Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase htert

Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase hTERT ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học.

• Tác giả: Hoàng Thị Ngà
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase
• 1.2. Giới thiệu chung telomere ở người
• 1.3. Hoạt động telomerase ở người
• 1.4. Tình hình nghiên cứu hTERT
• 1.5. Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT
• 1.6. Tổng quan về chitosan
• 1.6.1. Giới thiệu chung chitosan
• 1.6.2. Ứng dụng của chitosan
• 1.6.3. Giới thiệu chung về nano chitosan
• 1.6.4. Chitosan, chất mang dẫn truyền gen
• 1.6.5. Các phương pháp tạo nano chitosan
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Môi trường và dung dịch
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3
• 2.3.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
• 2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.3.4. Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose
• 2.3.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E
• 2.3.6. Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pcDNA3.1 (+) đã tích hợp gen mã hóa hTERT
• 2.3.7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 2.3.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
• 2.3.9. Phương pháp tạo hạt nano chitosan
• 2.3.10. Phương pháp tạo phức hệ nano chitosan/vector mang hTERT
• 2.3.11. Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM)
• 2.3.12. Phương pháp đo size, phân bố size và thế zeta
• 2.3.13. Phương pháp xác định hiệu quả đóng gói
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế vector pcDNA3. Tổng hợp đoạn gen hTERT
• 3.2. Chuẩn bị vector pcDNA3.1 mở vòng với hai enzyme BamHI và XbaI
• 3.3. Gắn đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) và chọn lọc vector pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT
• 3.4. Xác định trình tự đoạn gen hTERT trong plasmid tái tổ hợp
• 3.5. Kết quả tạo hạt nano chitosan
• 3.5.1. Tạo chitosan phân tử lượng thấp từ chitosan phân tử lượng trung bình
• 3.5.2. Tạo hạt nano chitosan/TPP
• 3.6. Kết quả tạo phức nano chitosan mang plasmid DNA mã hóa cho hTERT
• 3.6.1. Tạo hạt nano chitosan mang vector tái tổ hợp pcDNA3
• 3.6.2. Đánh giá khả năng mang DNA của hạt nano chitosan
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT

Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT) đang thu hút sự quan tâm lớn trong lĩnh vực y học. Telomerase là enzyme quan trọng trong việc duy trì chiều dài telomere, có liên quan mật thiết đến sự phát triển của tế bào ung thư. Việc sử dụng chitosan như một chất mang gen hứa hẹn sẽ cải thiện hiệu quả của liệu pháp điều trị ung thư.

1.1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase và vai trò của nó

Telomerase reverse transcriptase (hTERT) là một enzyme ribonucleoprotein, có vai trò quan trọng trong việc duy trì chiều dài telomere. Hoạt động của hTERT chủ yếu diễn ra trong các tế bào ung thư, giúp chúng duy trì khả năng phân chia vô hạn. Nghiên cứu cho thấy hTERT có thể là mục tiêu quan trọng trong liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư.

1.2. Chitosan và ứng dụng trong y học

Chitosan là một polymer tự nhiên, có khả năng phân hủy sinh học và không độc hại. Với tính chất tích điện dương, chitosan có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, làm cho nó trở thành một chất mang gen lý tưởng. Nghiên cứu cho thấy chitosan có thể bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của nuclease, từ đó nâng cao hiệu quả của liệu pháp điều trị.

II. Thách thức trong nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT cũng gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như khả năng chuyển giao gen, độ ổn định của phức hợp và khả năng kích thích miễn dịch cần được giải quyết để đảm bảo hiệu quả điều trị.

2.1. Khó khăn trong việc chuyển giao gen vào tế bào

Một trong những thách thức lớn nhất là khả năng chuyển giao gen hTERT vào tế bào mục tiêu. Các phương pháp hiện tại vẫn chưa đạt được hiệu quả tối ưu, do đó cần nghiên cứu thêm về các kỹ thuật mới để cải thiện khả năng này.

2.2. Độ ổn định của phức hợp nano chitosan

Độ ổn định của phức hợp nano chitosan mang gen hTERT là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện bảo quản và sử dụng để đảm bảo phức hợp không bị phân hủy trước khi đến được tế bào mục tiêu.

III. Phương pháp nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT

Để chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm việc thiết kế vector tái tổ hợp, tạo hạt nano chitosan và đánh giá khả năng mang DNA của phức hợp.

3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1 hTERT

Vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT được thiết kế để mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT. Việc này giúp tăng cường khả năng kích thích miễn dịch của phức hợp.

3.2. Tạo hạt nano chitosan TPP

Hạt nano chitosan/TPP được tạo ra thông qua các phương pháp hóa học, nhằm đảm bảo kích thước và tính chất lý hóa phù hợp cho việc mang gen. Kích thước hạt nano là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng chuyển giao gen.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của phức hệ nano chitosan mang gen hTERT

Kết quả nghiên cứu cho thấy phức hệ nano chitosan mang gen hTERT có khả năng mang DNA hiệu quả và kích thích phản ứng miễn dịch. Những ứng dụng thực tiễn của phức hệ này có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

4.1. Đánh giá khả năng mang DNA của hạt nano chitosan

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hạt nano chitosan có khả năng mang DNA cao, giúp tăng cường hiệu quả của liệu pháp điều trị ung thư. Kết quả này mở ra nhiều triển vọng cho việc phát triển các loại vaccine DNA mới.

4.2. Triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thư

Phức hệ nano chitosan mang gen hTERT có thể được ứng dụng trong điều trị ung thư, giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Nghiên cứu này có thể là bước đệm cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT

Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen hTERT đã mở ra nhiều cơ hội mới trong điều trị ung thư. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để giải quyết các thách thức hiện tại và tối ưu hóa hiệu quả của phức hợp.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy phức hệ nano chitosan mang gen hTERT có khả năng mang DNA và kích thích miễn dịch tốt. Điều này cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện khả năng chuyển giao gen và độ ổn định của phức hợp. Các nghiên cứu cũng nên tập trung vào việc đánh giá hiệu quả lâm sàng của phức hệ này trong điều trị ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư là một trong những căn bệnh nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao và số người mắc ngày càng tăng trên toàn cầu. Theo ước tính, khoảng 85% các khối u ác tính ở người biểu hiện hoạt động của enzyme telomerase, đặc biệt là thành phần phiên mã ngược telomerase reverse transcriptase (hTERT). Hoạt động của hTERT giúp tế bào ung thư duy trì khả năng phân chia vô hạn, góp phần vào sự phát triển và di căn của khối u. Các phương pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị thường chỉ kiểm soát tạm thời khối u mà không tiêu diệt tận gốc, đồng thời gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng.

Trong bối cảnh đó, liệu pháp miễn dịch, đặc biệt là vaccine DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT, được xem là hướng đi triển vọng trong điều trị ung thư. Vaccine DNA có ưu điểm an toàn, ổn định, dễ sản xuất và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, giảm thiểu độc tính so với các liệu pháp truyền thống. Tuy nhiên, để tăng hiệu quả chuyển gen và bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy, cần có chất mang phù hợp.

Chitosan, một polymer tự nhiên có tính sinh học cao, không độc hại và có khả năng phân hủy sinh học, được nghiên cứu rộng rãi làm chất mang dẫn truyền gen. Công nghệ nano chitosan giúp tạo ra các hạt nano có kích thước từ 10 đến 1000 nm, dễ dàng thâm nhập tế bào và bảo vệ DNA hiệu quả. Luận văn này tập trung nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa hTERT nhằm phát triển nền tảng cho vaccine DNA điều trị ung thư, với mục tiêu thiết kế thành công vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+) mang gen hTERT và tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thước phù hợp để bao gói plasmid DNA.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết về telomere và telomerase: Telomere là cấu trúc bảo vệ đầu mút nhiễm sắc thể, gồm chuỗi lặp TTAGGG dài từ 5000 đến 15000 base pairs. Telomerase, gồm RNA khuôn hTR và enzyme phiên mã ngược hTERT, có vai trò duy trì chiều dài telomere, giúp tế bào tránh lão hóa và chết theo chương trình. Hoạt động telomerase cao được phát hiện trong khoảng 85% các khối u ác tính, làm tăng khả năng phân chia tế bào ung thư.

• Mô hình vaccine DNA: Vaccine DNA sử dụng plasmid mang gen mã hóa kháng nguyên, được biểu hiện trong tế bào vật chủ để kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Cơ chế miễn dịch bao gồm trình diện kháng nguyên qua phân tử MHC lớp I và II, kích hoạt tế bào T CD8+ và CD4+, từ đó tạo ra phản ứng miễn dịch chống lại tế bào ung thư biểu hiện hTERT.

• Lý thuyết về chitosan và nano chitosan: Chitosan là polymer tích điện dương, có khả năng tạo phức hợp với DNA tích điện âm nhờ tương tác tĩnh điện, bảo vệ DNA khỏi phân hủy bởi nuclease. Nano chitosan có kích thước nhỏ, dễ dàng thâm nhập tế bào, có tính tương thích sinh học cao và khả năng phân hủy sinh học, phù hợp làm chất mang dẫn truyền gen.

Các khái niệm chính bao gồm: telomere, hTERT, vaccine DNA, chitosan, nano chitosan, phức hệ nano chitosan/plasmid DNA, epitope GV1001.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng đoạn gen mã hóa epitope GV1001 của hTERT được tổng hợp nhân tạo, vector biểu hiện pcDNA3.1(+), các hóa chất và thiết bị tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm công nghệ gen.

• Phương pháp tổng hợp và tích hợp gen: Đoạn gen hTERT được tổng hợp từ hai oligonucleotide, tích hợp vào vector pcDNA3.1(+) đã mở vòng bằng enzyme BamHI và XbaI, sử dụng enzyme T4 DNA ligase xúc tác. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.

• Phương pháp tạo nano chitosan: Chitosan phân tử lượng thấp được tạo từ chitosan trung bình bằng phản ứng deacetyl hóa. Hạt nano chitosan/TPP được tạo bằng phương pháp gel ion dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và tripolyphosphate (TPP) tích điện âm.

• Tạo phức hệ nano chitosan/plasmid DNA: Plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT được bao gói trong hạt nano chitosan/TPP bằng phương pháp gel ion, khuấy trộn và ly tâm tách hạt.

• Phân tích và đánh giá: Kích thước hạt, phân bố kích thước và thế zeta được đo bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động học (DLS). Hình ảnh bề mặt hạt được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Hiệu quả đóng gói DNA được xác định bằng phương pháp đo nồng độ DNA còn lại trong dịch nổi sau ly tâm, sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop. Trình tự nucleotide của plasmid tái tổ hợp được xác định bằng phương pháp giải trình tự Sanger.

• Timeline nghiên cứu: Quá trình nghiên cứu được thực hiện trong năm 2013 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, phối hợp với Viện Công nghệ Sinh học và Viện Khoa học Vật liệu thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế và xác nhận vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT: Đoạn gen hTERT chứa epitope GV1001 được tổng hợp thành công với trình tự nucleotide chính xác, có chiều gắn đúng và khung đọc mở. Vector pcDNA3.1(+) được mở vòng bằng enzyme BamHI và XbaI, sau đó gắn đoạn gen hTERT bằng enzyme T4 DNA ligase. Kết quả biến nạp vào E. coli cho thấy số lượng khuẩn lạc cao, với tỷ lệ thành công chọn lọc plasmid tái tổ hợp đạt khoảng 75%. Trình tự nucleotide xác nhận độ tương đồng 100% với gen hTERT chuẩn.

2. Tạo chitosan phân tử lượng thấp: Chitosan phân tử lượng thấp được tạo từ chitosan trung bình bằng phản ứng deacetyl hóa, thu được sản phẩm màu vàng, bảo quản ở 4°C. Đây là bước quan trọng để tạo hạt nano có kích thước nhỏ và đồng nhất.

3. Tạo hạt nano chitosan/TPP: Hạt nano chitosan/TPP được tạo thành với kích thước trung bình khoảng 150 nm, chỉ số đa phân tán (PdI) dưới 0.3, cho thấy độ đồng nhất cao. Thế zeta của hạt đạt khoảng +35 mV, đảm bảo độ ổn định trung bình đến tốt của hệ keo.

4. Tạo phức hệ nano chitosan/plasmid DNA: Phức hệ nano chitosan/plasmid DNA có kích thước trung bình khoảng 200 nm, thế zeta giảm nhẹ còn +25 mV do sự bao gói DNA. Hiệu quả đóng gói DNA đạt trên 85%, chứng tỏ khả năng bảo vệ DNA khỏi phân hủy bởi enzyme DNase I. Hình ảnh SEM cho thấy hạt nano có bề mặt mịn, kích thước đồng đều.

Thảo luận kết quả

Việc thiết kế thành công vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT với đoạn gen mã hóa epitope GV1001 là bước nền tảng quan trọng cho nghiên cứu vaccine DNA. Kết quả biến nạp và chọn lọc plasmid tái tổ hợp cho thấy phương pháp sốc nhiệt và sử dụng kháng sinh ampicillin hiệu quả trong việc thu nhận dòng vi khuẩn mang plasmid mong muốn.

Chitosan phân tử lượng thấp được tạo ra giúp cải thiện tính chất vật lý của hạt nano, đặc biệt là kích thước và độ đồng nhất. Kích thước hạt nano chitosan/TPP phù hợp với kích thước khoảng cách giữa các tế bào trong mô ung thư (80-800 nm), giúp hạt dễ dàng thâm nhập và vận chuyển gen vào tế bào đích.

Thế zeta dương của hạt nano chitosan/TPP và phức hệ nano chitosan/plasmid DNA đảm bảo độ ổn định của hệ phân tán, giảm thiểu hiện tượng keo tụ. Hiệu quả đóng gói DNA cao chứng tỏ chitosan có khả năng bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy enzymatic, tăng khả năng chuyển gen thành công.

So sánh với các nghiên cứu khác, kết quả này phù hợp với báo cáo về khả năng tạo phức nano chitosan mang DNA của các nhóm nghiên cứu quốc tế, đồng thời mở ra triển vọng ứng dụng trong phát triển vaccine DNA điều trị ung thư. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ kích thước hạt, thế zeta và hiệu quả đóng gói DNA, cùng bảng so sánh trình tự nucleotide.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình tạo hạt nano chitosan: Điều chỉnh tỷ lệ chitosan và TPP, pH môi trường để đạt kích thước hạt nhỏ hơn 150 nm và PdI dưới 0.2 nhằm tăng hiệu quả thâm nhập tế bào. Thời gian thực hiện: 6 tháng. Chủ thể: nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học.

2. Nghiên cứu in vitro và in vivo về hiệu quả chuyển gen và đáp ứng miễn dịch: Thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư và mô hình động vật để đánh giá khả năng biểu hiện gen hTERT và kích thích đáp ứng miễn dịch. Thời gian: 12 tháng. Chủ thể: phòng thí nghiệm miễn dịch học.

3. Phát triển hệ thống phân phối vaccine DNA dựa trên nano chitosan: Thiết kế các công thức vaccine DNA mang hTERT với các tá dược hỗ trợ nhằm tăng cường tính ổn định và khả năng kích thích miễn dịch. Thời gian: 18 tháng. Chủ thể: công ty dược phẩm công nghệ cao.

4. Đánh giá an toàn và độc tính của phức hệ nano chitosan/plasmid DNA: Thực hiện các thử nghiệm độc tính cấp và bán cấp trên mô hình động vật để đảm bảo tính an toàn trước khi thử nghiệm lâm sàng. Thời gian: 12 tháng. Chủ thể: trung tâm nghiên cứu dược lý.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và miễn dịch học: Có thể ứng dụng kết quả nghiên cứu để phát triển các hệ dẫn truyền gen mới, vaccine DNA điều trị ung thư và các bệnh lý khác.

2. Doanh nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học: Tham khảo để phát triển sản phẩm vaccine DNA dựa trên nền tảng nano chitosan, nâng cao hiệu quả và an toàn điều trị.

3. Giảng viên và sinh viên ngành sinh học, công nghệ sinh học: Sử dụng luận văn làm tài liệu tham khảo về kỹ thuật tạo vector tái tổ hợp, công nghệ nano chitosan và ứng dụng trong liệu pháp gen.

4. Cơ quan quản lý y tế và nghiên cứu lâm sàng: Tham khảo để đánh giá tiềm năng và hướng phát triển vaccine DNA trong điều trị ung thư, hỗ trợ xây dựng chính sách nghiên cứu và ứng dụng.

Câu hỏi thường gặp

1. Nano chitosan có ưu điểm gì so với các chất mang gen khác?
   Nano chitosan có kích thước nhỏ, tích điện dương giúp tạo phức hợp bền vững với DNA tích điện âm, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzym, đồng thời có tính tương thích sinh học cao và khả năng phân hủy sinh học, giảm thiểu độc tính so với các chất mang tổng hợp khác.

2. Tại sao chọn epitope GV1001 của hTERT làm mục tiêu vaccine?
   Epitope GV1001 có khả năng liên kết đồng thời với phân tử MHC lớp I và II, kích thích cả tế bào T CD4+ và CD8+, tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và tự nhiên, đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I/II với tỷ lệ phản ứng miễn dịch 50-80% ở bệnh nhân ung thư.

3. Phương pháp gel ion tạo hạt nano chitosan có ưu điểm gì?
   Phương pháp gel ion đơn giản, không sử dụng dung môi hữu cơ độc hại, thực hiện trong môi trường nước, kiểm soát được kích thước và điện tích bề mặt hạt, phù hợp cho ứng dụng y sinh và dược phẩm.

4. Làm thế nào để đánh giá hiệu quả đóng gói DNA trong hạt nano?
   Hiệu quả đóng gói được xác định bằng cách đo nồng độ DNA còn lại trong dịch nổi sau ly tâm, so sánh với lượng DNA ban đầu, thường sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop ở bước sóng 260 nm.

5. Có nguy cơ nào khi sử dụng vaccine DNA mang gen hTERT không?
   Nguy cơ chính là khả năng plasmid DNA tích hợp vào hệ gen vật chủ gây đột biến. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu thực nghiệm, tỷ lệ này rất thấp, thấp hơn nhiều so với tỷ lệ đột biến tự phát, đồng thời vaccine DNA có ưu điểm an toàn và ít tác dụng phụ so với các loại vaccine truyền thống.

Kết luận

• Đã thiết kế và tạo thành công vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+) mang gen mã hóa epitope GV1001 của hTERT với trình tự chính xác và khả năng biểu hiện trong tế bào động vật.
• Đã tạo được chitosan phân tử lượng thấp và hạt nano chitosan/TPP có kích thước trung bình khoảng 150 nm, thế zeta +35 mV, đảm bảo độ ổn định và phù hợp cho dẫn truyền gen.
• Phức hệ nano chitosan/plasmid DNA có kích thước khoảng 200 nm, hiệu quả đóng gói DNA trên 85%, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzym, phù hợp làm nền tảng vaccine DNA điều trị ung thư.
• Kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ nano chitosan trong liệu pháp miễn dịch ung thư, đặc biệt vaccine DNA mang gen hTERT.
• Các bước tiếp theo bao gồm tối ưu hóa quy trình tạo hạt, đánh giá hiệu quả chuyển gen và đáp ứng miễn dịch in vitro, in vivo, cũng như nghiên cứu an toàn độc tính để tiến tới thử nghiệm lâm sàng.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học tiếp tục phát triển và ứng dụng phức hệ nano chitosan mang gen hTERT trong điều trị ung thư, góp phần nâng cao hiệu quả và an toàn cho bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ung thƣ là một căn bệnh hiểm nghèo, bệnh nhân mắc bệnh có tỷ lệ tử vong cao và hiện nay số ngƣời mắc bệnh ngày càng tăng. Mặc dù cộng đồng y sinh đã rất nỗ lực nhƣng ung thƣ vẫn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến cái chết, đau khổ và bệnh tật. Hầu hết các bệnh nhân ung thƣ đƣợc điều trị bởi các liệu pháp: phẫu thuật, xạ trị hoặc hóa trị. Các phƣơng pháp này cũng chỉ ngăn chặn tạm thời không tiêu diệt đƣợc tận gốc khối u nguyên phát.

Bên cạnh đó, các phƣơng pháp này không đặc hiệu thƣờng gây ra tác dụng phụ gây suy nhƣợc, đau đớn cho cơ thể ngƣời bệnh, phá hủy các mô khỏe mạnh. Với hy vọng khắc phục những trở ngại trên, nhiều nhà khoa học đang tập trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại căn bệnh ung thƣ. Một trong các liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thƣ, vaccine ung thƣ cung cấp các lợi thế khác biệt so với phƣơng pháp tiếp cận thông thƣờng: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ đƣợc tính kháng thuốc, và tiềm năng bền trong điều trị thông qua bộ nhớ miễn dịch,. Với sự phát triển của công nghệ nano, vaccine dạng nano đang đƣợc nghiên cứu.

Các vaccine dạng này thƣờng cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo hộ cao. Telomerase là một enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere của đầu cuối nhiễm sắc thể trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR và hTERT. hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc.

Chúng hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT sẽ mang lại nhiều triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thƣ. Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các epitope của hTERT và nhận thấy rằng chúng có đáp ứng miễn dịch rất tốt với hầu hết các tế bào ung thƣ. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học Việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển vọng, nhƣng để tăng cƣờng quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin cần có một chất mang.

Cùng với phát triển của công nghệ nano các chất mang có bản chất polymer có khả năng liên kết và bảo vệ DNA đã đƣợc chọn làm chất truyền trung gian. Một trong các polymer đặc biệt đƣợc quan tâm là chitosan, công nghệ nano chitosan hiện nay đã đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y học nhƣ để phân phối thuốc và đang đƣợc ứng dụng trong nhiều nghiên cứu làm vật liệu dẫn truyền vacxin DNA. Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một loại polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và tan tốt trong môi trƣờng axit. Vì chitosan tích điện dƣơng nên có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, do vậy nó hứa hẹn là ứng cử viên tốt cho hệ thống mang gen.

Ngoài khả năng chitosan liên kết hiệu quả với DNA chúng còn có thể bảo vệ DNA khỏi phân hủy của nuclease. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)”. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3. Hệ vector tái tổ hợp này đƣợc bao gói trong nano chitosan.

Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT. - Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thƣớc mong muốn. - Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3. Đánh giá khả năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP.

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase 1. Giới thiệu chung telomere ở người Nhiễm sắc thể điển hình có chứa một cấu trúc đặc biệt ở hai đầu, đƣợc gọi là telomere.

Telomere là cấu trúc bao gồm một chuỗi lặp đi lặp lại TTAGGG [33], [48]. Ở ngƣời các chuỗi lặp lại của telomere có từ 5000 đến 15000 base. Telomere có nhiệm vụ đảm bảo sự bền vững của nhiễm sắc thể, chống lại thoái hóa có hại, chống lại sự tái tổ hợp sai lạc. Trình tự này sẽ mất dần đi sau mỗi lần phân chia, khi các telomere trở nên quá ngắn thì các nhiễm sắc thể sẽ kém bền vững, chúng không thể bám đƣợc vào màng nhân tế bào, bị dính vào nhau và có hình dạng kì dị và là các dấu hiệu dẫn đến sự thoái hóa của tế bào.

Ở ngƣời, sự rút ngắn telomere của nguyên bào sợi từ 50-100 cặp base với mỗi lần tế bào phân chia, và nguyên bào sợi lão hóa sau 50-70 lần phân chia. Vì vậy, có giả thiết rằng telomere rút ngắn đến một chiều dài nhất định sẽ dẫn đến tế bào già và chết [37]. Rút ngắn chiều dài telomere thƣờng dẫn đến sự mất ổn định hệ gen, dẫn đến mất kiểm soát chu kì tế bào, một dấu hiệu của ung thƣ. Sự rút ngắn telomere đƣợc nghiên cứu là có liên quan tới việc tăng nguy cơ một số bệnh ung thƣ của con ngƣời, bao gồm: bàng quang, phổi, thực quản, tụy, buồng trứng và tuyến giáp [14], [17], [42], [60], [73].

Các tế bào chống lại sự rút ngắn này bằng cách sử dụng một enzyme phiên mã ngƣợc gọi là telomerase. Ở các loài, các tế bào khác nhau thì chiều dài telomere là khác nhau, chiều dài này phụ thuộc vào loại mô, độ tuổi và lịch sử nhân lên của tế bào. Chiều dài telomere hai đầu nhiễm sắc thể thay đổi rõ rệt giữa các nhiễm sắc thể khác nhau (Hình 1. Ví dụ NST 17p thƣờng có telomere ngắn hơn so với hầu hết các telomere nhiễm sắc thể khác [58].

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1. Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau Telomere được hiển thị màu vàng, DNA của nhiễm sắc thể hiện màu xanh [53]. Khi tế bào ở trạng thái không phân chia, tức là từ pha G2 trở đi, thì telomere sẽ liên kết với một số loại protein gắn chuyên biệt lên các trình tự nằm ở ngay gần vùng telomere nhằm tạo nên một cấu trúc phức tạp và vững chắc, đƣợc gọi là T- loop. Cấu trúc T-loop này đóng vai trò quan trọng bảo vệ đầu mút DNA nhiễm sắc thể khỏi tác động của các enzyme hay các đáp ứng không thích hợp gây nguy hại đến DNA, cũng nhƣ hiện tƣợng dung hợp các đầu mút nhiễm sắc thể hay hiện tƣợng tái tổ hợp tƣơng đồng giữa các vùng temomere [26].

- Các protein quan trọng liên quan đến duy trì sự ổn định telomere và điều chỉnh chiều dài telomere. Cấu trúc T-loop của telomere liên quan tới các loại protein bám trên mạch: + POT1 (protection of Telomeres-1) khi hình thành cấu trúc T-loop, một đoạn DNA phía dƣới vòng cung do DNA uốn lại, sẽ tách ra làm 2 mạch đơn, protein POT1 bám vào mạch 3’, làm nhiệm vụ bảo vệ mạch và ngăn không cho 2 mạch bắt cặp lại với nhau [56]. + Các phức hợp TRF1 và TRF2 cùng với các protein tƣơng tác với chúng Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1. Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere [26].

+ Phức hợp protein TRF1 gồm TRF1, Tankyrase ½, PINX1, Tin2, và POT1, có vai trò trong việc kiểm soát sự tăng chiều dài telomere thông qua việc tiếp nhận telomerase lên telomere. Ngoài ra, còn có các enzyme khác nhƣ Ku70/80, DNA- PK, Bloom helicase [56], [78], [89]. + Phức hợp protein TRF2 gồm TRF2, phức hợp (MRE11, RAD50, NBS1), WRN, ERCC1/XPF, kết hợp với POT1 ngăn chặn sự bắt cặp giữa các đoạn cuối NST với nhau. Ngoài ra, TRF2 còn tƣơng tác với yếu tố phát tín hiệu sửa chữa NST để bảo vệ telomere khỏi các enzyme sửa chữa [27].

Hoạt động telomerase ở người Telomerase là ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere đầu cuối của nhiễm sắc thể. Chúng hoạt động rất ít ở trong tế bào thƣờng, nhƣng hoạt động phổ biến trong các dòng tế bào ung thƣ ngƣời và tìm thấy khoảng 85% các khối u [47], [70]. Hoạt động của telomerase chống telomere rút ngắn trong quá trình sao chép bằng cách tổng hợp DNA lặp lại telomeric mới ở đầu cuối nhiễm sắc thể. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ gồm hTR, hTERT.

hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc, giúp thêm telomeric Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học lặp đi lặp lại đầu tận cùng nhiễm sắc thể [11], [87]. Cả hai hTR và hTERT đều biểu hiện rất thấp ở tế bào thƣờng. Protein hTERT bao gồm 1132 axit amin đƣợc mã hóa bởi gen hTERT nằm trên NST 5p15. Tổ chức gen hTERT có tổ chức nhƣ sau: Hình 1.

Tổ chức gen của hTERT [23] Gen hTERT ở ngƣời gồm 16 exon và 15 intron kéo dài hơn 40 kb [23], nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 5 (5p15.33), khoảng 2 Mb từ telomere và đƣợc sao chép đến tâm động, miền sao đặc biệt của telomerase (T domain), miền reverse transcriptase (RT domain). Thành phần RNA của telomerase ngƣời có chừng 451 nucleotide (bao gồm cả telomere CAAUCCCAAUC mẫu), mã hóa bởi gen hTR nằm trên NST 3q21-q28 [30]. Trong đó các nucleotide 46-56 là vị trí gắn vào đầu cùng 3’-OH của telomere. Dựa trên quan sát thực nghiệm trong các ống nghiệm nuôi cấy tế bào và động vật, các chất ức chế telomerase có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thƣ và di căn [34], [40], [43].

Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng telomere là điều cần thiết cho sự tăng trƣởng bền vững của các tế bào bất tử và hoạt tính này xảy ra ở hầu hết các khối u ác tính [46], [77]. Gen hTERT hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ khoa học không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma [59], [63], [64], [79].