Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân loại nấm men moniliella phân lập tại việt nam 07

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam, phân tích đặc điểm và ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp.

• Tác giả: Đinh Đức Hiền
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Loại Nấm Men Moniliella Phân Lập Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nhóm nấm men đen
• 1.2. Một số chi nấm men đen
• 1.3. Một số phương pháp phân loại nấm men
• 1.3.1. Các phương pháp phân loại truyền thống
• 1.3.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử
• 1.4. Một số phương pháp phát hiện và đánh giá đa dạng vi sinh vật
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc
• 2.1.1. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
• 2.2. Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao
• 2.2.2. Môi trường Malt-Glucose 2°Bx có axit lactic 1‰
• 2.2.3. Môi trường Malt-Glucose 2°Bx không có axit lactic
• 2.2.4. Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau
• 2.2.5. Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau
• 2.2.6. Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối cao
• 2.2.7. Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
• 2.2.8. Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột
• 2.2.9. Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea
• 2.2.10. Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide
• 2.2.11. Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 %
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp phân lập
• 2.3.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men
• 2.3.4. Phương pháp tinh chế DNA
• 2.3.5. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting
• 2.3.6. Phương pháp điện di
• 2.3.7. Nhuộm gel và đọc kết quả
• 2.3.8. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA
• 2.3.9. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau
• 2.3.10. Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau
• 2.3.11. Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ muối cao
• 2.3.12. Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
• 2.3.13. Thử khả năng hình thành tinh bột
• 2.3.14. Thử khả năng phân giải urea
• 2.3.15. Thử khả năng chống chịu với cycloheximit
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả phân lập
• 3.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting
• 3.4. Mô tả các nhóm loài mới thuộc chi Moniliella
• 3.4.1. Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới
• 3.4.2. Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 loài mới
• 3.5. Sự đa dạng Moniliella phân lập tại Việt Nam
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nấm men Moniliella tại Việt Nam

Nấm men Moniliella là một nhóm vi sinh vật quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật học. Chúng được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau tại Việt Nam, đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghiệp. Nghiên cứu này nhằm mục đích phân loại và đánh giá sự đa dạng của nấm men Moniliella tại Việt Nam, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm men Moniliella

Nấm men Moniliella có khả năng sinh trưởng trong điều kiện khắc nghiệt, bao gồm nồng độ đường cao và áp suất thẩm thấu lớn. Chúng có thể phát triển dưới dạng đơn bào hoặc sợi, tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy.

1.2. Vai trò của nấm men Moniliella trong công nghiệp

Nấm men Moniliella được sử dụng trong sản xuất erythritol, một loại đường chức năng có giá trị thương mại cao. Chúng cũng có khả năng chuyển hóa các chất hữu cơ khác thành sản phẩm có giá trị.

II. Thách thức trong nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella

Phân loại nấm men Moniliella gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng di truyền và hình thái của chúng. Việc xác định các loài mới và mối quan hệ giữa chúng là một thách thức lớn trong nghiên cứu vi sinh vật học.

2.1. Khó khăn trong việc phân loại

Sự khác biệt di truyền giữa các loài Moniliella có thể lên tới 15-16%, gây khó khăn trong việc xác định và phân loại chính xác các loài này.

2.2. Thiếu thông tin về đặc tính sinh lý

Nhiều loài Moniliella chưa được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh lý và sinh hóa, điều này làm hạn chế khả năng ứng dụng của chúng trong công nghiệp.

III. Phương pháp nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella

Nghiên cứu này sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân loại nấm men Moniliella, bao gồm phương pháp hình thái, PCR fingerprinting và giải trình tự DNA. Những phương pháp này giúp xác định chính xác các loài và mối quan hệ giữa chúng.

3.1. Phương pháp hình thái học

Phương pháp này bao gồm việc quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào của nấm men Moniliella, từ đó xác định các đặc điểm phân loại.

3.2. Phương pháp PCR fingerprinting

PCR fingerprinting là một kỹ thuật mạnh mẽ giúp phân nhóm các loài nấm men dựa trên trình tự DNA, cung cấp thông tin chính xác về sự đa dạng di truyền.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng cao của nấm men Moniliella tại Việt Nam. Nghiên cứu đã phân lập được nhiều loài mới và xác định được mối quan hệ giữa chúng, mở ra hướng đi mới cho các ứng dụng công nghệ sinh học.

4.1. Đa dạng loài nấm men Moniliella

Nghiên cứu đã phân lập được nhiều loài Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau, cho thấy sự phong phú và đa dạng của nhóm nấm men này tại Việt Nam.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất công nghiệp

Các loài Moniliella phân lập được có tiềm năng lớn trong sản xuất erythritol và các sản phẩm sinh học khác, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp thực phẩm.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu nấm men Moniliella

Nghiên cứu về nấm men Moniliella tại Việt Nam đã mở ra nhiều cơ hội mới cho các nghiên cứu tiếp theo. Việc phát hiện và phân loại các loài mới sẽ giúp làm rõ hơn về sự đa dạng và ứng dụng của chúng trong công nghiệp.

5.1. Tương lai của nghiên cứu nấm men Moniliella

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát hiện thêm các loài mới và nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh lý của chúng để khai thác tiềm năng ứng dụng.

5.2. Đề xuất hướng nghiên cứu mới

Cần có các nghiên cứu liên ngành để kết hợp giữa vi sinh vật học và công nghệ sinh học, nhằm phát triển các sản phẩm mới từ nấm men Moniliella.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm men Moniliella là một nhóm nấm men đen có vai trò quan trọng trong công nghiệp sinh học, đặc biệt trong sản xuất erythritol – một loại đường chức năng có giá trị thương mại cao. Theo ước tính, chi Moniliella bao gồm 9 loài chính, phân bố chủ yếu ở những môi trường có nồng độ đường cao hoặc nhiều dầu mỡ như phấn hoa, mật ong, thực phẩm lên men và các sản phẩm dầu mỡ. Tại Việt Nam, nghiên cứu đa dạng nấm men Moniliella còn hạn chế, trong khi tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học từ nhóm nấm này rất lớn, như khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-decalactone (tinh dầu đào), sinh lipase và sản xuất kháng sinh zymocin.

Mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá sự đa dạng của nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam, phân loại các chủng dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tích sinh học phân tử, đồng thời cung cấp nguồn chủng giống phong phú phục vụ nghiên cứu công nghệ sinh học. Nghiên cứu được thực hiện trên 126 chủng Moniliella phân lập từ 1653 mẫu thu thập tại 13 tỉnh thành phía Bắc và miền Trung Việt Nam trong giai đoạn 2012-2014. Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ hệ thống phân loại của chi Moniliella, đồng thời mở ra cơ hội ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình phân loại vi sinh vật hiện đại kết hợp với phương pháp truyền thống:

• Lý thuyết phân loại sinh học vi sinh vật: Sử dụng đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa kết hợp với phân tích trình tự DNA để xác định và phân loại loài.
• Mô hình phân tích đa dạng sinh học: Đánh giá sự đa dạng loài dựa trên phân tích fingerprinting DNA vệ tinh và trình tự vùng D1/D2 của rDNA 26S.
• Khái niệm chính:
  • Fingerprinting DNA: kỹ thuật phân nhóm dựa trên sự tương đồng các đoạn DNA vệ tinh.
  • rDNA 26S D1/D2: vùng gen bảo thủ dùng để phân loại chính xác các loài nấm men.
  • Đa hình thái: sự biến đổi hình thái khuẩn lạc và tế bào trong cùng một loài.
  • Khả năng sinh trưởng trong môi trường áp suất thẩm thấu cao: đặc tính sinh học quan trọng của Moniliella.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 1653 mẫu thu thập từ các tỉnh Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Hải Dương, Hòa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lâm Đồng, Bình Thuận, Phú Yên. Từ đó phân lập được 126 chủng Moniliella.
• Phương pháp phân lập: Sử dụng môi trường làm giàu có nồng độ đường cao (50°Bx glucose) và môi trường Malt-Glucose 2°Bx có axit lactic 1‰ để ức chế vi khuẩn, nuôi cấy ở 28°C trong 3-10 ngày.
• Quan sát hình thái: Đánh giá hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc và tế bào dưới kính hiển vi quang học.
• Phân tích sinh học phân tử:
  • Tách chiết và tinh chế DNA từ tế bào nấm men.
  • PCR fingerprinting sử dụng mồi MST2 (GAC)5 để phân nhóm chủng.
  • Giải trình tự vùng ITS và D1/D2 của rDNA 26S, xây dựng cây phân loại bằng phần mềm MEGA 5.3.
• Đánh giá sinh lý sinh hóa:
  • Thử khả năng chuyển hóa 42 nguồn cacbon và 6 nguồn nitơ khác nhau.
  • Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ đường (50%, 60%) và muối cao (10% NaCl).
  • Thử khả năng sinh trưởng ở các nhiệt độ 25°C, 30°C, 35°C, 37°C, 42°C.
  • Thử khả năng hình thành tinh bột, phân giải urea, chống chịu cycloheximide và acid acetic 1%.
• Phát hiện pha sinh sản hữu tính: Thí nghiệm trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng một loài, nuôi cấy ở 5°C và 15°C, quan sát dưới kính hiển vi.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ phân lập Moniliella: Từ 1653 mẫu, có khoảng 3% mẫu chứa Moniliella, tương đương 55 mẫu, phân lập được 126 chủng. Tỷ lệ này cho thấy Moniliella không phổ biến rộng rãi nhưng có mặt ở nhiều loại mẫu khác nhau như bàn thái thịt, lọ mỡ, nem chua, hoa, mật ong.

2. Đa dạng chủng và phân bố địa lý: 126 chủng được phân nhóm thành 25 nhóm dựa trên fingerprinting DNA. Các mẫu hoa ở miền Nam có đa dạng nhóm Moniliella hơn miền Bắc, với một số mẫu chứa đến 4 nhóm di truyền khác nhau. Tần suất phân lập Moniliella ở hoa miền Nam cao hơn (khoảng 10%) so với miền Bắc (khoảng 3%), phản ánh sự ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới và mật độ côn trùng cao.

3. Đặc điểm hình thái và sinh lý: Khuẩn lạc đa dạng về hình dạng (trơn, xốp, nhăn), màu sắc (trắng, vàng, đen, xám), kích thước tế bào lớn, có dạng hình que và hình cầu. Nhiều chủng có khả năng hình thành giả khuẩn ti. Khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ glucose lên đến 60% và muối 10%, thể hiện tính chịu áp suất thẩm thấu cao.

4. Phân tích sinh học phân tử: Fingerprinting DNA cho thấy sự đa dạng di truyền rõ rệt giữa các chủng, phù hợp với kết quả phân nhóm hình thái. Vùng D1/D2 rDNA 26S có mức độ sai khác lên đến 15-16% giữa các loài, khẳng định sự đa dạng lớn trong chi Moniliella tại Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Sự đa dạng Moniliella tại Việt Nam phản ánh đặc điểm sinh thái của nhóm nấm men đen này, thích nghi với môi trường có nồng độ đường và dầu mỡ cao. Tỷ lệ phân lập khoảng 3% từ các mẫu đa dạng cho thấy Moniliella không phải là nhóm phổ biến nhất nhưng có vai trò sinh học và công nghiệp quan trọng. Sự khác biệt về đa dạng giữa miền Bắc và miền Nam có thể liên quan đến điều kiện khí hậu và mật độ côn trùng, khi côn trùng đóng vai trò phát tán nhưng không phải môi trường sống chính của Moniliella.

Kết quả fingerprinting và phân tích trình tự rDNA hỗ trợ cho việc phân loại chính xác các chủng, đồng thời phát hiện các nhóm loài mới tiềm năng. Đặc tính sinh lý như khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao, sinh trưởng trong môi trường có cycloheximide và acid acetic 1% cho thấy Moniliella có thể ứng dụng trong các quy trình lên men công nghiệp với điều kiện khắc nghiệt, giảm thiểu tạp nhiễm.

Các kết quả này tương đồng với nghiên cứu quốc tế về Moniliella, đồng thời bổ sung dữ liệu về đa dạng và phân bố tại Việt Nam, góp phần làm rõ hệ thống phân loại và mở rộng tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng khảo sát và thu thập mẫu: Tăng cường thu thập mẫu tại các vùng khí hậu khác nhau, đặc biệt ở miền Nam và các vùng có điều kiện nhiệt đới ẩm để đánh giá toàn diện đa dạng Moniliella. Thời gian thực hiện: 2 năm. Chủ thể: Viện nghiên cứu vi sinh vật và các trường đại học.

2. Phát triển ngân hàng chủng giống Moniliella: Xây dựng bộ sưu tập chủng giống đa dạng, có đặc tính sinh học và công nghệ rõ ràng để phục vụ nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp. Thời gian: 1-2 năm. Chủ thể: Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm.

3. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học: Khai thác khả năng sản xuất erythritol, γ-decalactone, lipase và kháng sinh zymocin từ các chủng Moniliella phân lập được, phát triển quy trình lên men công nghiệp hiệu quả. Thời gian: 3 năm. Chủ thể: Các doanh nghiệp công nghệ sinh học, viện nghiên cứu.

4. Đào tạo và nâng cao năng lực nghiên cứu: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật phân lập, phân loại và ứng dụng nấm men Moniliella cho cán bộ nghiên cứu và sinh viên. Thời gian: liên tục. Chủ thể: Trường đại học, viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh vật học và công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp dữ liệu đa dạng về phân loại, đặc tính sinh học và công nghệ của nấm men Moniliella, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu và phát triển ứng dụng.

2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm: Tham khảo để lựa chọn chủng giống Moniliella phù hợp cho sản xuất erythritol, enzyme và kháng sinh tự nhiên, nâng cao hiệu quả công nghệ.

3. Giảng viên và sinh viên ngành vi sinh vật học, công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo học thuật, giúp hiểu rõ phương pháp nghiên cứu, phân tích đa dạng vi sinh vật và ứng dụng kỹ thuật phân tử.

4. Cơ quan quản lý và phát triển khoa học công nghệ: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách phát triển công nghệ sinh học, bảo tồn nguồn gen vi sinh vật có giá trị kinh tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Moniliella là gì và có vai trò gì trong công nghiệp?
   Moniliella là chi nấm men đen có khả năng sinh trưởng trong môi trường áp suất thẩm thấu cao, được ứng dụng trong sản xuất erythritol – một loại đường chức năng ít calo, không gây sâu răng, và các enzyme như lipase. Ngoài ra, Moniliella còn sản xuất kháng sinh tự nhiên giúp bảo vệ quá trình lên men.

2. Phương pháp phân lập Moniliella trong nghiên cứu này như thế nào?
   Sử dụng môi trường làm giàu có nồng độ đường cao (50°Bx glucose) và môi trường Malt-Glucose 2°Bx có axit lactic 1‰ để ức chế vi khuẩn, nuôi cấy ở 28°C trong 3-10 ngày, sau đó phân lập trên môi trường thạch đặc biệt để thu được chủng Moniliella tinh khiết.

3. Fingerprinting DNA có vai trò gì trong phân loại Moniliella?
   Fingerprinting DNA sử dụng mồi đặc hiệu khuếch đại các đoạn DNA vệ tinh giúp phân nhóm các chủng dưới mức loài dựa trên sự tương đồng phổ băng, từ đó xác định đa dạng di truyền và phân loại chính xác các chủng Moniliella.

4. Moniliella có thể sinh trưởng trong điều kiện môi trường khắc nghiệt không?
   Có, Moniliella có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ glucose lên đến 60%, muối 10%, và chịu được acid acetic 1% cũng như cycloheximide, phù hợp với các quy trình lên men công nghiệp cần điều kiện khắc nghiệt để giảm tạp nhiễm.

5. Tại sao cần nghiên cứu đa dạng Moniliella tại Việt Nam?
   Việc nghiên cứu đa dạng giúp hiểu rõ hệ thống phân loại, phát hiện các loài mới, đồng thời cung cấp nguồn chủng giống phong phú phục vụ phát triển công nghệ sinh học trong nước, đặc biệt trong sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Kết luận

• Đã phân lập và xác định được 126 chủng nấm men Moniliella từ 1653 mẫu tại nhiều tỉnh thành Việt Nam, với tỷ lệ phân lập khoảng 3%.
• Phân nhóm bằng fingerprinting DNA và phân tích trình tự rDNA 26S cho thấy sự đa dạng di truyền lớn trong chi Moniliella tại Việt Nam.
• Moniliella có đặc tính sinh trưởng ưu việt như chịu áp suất thẩm thấu cao, sinh trưởng trong môi trường có cycloheximide và acid acetic, phù hợp với ứng dụng công nghiệp.
• Nghiên cứu góp phần làm rõ hệ thống phân loại Moniliella và cung cấp nguồn chủng giống quý giá cho phát triển công nghệ sinh học.
• Đề xuất mở rộng khảo sát, xây dựng ngân hàng chủng giống và phát triển ứng dụng công nghệ sinh học từ Moniliella trong giai đoạn 2-3 năm tới.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai các đề tài ứng dụng Moniliella, đồng thời đào tạo nguồn nhân lực chuyên sâu về vi sinh vật học công nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí phân loại cho 2 loài mới tìm đƣợc khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella tomentosa. Năm 2009, căn cứ vào sự tƣơng đồng nhất định về di truyền cũng nhƣ một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác là Trichosporonoides vào Moniliella. Nhƣ vậy, trƣớc khi nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M. Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chƣa rõ ràng.

Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata, một thành viên của Agaricomycotina. Với những trình tự khác, Moniliella thuộc Ustilagionomycotina. Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2. Do vậy việc tìm kiếm những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của Moniliella.

Moniliella đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đƣờng chức năng có giá trị thƣơng mại cao. Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chƣa đƣợc biết tới của Moniliella nhƣ khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone (tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại kháng sinh (zymocin) mới. Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này đƣợc thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam. - Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc bằng hình thái; PCR fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ.

- Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài, phân bố. K20 – Vi sinh vật học 1 Đinh Đức Hiền TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1. Nhóm nấm men đen Nấm men đen đƣợc phát hiện từ khoảng đầu thế kỷ 20 nhƣng khi đó ngƣời ta mới chỉ biết đến một vài chi trong số chúng. Nấm men đen sinh sản vô tính là chủ yếu, bằng nảy chổi, tạo sợi hay mô phân sinh.

Điều tạo nên sự khác biệt giữa chúng và các nhóm nấm men khác là chúng có melanin trong thành tế bào làm cho khuẩn lạc có thể có màu vàng lục, màu ô liu đến nâu sẫm, đen. Ngoài ra, nấm men đen còn chứa carotenoid và mycosporines. Một trong các lý do khiến những hiểu biết về nấm men đen kém xa so với các vi sinh vật khác có lẽ là do sự sinh trƣởng chậm, khả năng cạnh tranh thấp với loài khác nên dễ bị bỏ qua trong các nghiên cứu, thêm nữa cấu trúc bào tử đính của chúng lại ít đặc điểm phân biệt, trong khi hiện tƣợng đa hình thái của cùng một chủng lại khá phổ biến và gây khó khăn trong quá trình phân loại [9]. Một số chi nấm men đen 1.

Chi Phaeococcomyces Gồm 3 loài đã đƣợc công nhận là: P.nigricans Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc sinh trƣởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp nhăn, màu đen. Tế bào dạng hình cầu đến elip. Bào tử đính chuyển từ không màu sang nâu đậm hoặc đen [5, 7]. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650.org) K20 – Vi sinh vật học 2 Đinh Đức Hiền TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ 1.

Chi Exophiala Đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1966 bởi Carmichael với loài mới Exophiala salmonis [5]. Đến nay chi này gồm 28 loài: E. Exophiala phân bố nhiều trong đất, nƣớc, thực vật, gỗ mục,. và là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở ngƣời.

Exophiala có đặc điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể tóm tắt nhƣ sau: Chiếm ƣu thế trong môi trƣờng nuôi cấy là tế bào là dạng phân đốt, thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào, đôi khi gồm hai tế bào. Khi còn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy chồi giống nhƣ nấm men thông thƣờng, xếp thành chuỗi dài. Sau một thời gian nuôi cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt. Các đốt này có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trƣng bởi các eo thắt hẹp.

Sau đó, từ các đốt sinh ra các bào tử hình elip kích thƣớc 1-3  3-6 μm. Các bào tử này thƣờng gồm một tế bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [5, 7]. Hình ảnh tế bào của Exophiala salmonis CBS 157. Chi Aureobasidium Các loài thuộc Aureobasidium có phổ phân bố tƣơng đối rộng và đƣợc tìm thấy trong đất, xác thực vật, lá cây.

Aureobasidium gồm 14 loài trong đó A. pullulans đƣợc biết đến nhiều nhất. Về mặt hình thái, Aureobasidium tạo khuẩn lạc lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm từ 2-10 μm.

K20 – Vi sinh vật học 3 Đinh Đức Hiền TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Không phát hiện thấy cuống bào tử đính. Aureobasidium sinh sản vô tính với bào tử đơn bào, kích thƣớc 2-3  4-6 µm, không màu, hình bầu dục đến hình trụ, tập trung thành từng đám. Các bào tử này sau đó tiếp tục sinh sản bằng nảy chồi hoặc hình thành túi bào tử thứ cấp [7]. Hình ảnh tế bào chủng Aureobasidium pullulans (Nguồn www.

Chi Moniliella Sau khi chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi Stolk & Dakin (1966) cho hai loài mới là M. Tiếp theo hai loài Moniliella suaveolens và Moniliella mellis, đã đƣợc miêu tả bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975), đến năm 1984, de Hoog miêu tả một loài mới là M. Chi Trichosporonoides đƣợc coi là tƣơng tự nhƣ chi Moniliella, khác biệt chủ yếu bởi kích thƣớc khuẩn lạc và tế bào nhỏ hơn [8]. Trong các nghiên cứu sau đó, cho thấy hai chi này tƣơng đồng với nhau [8].

Năm 2009, Rosa và cộng sự đã xác định các giả thuyết này bằng so sánh trình tự vùng D1/D2 của rDNA 26S và đi đến kết luận Moniliella và Trichosporonoides đƣợc xếp vào cùng một chi, loài M. pollinis có trình tự vùng D1/D2 giống với Trichosporonoide madida, chỉ khác nhau bởi tỉ lệ G+C tƣơng ứng là 50.2, do đó hai loài này thống nhất tên là M. pollinis đƣợc mô tả khác với M. tomemtosa về hình thái và mức độ chuyển hóa tạo erythritol, nhƣng về trình tự D1/D2 cho thấy chúng tƣơng đồng nhau.

Nhƣ vậy cho đến trƣớc nghiên cứu này chi Moniliella gồm 9 loài nhƣ sau [24]. K20 – Vi sinh vật học 4 Đinh Đức Hiền TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin (1966) Moniliella fonsecae Rosa, Jindamorakot, Limtong, Nakase, Lachance, Fidalgo- Jiménez, Daniel, Pagnocca, Inácio & Morais (2008) Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance (2008) Moniliella mellis (Fabian & Quinet) V. Rao & de Hoog (1975) Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008) Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008) Moniliella pollinis (Hennebert & Verachtert) de Hoog & Guého (1984) Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008) Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx (1972) Phần lớn các loài thuộc chi Moniliella phân lập đƣợc thƣờng phân bố ở những nơi có nhiều dầu mỡ hoặc nơi có nồng độ đƣờng cao nhƣ phấn hoa, mật ong…Ví dụ, M. acetoabutens cho tới nay chỉ gặp trên các mẫu thực phẩm lên men có độ chua cao nhƣ xốt hoa quả, dƣa muối, M.

mellis từ mật ong, M. nigrescens từ jam, marmalade hỏng, M. spathulata từ sữa trâu, M. suaveolens từ sữa, bơ, phomat … M.

fonsecae phân lập từ hoa Angelonia pilosella, M. megachiliensis phân lập từ côn trùng, M. oedocephalis từ mật ong, M. pollinis từ phấn hoa.

Về mặt hình thái học, những loài thuộc chi Moniliella có khuẩn lạc màu hơi xám đến đen oliu, sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và hình thành sợi nấm và bào tử đốt. fonsecae, những loài thuộc chi Moniliella mang những đặc tính đặc biệt trong số những nấm đảm (Basidiomycetous) với khả năng chịu áp suất thẩm thấu và lên men. Moniliella có những đặc trƣng về cấu trúc nhƣ thành tế bào gồm nhiều lớp và thiếu xylose, fucose. Vách tế bào có các cấu trúc lỗ, vách ngăn (dolispores) với các kênh hẹp [20].

Moniliella phản ứng dƣơng tính với Diazonium blue. Tất cả các loài có khả năng đồng hóa nitrat và sản sinh urease. Ubiquinone isoprenologue chính đƣợc xác định trong Moniliella là Co-Q9. Sự phân nhánh các loài của chi Moniliella đƣợc nghiên cứu bởi phân tích trình tự vùng D1/D2 của gen LSU rRNA, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các loài là cao.

Trong đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA, các loài có thể sai khác nhau đến K20 – Vi sinh vật học 5 Đinh Đức Hiền TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ 15% thậm chí là hơn [22]. Di truyền không đồng nhất trong chi cũng đƣợc thể hiện qua hơn 16% sai khác về tỷ lệ G+C trong DNA [4]. Mặc dù các loài thuộc chi Moniliella biểu hiện một số hóa phân loại và siêu cấu trúc giống những loài thuộc ngành Ustilaginomycotina, thế nhƣng việc sắp xếp vào bậc phân loại cao hơn là không đảm bảo bởi phân tích D1/D2 LSU rRNA hoặc các đoạn gen rRNA khác [22]. Một sự hiểu biết rõ ràng hơn về sự tiến hóa của chi sẽ đƣợc xác định dựa trên việc phát hiện ra nhiều loài mới để lấp vào các khoảng trống giữa các đơn vị phân loại đã đƣợc thiết lập.

Thêm nữa, nghiên cứu về chi Moniliella ngày càng đƣợc thúc đẩy do những đặc tính trong sinh trƣởng của chúng nhƣ ƣa lipit, chịu áp suất thẩm thấu, điều này hứa hẹn triển vọng cho các quá trình công nghệ sinh học. Thực tế, những loài thuộc chi Moniliella đang đƣợc dùng trong sản xuất erythritol thƣơng mại [23]. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella acetoabuten CBS 169.org) K20 – Vi sinh vật học 6 Đinh Đức Hiền TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Hình 5. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella.

Phylloporia pectinata đƣợc sử dụng nhƣ nhóm ngoài. Mã số GenBank của trình tự rDNA đƣợc đƣa ra sau tên loài. Thanh chèn tƣơng ứng 5% khác biệt trình tự. So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp có thể bị nhầm lẫn với Moniliella.

Chi Đặc điểm Phân bố Khuẩn lạc mịn, sau đó bông xù, thƣờng từ Phân bố ở những nơi có màu trắng rồi chuyển dần sang màu vàng nhiều dầu mỡ hoặc Moniliella xanh, xám, đen.