Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể NK1R tái tổ hợp cho ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin 1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào, định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm.

• Tác giả: Phạm Thị Hồng Nhung
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào cho định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về thụ thể neurokinin 1 người tái tổ hợp

Thụ thể neurokinin 1 người (hNK1R) thuộc họ thụ thể kết cặp protein G (GPCR), đóng vai trò trung gian trong nhiều quá trình sinh lý quan trọng. Thụ thể này liên kết chủ yếu với chất P - một neuropeptide tham gia vào truyền tải cảm giác đau, viêm và điều hòa thần kinh trung ương. Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện hNK1R tái tổ hợp nhằm tạo ra công cụ phục vụ sàng lọc dược phẩm mới. Quá trình này đòi hỏi hiểu biết sâu về cấu trúc gen, đặc điểm protein và hệ thống biểu hiện phù hợp. Vector biểu hiện chứa trình tự gen hNK1R được tối ưu hóa codon cho phép sản xuất protein có hoạt tính chức năng trên dòng tế bào phù hợp. Công nghệ tái tổ hợp mở ra hướng tiếp cận mới trong phát triển thuốc nhắm đích thụ thể neurokinin, đặc biệt trong điều trị đau mạn tính, viêm và rối loạn tâm thần kinh.

1.1. Cấu trúc và chức năng thụ thể neurokinin 1

Thụ thể neurokinin 1 người là protein xuyên màng 7 đoạn, thuộc họ GPCR lớp A. Cấu trúc bao gồm vùng ngoại bào N-terminus, bảy vùng xuyên màng α-helix và vùng nội bào C-terminus. Thụ thể kết cặp với protein Gαq/11, kích hoạt đường dẫn phospholipase C, tăng nồng độ canxi nội bào và hoạt hóa protein kinase C. Chức năng chính của hNK1R bao gồm điều hòa viêm, truyền tải đau, co thắt cơ trơn đường hô hấp và tiêu hóa. Thụ thể cũng tham gia vào cơ chế buồn nôn, nôn và các rối loạn lo âu, trầm cảm.

1.2. Ý nghĩa nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp

Biểu hiện protein tái tổ hợp là nền tảng của công nghệ sinh học phân tử hiện đại. Đối với thụ thể GPCR như hNK1R, việc biểu hiện tái tổ hợp cho phép thu được lượng protein lớn, thuần khiết phục vụ nghiên cứu cấu trúc và chức năng. Protein tái tổ hợp được ứng dụng rộng rãi trong sàng lọc thuốc, phát triển kháng thể và nghiên cứu cơ chế tác động của dược phẩm. Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp cũng giúp đánh giá tương tác thuốc-thụ thể, xác định ái lực và chọn lọc của các ứng viên dược phẩm mới một cách hiệu quả và kinh tế.

II. Thách thức trong biểu hiện thụ thể GPCR trên dòng tế bào

Biểu hiện thụ thể GPCR tái tổ hợp, đặc biệt là hNK1R, đối mặt nhiều thách thức kỹ thuật phức tạp. Thứ nhất, protein GPCR có cấu trúc phức tạp với bảy vùng xuyên màng, yêu cầu môi trường lipid màng để gập nếp đúng cách và duy trì cấu trúc chức năng. Thứ hai, mức biểu hiện thấp thường gặp phải do độc tính tế bào và bất ổn protein. Thứ ba, biến đổi sau dịch mã như glycosylation và phosphorylation ảnh hưởng đến hoạt tính thụ thể. Sự khác biệt giữa các hệ thống biểu hiện cũng là vấn đề đáng quan tâm. Biểu hiện ở tế bào nhân sơ thường cho protein không có hoạt tính đầy đủ do thiếu biến đổi sau dịch mã. Ngược lại, tế bào nhân thực có hệ thống biến đổi sau dịch mã hoàn chỉnh nhưng chi phí cao hơn. Việc chọn dòng tế bào phù hợp quyết định chất lượng và sản lượng protein tái tổ hợp thu được.

2.1. Rào cản kỹ thuật trong biểu hiện protein xuyên màng

2.2. So sánh các hệ thống biểu hiện cho GPCR

III. Thiết kế vector biểu hiện và tối ưu hóa dòng tế bào chủ

Thiết kế vector biểu hiện hNK1R tái tổ hợp đòi hỏi nhiều yếu tố kỹ thuật được tối ưu hóa. Vector chứa promoter mạnh điều khiển phiên mã gen mục tiêu, vùng mã hóa tín hiệu hướng đích và các tag tinh sạch như His-tag hoặc FLAG-tag. Trình tự gen được tối ưu hóa codon phù hợp với tế bào chủ nhằm tăng hiệu quả dịch mã. Việc chọn dòng tế bào chủ đóng vai trò quyết định đối với chất lượng protein thu được. Tế bào HEK293 và CHO thường được ưu tiên cho biểu hiện GPCR do khả năng biến đổi sau dịch mã tương tự tế bào người. Quy trình chuyển gen sử dụng phương pháp transfecion hoặc electroporation. Các thông số nuôi cấy như nhiệt độ, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng được tối ưu hóa để đạt mức biểu hiện cao nhất. Kỹ thuật chọn lọc dòng ổn định sử dụng kháng sinh kháng giúp duy trì biểu hiện bền vững qua nhiều thế hệ tế bào.

3.1. Cấu trúc vector biểu hiện cho gen hNK1R

3.2. Lựa chọn và tối ưu hóa dòng tế bào biểu hiện

IV. Ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

Vector biểu hiện hNK1R tái tổ hợp trên dòng tế bào có nhiều ứng dụng quan trọng trong phát triển dược phẩm. Ứng dụng đầu tiên là sàng lọc thuốc nhắm đích thụ thể neurokinin 1. Hệ thống tế bào biểu hiện hNK1R được sử dụng đánh giá ái lực và chọn lọc của các ứng viên dược phẩm. Phương pháp phân tích chức năng đo lường sự thay đổi nồng độ chất truyền tin như canxi nội bào, cAMP hoặc IP3. Ứng dụng thứ hai là nghiên cứu cơ chế tác động của thuốc tại mức phân tử. Protein hNK1R tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu cấu trúc bằng tinh thể học tia X hoặc cryo-EM. Nghiên cứu tương tác thuốc-thụ thể giúp hiểu rõ cơ chế liên kết, từ đó thiết kế thuốc mới có hiệu quả cao hơn. Công nghệ này cũng hỗ trợ phát triển liệu pháp kháng thể đơn dòng và thuốc điều biến allosteric nhắm vào thụ thể neurokinin 1.

4.1. Sàng lọc dược phẩm dựa trên thụ thể GPCR

4.2. Định hướng phát triển thuốc nhắm đích NK1R

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Thụ thể neurokinin-1 (viết tắt là NK1R) nói riêng và thụ thể kết cặp với G-protein (viết tắt là GPCR) nói chung là đích tác dụng quan trọng của rất nhiều thuốc hiện nay. Khi NK1R tương tác với chất chủ vận nội sinh sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về thần kinh trung ương, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm. Ngoài ra, NK1R tham gia kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể. Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của NK1R, nhiều loại thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, chống nôn cho các bệnh nhân ung thư… đã và đang được các hãng dược phẩm đầu tư phát triển và thương mại hóa.

Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học hướng đích GPCR phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc là nhu cầu mang tính thời sự trong các nghiên cứu dược lý học phân tử. Có một số lượng lớn các hợp chất mới có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp (được gọi chung là các thuốc thử) cần xác định đích phân tử và cơ chế dược lý tác động lên cơ thể. Hiện nay, việc sử dụng các GPCR tự nhiên thường gặp khó khăn do các dòng tế bào GPCR tự nhiên biểu hiện ở mức độ thấp, việc thu mẫu và phân lập từ tế bào người gặp nhiều hạn chế về mặt đạo đức cũng như kỹ thuật. Ngoài ra, các GPCR có nhiều dạng biến thể (subtype) khác nhau, có thể dẫn đến những nhận định nhầm về khả năng tương tác với các thuốc thử.

Tuy nhiên, những khó khăn trên có thể khắc phục bằng cách sử dụng các tế bào biểu hiện GPCR tái tổ hợp của người. GPCR tái tổ hợp biểu hiện ở mức độ cao và đầy đủ hoạt tính sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính vì 12 vậy, xây dựng mô hình biểu hiện mạnh GPCR tái tổ hợp của người trên các hệ thống tế bào động vật là nghiên cứu cấp thiết và có giá trị thực tiễn trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Mặc dù nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển nhằm biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào nhân sơ đến nhân chuẩn, đến nay biểu hiện hiệu suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức lớn.

Sự biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới yêu cầu biến đổi sau dịch mã, sự cuộn gập protein, vận chuyển nội bào và khả năng gây độc tính tế bào của thụ thể. Có một thuận lợi là các GPCR dù đa dạng về trình tự amino acid song có cấu trúc không gian tương đồng lớn (đều là đơn chuỗi peptide với 7 miền xuyên màng kị nước). Chính vì vậy, mô hình biểu hiện thành công cho một thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho rất nhiều thụ thể khác, đặc biệt là các thụ thể cùng họ GPCR. Trong các hệ thống biểu hiện, hệ thống biểu hiện của Semliki Forest Virus (viết tắt là SFV) được ghi nhận là một trong những hệ thống biểu hiện protein màng tế bào động vật trong thời gian nhanh nhất.

Theo tài liệu, hệ thống này đã được một số hãng dược phẩm (như Hoffman La Roche) ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR phục vụ cho nghiên cứu và phát triển thuốc, nhưng các dòng tế bào tái tổ hợp không được thương mại hóa trên thị trường. Trong bối cảnh đó, việc ứng dụng và làm chủ được hệ thống biểu hiện SFV hứa hẹn cung cấp một công cụ sinh học hữu ích trong nghiên cứu y sinh dược học ở Việt Nam. Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận án: “Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.

Mục tiêu tổng quát Biểu hiện được NK1R tái tổ hợp của người trên dòng tế bào tự nhiên vốn không biểu hiện thụ thể này nhằm sàng lọc hoạt chất và dịch chiết dược liệu hướng đích NK1R. Qua đó, tạo cơ sở xây dựng mô hình biểu hiện cho các GPCR tái tổ hợp khác phục vụ cho các nghiên cứu và phát triển dược phẩm ở Việt Nam. Mục tiêu cụ thể Mục tiêu 1: Xây dựng được quy trình kỹ thuật biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người thông qua hệ thống biểu hiện SFV trên dòng tế bào động vật. Mục tiêu 2: Đánh giá được hoạt động chức năng của NK1R tái tổ hợp biểu hiện trên tế bào động vật.

Mục tiêu 3: Áp dụng được tế bào động vật biểu hiện thụ thể NK1R trong sàng lọc một số dược liệu tiềm năng. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Phát triển hệ vector SFV biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người. Nội dung 2: Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R tái tổ hợp của người. Nội dung 3: Đánh giá biểu hiện NK1R trên một số dòng tế bào động vật.

Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện và chức năng của NK1R người tái tổ hợp trên tế bào CHO. Nội dung 5: Tạo ra một lượng lớn tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người với đầy đủ chức năng, ứng dụng bước đầu trong nghiên 14 cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của 10 loài dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống biểu hiện GPCR người tái tổ hợp, từ xây dựng vector chuyển gen mã hóa NK1R của người đến biểu hiện thụ thể tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học các hoạt chất hướng đích NK1R in vitro của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn, có tính mới trên thế giới.

Dòng tế bào động vật biểu hiện thụ thể tái tổ hợp của người là công cụ hiện đại và hiệu quả phục vụ cho các nghiên cứu y sinh học. Hệ thống biểu hiện SFV đã được thiết lập để tạo được dòng tế bào CHO biểu hiện mạnh NK1R người lần đầu tiên ở Việt Nam. Đây là cơ sở biểu hiện thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho nhiều GPCR khác. Xây dựng được mô hình sàng lọc in vitro các hoạt chất hướng đích NK1R phục vụ các các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm.

Đây là một công cụ mới và hiện đại phục vụ cho các nghiên cứu dược lý, phù hợp với định hướng phát triển các thuốc dược liệu của Việt Nam hiện nay. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Về mặt khoa học Trình tự NK1R của hai bệnh nhân Việt Nam đã được biểu hiện thành công trên dòng tế bào CHO, mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật biểu hiện ổn định các thụ thể tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc phân tử, dược lý in vitro, góp phần định hướng cho các nghiên cứu phát triển thuốc ở các giai đoạn sau (nghiên cứu dược lý in vivo, nghiên cứu lâm sàng, nghiên cứu dược động học,. 15 Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen, biểu hiện protein tái tổ hợp với hệ thống biểu hiện SFV đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector SFV mang trình tự NK1R của người và biểu hiện hiệu quả cao trên dòng tế bào CHO. Luận án, các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ trong nước và quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.

Về mặt thực tiễn Tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người với đầy đủ hoạt tính có thể ứng dụng để sàng lọc các các hoạt chất hướng đích NK1R thu từ các cây dược liệu Việt Nam. Nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn phát triển thuốc dược liệu, tiêu chuẩn hoá và hiện đại hoá các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, góp phần phát huy thế mạnh về nguồn tài nguyên dược liệu phong phú của Việt Nam. Không chỉ biểu hiện hiệu quả protein thụ thể, hệ thống SFV được xây dựng trong nghiên cứu này còn là công cụ hữu ích để chuyển gen và biểu hiện các loại protein khác nhau trên các dòng tế bào động vật. Nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới đã cho thấy đây cũng là công cụ có tiềm năng ứng dụng trong liệu pháp gen trị liệu ung thư hay công nghệ sản xuất vắc-xin.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN 1. Các dạng thụ thể và phối tử Trong quá trình tồn tại và phát triển, tế bào liên tục tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào là các kích thích vật lý (ánh sáng, nhiệt độ hay áp lực) hay các kích thích hóa học (các peptide, chất dẫn truyền thần kinh, các pheromone, các nucleotide và các hợp chất phân tử nhỏ khác). Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào được gọi là phối tử (ligand), truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tín hiệu nội bào dẫn đến đáp ứng tế bào giúp cơ thể phản ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường [9].

Chính vì vậy, thụ thể có vai trò rất quan trọng, tham gia vào nhiều cơ chế sinh lý trong các tế bào cũng như giữa các tế bào với nhau. Dựa vào tác động lên tế bào mà phối tử có thể chia thành 2 nhóm chính là chất chủ vận (agonist) và chất đối kháng (antagonist) [7, 144]. Chất chủ vận là những chất khi gắn vào thụ thể sẽ hoạt hóa thụ thể gây ra đáp ứng tế bào. Các chất chủ vận được chia thành sáu nhóm như sau: Nhóm 1: Chất chủ vận nội sinh (endogenous agonist): Xuất hiện tự nhiên trong cơ thể, có khả năng liên kết và kích hoạt thụ thể.

Nhóm 2: Chất siêu chủ vận (super agonist): Có khả năng gắn kết với thụ thể và tạo ra phản ứng tối đa, lớn hơn so với các chất chủ vận nội sinh khác. Nhóm 3: Chất chủ vận toàn phần (full agonist): Kích hoạt thụ thể và tạo ra hiệu quả đầy đủ tương đương với phối tử nội sinh. 17 Nhóm 4: Chất chủ vận một phần (partial agonist): Liên kết và kích hoạt thụ thể, nhưng chỉ gây ra đáp ứng một phần so với các chất chủ vận nội sinh. Nhóm 5: Chất chủ vận ngược (inverse agonist): Liên kết với thụ thể và gây ra đáp ứng tế bào đối ngược với chất chủ vận.