Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ. Nguồn gốc, lịch sử phát triển của cây chè. Đặc điểm sinh học của cây chè.
Giá trị của cây chè. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam. Tình hình sản xuất chè trên thế giới.
Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt Nam. CATECHIN VÀ ANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ. Catechin và tác dụng của catechin.
Cơ chế sinh tổng hợp catechin ở chè. Anthocyanidin reductase và gen ANR quy định tổng hợp anthocyanidin reductase. 20 c iv Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp tách chiết RNA tổng số. Điện di RNA tổng số. Tổng hợp cDNA.
Nhân gen ANR bằng kĩ thuật PCR. Tinh sạch sản phẩm PCR. Tách dòng gen ANR. Xác định trình tự gen.
Xử lí số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng. Thiết kế vector biểu hiện. 34 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Khuếch đại gen ANR từ mẫu chè nghiên cứu.
Tạo dòng gen, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa anthocyanidin reductase. Thiết kế vector biểu hiện vi khuẩn mang gen ANR. 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO.
49 c v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh tắt ANR Anthocyanidin reductase Anthocyanidin reductase cDNA DNA bổ sung Complementary DNA DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide C Catechin Catechin CsANR Gen ANR của chè ANR gene of Camellia sinensis DNA Axit Deoxiribonucleic Deoxyribonucleic Acid dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate Đtg Đồng tác giả et al. EC Epicatechin Epicatechin ECG Epicatechin-3-O-gallate Epicatechin-3-O-gallate EDTA Axit etylene diamin tetraaxetic Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EGC Epigallocatechin Epigallocatechin EGCG Epigallocatechin-3-O-gallate Epigallocatechin-3-O-gallate EtBr Ethidium Bromide Ethidium Bromide GC Gallocatechin Gallocatechin Kb Kilô bazơ Kilo base LAR Leuacoanthocyanidin reductase Leuacoanthocyanidin reductase LB Môi trường LB Luria Bertani NAD Nicotinamid adenine dinucleotide Nicotinamid adenine dinucleotide NADP Nicotinamid adenine dinucleotide Nicotinamid adenine dinucleotide phosphate phosphate c vi ORF Khung đọc mở Open reading frame PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction Primer F Mồi xuôi Primer forward Primer R Mồi ngược Primer reverse RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease TAE TAE Tris Acetate EDTA Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus UTR Vùng không dịch mã untranslated region c vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới giai đoạn 2010 - 2016. Diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trên thế giới năm 2016.
Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong những năm gần đây. Thành phần amino acid của CsANR. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA.
Trình tự các đoạn mồi sử dụng nhân gen ANR. Thành phần phản ứng PCR nhân gen ANR. Thành phần phản ứng tạo đầu bằng sẳn phẩm PCR. Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen ANR và vector pJET1.
Thành phần phản ứng cắt plasmid. Kết quả kiểm tra nồng độ RNA tổng số. Sự sai khác trình tự nucleotide gen ANR của chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank. Sự sai khác trình tự amino acid của gen mã hóa anthocyanidin reductase ở giông chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank.
44 c viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Công thức tổng quát của catechin. Các con đường sinh tổng hợp catechin ở chè. Cấu trúc không gian 3 chiều của protein CsANR.
Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng nhân gen ANR. Sơ đồ vector tách dòng pJET 1. Sơ đồ vector biểu hiện pET-32a(+). Sơ đò thí nghiệm nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số. Kết quả nhân gen ANR từ cDNA của mẫu chè Trung du xanh ở các nhiệt độ khác nhau. Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè Trung du xanh. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của sản phẩm PCR trong plasmid pJET1.
Kết quả phân tích trình tự gen CsANR2 phân lập từ mẫu chè xanh. So sánh trình tự amino acid suy diễn của CsANR2 từ giống chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen ANR trong plasmid pET32a(+). Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_ANR bằng NcoI và XhoI.
Kết quả PCR kiểm tra plasmid pET32a(+)_ANR. Lý do chọn đề tài Chè (Camellia sinensis (L) O. Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu đời, được trồng khá phổ biến ở nhiều quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam. Sản phẩm từ cây chè đã và đang được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới dưới nhiều công dụng khác nhau nhưng phổ biến nhất vẫn là đồ uống.
Theo thống kê, chè là thức uống phổ biến thứ hai trên thế giới chỉ sau nước, với hương vị độc đáo và những tác dụng có lợi cho sức khỏe con người. Nước chè là thức uống tốt, có tác dụng giải khát, chống lạnh, có tác dụng bảo vệ sức khỏe con người khắc phục sự mệt mỏi của cơ thể, kích thích hoạt động của hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về trí óc và chân tay, kích thích hệ tiêu hóa, chữa một số bệnh đường ruột, lợi tiểu (do chứa theofilin, theobromin), kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì, chống sâu răng, hôi miệng, chống lão hóa, phòng ngừa ung thư (do chứa catesin), phòng ngừa bệnh tăng huyết áp, tiểu đường và ngăn ngừa cholesteron tăng cao… Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím, chè cũng được cho là ức chế sự xâm nhiễm và sinh sản của HIV. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè. Chính vì các đặc tính ưu việt trên, chè đã trở thành sản phẩm đồ uống phổ thông trên toàn thế giới, sản phẩm chè từ lâu đã trở thành một trong những nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia, đặc biệt là các quốc gia vùng Đông Nam Á.
Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, góp phần quan trọng trong việc xóa đói giảm nghèo; cây chè và một số cây công nghiệp khác đã trở thành cây trồng mũi nhọn góp phần chuyển dịch cơ cấu c 2 kinh tế, cải thiện đời sống nhân dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn. Thành phần hóa học chính trong chất rắn chiết xuất từ chè là polyphenol. Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của chè. Các catechin và dẫn xuất của nó còn được gọi là các flavan-3-ol chiếm khoảng 70% polyphenol tổng số.
Thành phần của catechin bao gồm Epicatechin (EC), ECG (Epicatechin-3-O-gallate), EGC (Epigallocatechin), EGCG (Epigallocatechin-3-O-gallate), C (catechin) và GC (Gallocatechin). Epicatechin là một trong nhiều loại polyphenol có vai trò quyết định đến hương vị của chè và là hoạt chất chống ôxy hóa có nhiều trong chè. Hiện nay, hoạt tính sinh học và cơ chế tổng hợp polyphenol ở mức độ phân tử được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu, đặc biệt là các gen thực hiện chức năng tổng hợp polyphenol. Anthocyanidin reductase (ANR) là enzyme quy định tổng hợp nên epicatechin, phân lập và xác định trình tự gen tổng hợp epicatechin là bước đầu tiên tạo tiền đề nghiên cứu chức năng của gen ANR, nhằm góp phần làm sáng tỏ giá trị của polyphenol nói riêng và cây chè nói chung đối với con người.
Ở chè Việt Nam, gen mã hóa anthocyanidin reductase vẫn chưa được phân lập và nghiên cứu về chức năng. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè (camellia sinensis)”. Mục tiêu đề tài Tạo dòng, xác định, phân tích trình tự và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Anthocyanidin reductase phân lập từ cây chè trồng tại Thái Nguyên. Nội dung nghiên cứu + Khuếch đại gen ANR mã hóa anthocyanidin reductase từ chè.
+ Tạo dòng gen, xác định và phân tích trình tự gen ANR thu được. + Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ 1.
Nguồn gốc, lịch sử phát triển của cây chè Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L) O. Kumtze và thuộc hệ thống phân loại như sau : Ngành: Hạt kín (Angiospermae) Lớp: Song tử diệp (Dicotyledonae) Bộ: Chè (Theaseae) Họ: Chè (Theaceae) Chi: Chè (Camelia hoặc Thea) Loài: Camellia sinensis Cây chè có nguồn gốc ở vùng khí hậu gió mùa Đông Nam Á, bao gồm vùng Tây Nam Trung Quốc, Bắc Myanma, Bắc lào và Bắc Việt Nam hiện nay. Cây chè được cư dân Bách Việt phương Nam, thuộc nền văn hóa lúa nước phát hiện đầu tiên trên thế giới làm thảo dược; rồi lan truyền lên phương Bắc của dân tộc Hán có nền văn hóa nông nghiệp cạn và du mục Hoàng Hà. Từ đó phát triển mạnh mẽ về công nghệ chế biến thành nước chè, một thứ nước uống giải khát phổ cập ở Trung Hoa, rồi truyền bá ra khắp năm châu trên thế giới ngày nay đã có trên 4000 năm lịch sử.
Những công trình nghiên cứu của Đjêmukhatze (1961- 1976) so sánh về thành phần các chất catechin trong lá chè có nguồn gốc khác nhau, các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã kết luận rằng: Những cây chè mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là epicatechin (-) và epicatechin galat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp epigalocatechin (-) và các galat của nó để tạo thành galocatechin (+). Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là epicatechin (-) và epicatechin galat (chiếm c 4 70% tổng số các loại catechin). Năm 1976, Viện sĩ thông tấn Viện Hàn Lâm khoa học Liên Xô, sau những nghiên cứu về tiến hóa của cây chè, bằng phân tích chất catechin trong chè mọc hoang dại ở các vùng chè Tứ Xuyên, Vân Nam Trung Quốc, và các vùng chè cổ Việt Nam (Suối Giàng, Nghĩa Lộ, Lạng Sơn, Nghệ An …) đã kết luận: Cây chè cổ Việt Nam tổng hợp các catechin đơn giản nhiều hơn cây chè Vân Nam.