh tế và môi trường

Việc sử dụng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn phân giải cellulose không chỉ mang lại lợi ích về mặt môi trường mà còn có giá trị kinh tế cao. Chúng giúp giảm chi phí xử lý rác thải và tăng hiệu quả sản xuất trong nông nghiệp. Hơn nữa, việc phát triển các sản phẩm sinh học từ vi khuẩn này có thể tạo ra cơ hội việc làm mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường. Sự phát triển bền vững trong nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm sẽ góp phần quan trọng vào việc bảo vệ tài nguyên thiên nhiên và cải thiện chất lượng cuộc sống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, ngành Công nghệ Sinh học đang phát triển rất mạnh mẽ, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực của đời sống như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế [26, 27]. Một số enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay như protease, amylase, pectinase, glucooxydase, cellulase. Trong số đó cellulase là enzyme nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì chúng có thế ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau như trong quá trình chuyển hóa chất liệu chứa cellulose, công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trường [7, 23]. Đặc biệt trong ngành công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học, cellulase đang được nghiên cứu và phát triển để giải quyết vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [28].

Nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú, khoảng một nửa hợp chất cacbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 35-50% lượng sinh khối thực vật. Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật. Hệ thống phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn. Tuy nhiên trong khoảng thời gian ngắn (48h) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ (vi khuẩn kỵ khí) có thể phân giải 60 - 65 % cellulose [4].

Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đã và đang rất được quan tâm. n 2 Từ những luận điểm trên chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại và ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường”. Mục tiêu của đề tài Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu những loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong dạ cỏ động vật nhai lại, ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong bảo vệ môi trường. Yêu cầu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose từ dịch dạ cỏ động vật nhai lại.

- Tối ưu hóa điều kiện lên men để thu sinh khối và thu chế phẩm enzyme. - Định danh sơ bộ về chủng vi khuẩn mà mình phân lập được dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải… - Thử khả năng khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn với các chủng vi sinh vật khác. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học.

- Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này. - Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học trong bảo vệ môi trường. - Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực.

n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi sinh vật và vi khuẩn phân giải cellulose 2. Giới thiệu về vi sinh vật [12] Vi sinh vật là một thế giới sinh vật vô cùng nhỏ bé mà ta không thể quan sát bằng mắt thường. Nó phân bố ở khắp mọi nơi, trong đất, trong nước, trong không khí, trong thực phẩm… Vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng trong thiên nhiên cũng như trong cuộc sống của con người, từ xa xưa, con người ta đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hàng ngày như làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm và các quá trình làm rượu.

Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi sinh vật thì nó được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả hơn, ví dụ như chế vacxin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh và các dược phẩm quan trọng khác, vi sinh vật được ứng dụng trong bảo vệ môi trường, chế tạo phân bón sinh học thuốc bảo vệ thực vật không gây độc hại cho môi trường, bảo vệ cân bằng sinh thái. Ngoài những vi sinh vật có lợi còn có một số vi sinh vật gây hại gây bệnh cho người, động vật, thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô nhiễm các nguồn nước, đất và không khí… • Định nghĩa Vi sinh vật là những cơ thể vô cùng nhỏ bé, mà mắt thường không nhìn thấy được, chỉ có thể quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi. • Ứng dụng của vi sinh vật. - Trong lĩnh vưc y tế: công nghệ vi sinh đã đóng góp trong việc tìm kiếm nhiều loại dược phẩm quan trọng, chuẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh hiểm nghèo cho con người, gia súc, gia cầm như vacxin, insulin, interferon, chất kháng sinh.

n 4 - Trong lĩnh vực nông nghiệp: cải tạo giống cây trồng, sản xuất chế phẩm (phân bón), sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong bảo vệ thực vật. - Trong lĩnh vực bảo quản chế biến: hệ vi sinh vật trong thực phẩm và công nghệ bảo quản chế biến thực phẩm. - Trong lĩnh vực công nghiệp: ứng dụng vi sinh vật lên men, nhân sinh khối tế bào sản phẩm như sản xuất protein đơn bào, sản xuất bột ngọt, bia, rượu, cồn, nước ngọt có ga. - Trong vấn đề năng lượng và bảo vệ môi trường: sản xuất cồn làm nguồn năng lượng thay xăng dầu chạy xe các loại, tạo khí sinh học (biogas), trong bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi trường.

Trong vấn đề bảo vệ môi trường công nghệ vi sinh đã tham gia tích cực trong việc xử lý phế thải công nghiệp, nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải, làm sạch môi trường. Đây là vấn đề cấp thiết trên toàn cầu hiện nay. Vi khuẩn phân giải cellulose 2. Dạ cỏ động vật nhai lại Dung tích dạ cỏ khoảng 60÷100 lít, niêm mạc dạ cỏ có nhiều gờ nổi lên làm tăng thêm diện tích.

Dạ cỏ không có tuyến bài tiết HCL và dịch vị mà chỉ tiết dịch nhày. Tiêu hóa trong dạ cỏ chủ yếu nhờ enzyme của vi sinh vật cư trú trong đó. Môi trường dạ cỏ với các đặc điểm thiết yếu cho sự lên men vi sinh vật đó là: có độ ẩm cao (80-90%), độ pH cao (6,4-7,5), độ pH dạ cỏ tương đối ổn định, luôn luôn được đệm bởi bicarbonate và phosphates của nước bọt, nhiệt độ khoảng 39-410C, luôn luôn được nhào trộn bởi sự co bóp của dạ cỏ, dòng dinh dưỡng lưu thông liên tục. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ra khỏi dạ cỏ và các cơ chất được nạp vào thông qua thức ăn ăn vào hàng ngày, n 5 có sự chế tiết vào dạ cỏ những chất cần thiết cho vi sinh vật phát triển và khuếch tán ra ngoài những sản phẩm tạo ra trong dạ cỏ.

Ðiều này làm cho áp suất thẩm thấu của dạ cỏ luôn ổn định. Thời gian thức ăn tồn lưu trong dạ cỏ kéo dài tạo điều kiện cho vi sinh vật công phá. Những điều kiện đó là lý tưởng cho sự phát triển của vi sinh vật dạ cỏ. Ðiều này được đánh giá bởi sự phong phú về chủng loại và mật độ vi sinh vật.

Môi trường dạ cỏ được kiểm soát và điều khiển bởi nhiều yếu tố như: số lượng và chất lượng thức ăn ăn vào, nhào trộn theo chu kỳ thông qua co bóp dạ cỏ, nước bọt và nhai lại, khuyếch tán và chế tiết vào dạ cỏ, hấp thu dinh dưỡng từ dạ cỏ, chuyển dịch các chất xuống bộ máy tiêu hóa [1]. Hệ vi sinh vật dạ cỏ Hệ vi sinh vật cộng sinh trong dạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và thường gọi chung là vi sinh vật dạ cỏ. Hệ vi sinh vật dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là: vi thực vật, nấm và vi động vật. • Vi động vật: số lượng 200.000/ml, chủ yếu là động vật nguyên sinh, quan trọng nhất là lớp tiên mao trùng, giống Entodinium diplodinium có số lượng lớn nhất.

• Nấm: gồm nấm men và nấm mốc, nấm kỵ khí ở dạ cỏ như: Caecomyces communis, Neocallimastix frontalis, Neocallimastix patriciarum, Piromyces communis. • Vi thực vật: chủ yếu là các vi khuẩn, chúng có tới trên 200 loài, số lượng lớn, 109 vi khuẩn trên 1 gam chất chứa trong dạ cỏ. Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù chúng được nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng. Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ.

Tính từ năm 1941 là năm Hungate công bố những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật dạ cỏ đến nay đã có tới hơn 200 n 6 loài vi khuẩn dạ cỏ đã được mô tả (Theodorou và France, 1993). Tổng số vi khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ. Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoảng 25-30%, số còn lại bám vào các mẩu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa. Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng.

Sau đây là một số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính: - Vi khuẩn phân giải cellulose. - Vi khuẩn phân giải hemixenlulose. - Vi khuẩn phân giải gluxit. - Vi khuẩn phân giải ure và vi khuẩn sử dụng NH3.

- Vi khuẩn sử dụng các axit hữu cơ tạo ra trong dạ cỏ. - Vi khuẩn phân giải protein và dẫn xuất của protein. - Vi khuẩn tạo metan (CH4). - Vi khuẩn tổng hợp vitamin (B12).

Sự phân chia cũng chỉ là tương đối vì nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân giải nhiều cơ chất khác, ngoài khả năng phân giải chúng còn tổng hợp chất dinh dưỡng khác nhau cho bản thân chúng mà cuối cùng là nguồn dinh dưỡng cho động vật nhai lại [1]. Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm có số lượng rất lớn trong dạ cỏ của những gia súc sử dụng khẩu phần giàu cellulose.