MỞ ĐẦU 1. Sự cần thiết của việc nghiên cứu đề tài Cùng với sự phát triển của xã hội, tình hình tội phạm càng ngày càng phức tạp, phương thức thủ đoạn phạm tội ngày càng tinh vi nên chỉ sử dụng những phương pháp giám định dấu vết truyền thống thông qua dấu vân tay, vải sợi… là không đủ cơ sở làm bằng chứng trong các vụ án. Ngày nay, nhờ có sự phát triển của công nghệ sinh học, với việc tìm ra cách tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào ở nhân tế bào người, khi ứng dụng vào công tác điều tra, các điều tra viên có thể truy nguyên cá thể một cách chính xác thông qua những dấu vết tưởng chừng như rất nhỏ mà thủ phạm để lại như dấu vết máu, tế bào trên đầu lọc thuốc lá, bã kẹo cao su. Hàng năm, Viện Khoa học hình sự nhận được rất nhiều trưng cầu giám định ADN, trong đó dấu vết để lại trong các vụ án hình sự không chỉ là máu, lông tóc hay tinh dịch mà còn là tử thi chưa rõ tung tích hoặc chỉ là các bộ phận trên cơ thể.
Khi đó việc giám định ADN từ các mẫu mô là rất khó khăn do tử thi đã bị thối rữa nhiều tháng, thậm chí đã phân hủy hoàn toàn qua nhiều năm, chỉ có thể giám định ADN thông qua răng và xương còn sót lại của nạn nhân. Điển hình như các vụ án ―xác chết không đầu‖, ―thẩm mỹ viện Cát Tường‖… là các vụ án rất được dư luận quan tâm. Tuy nhiên, với các mẫu hài cốt, việc phân tích ADN nhân tế bào gặp rất nhiều khó khăn, nhưng bù lại nếu phân tích được, dù chỉ một vài locus cũng rất có giá trị, thậm chí giá trị truy nguyên còn cao hơn cả việc phân tích được toàn bộ gen ty thể của hài cốt đó. Đặc biệt đối với việc xác định danh tính hài cốt liệt sĩ, nếu chỉ giám định bằng hệ gen ty thể thì không thể phân biệt từng cá thể do đặc điểm di truyền theo dòng mẹ.
Nhưng nếu thu được vài locus gen nhân tế bào, đã có thể truy nguyên chính xác danh tính của liệt sĩ, thông qua những người thân của họ. Mặt khác, đối với các hài cốt liệt sĩ thì lượng răng và xương thu được là hạn chế, nên cần phải tiến hành phân tích trên lượng mẫu tối thiểu do đó việc lựa chọn một quy trình tách chiết hiệu quả là bước 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Xuân Toàn Luận văn thạc sỹ khoa học quyết định sự thành công trong công tác giám định ADN nhân tế bào từ các mẫu hài cốt. Hiện nay, tại Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết ADN từ những dấu vết có số lượng ít, chất lượng thấp (hay còn được gọi là vi vết) như: dấu vết tế bào để lại thông qua việc cầm, nắm hay dấu vết nước bọt trên miệng chai nước, trên đầu lọc thuốc lá. cho kết quả tốt.
Vậy có thể sử dụng bộ kit này để tách chiết ADN từ hài cốt, một đối tượng cũng có hàm lượng ADN thấp và rất khó tách chiết hay không? Để góp phần giải quyết những vấn đề nêu trên, việc lựa chọn đề tài „Nghiên cứu ứng dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định ADN tại Việt Nam‟ với mong muốn nâng cao hiệu quả của việc tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ răng, xương là rất cần thiết. Mục đích nghiên cứu 2. Phân tích, đánh giá việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt. Đưa ra được quy trình tối ưu nhằm sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt để phục vụ công tác giám định ADN hình sự.
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ khám nghiệm hiện trường có các giải pháp thu thập và bảo quản những mẫu hài cốt để có khả năng phân tích được ADN tốt nhất. Nhiệm vụ nghiên cứu 3. Tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler®. Thiết kế các mô hình thí nghiệm để tìm phương pháp tách chiết tối ưu.
So sánh hiệu quả tách chiết ADN nhân tế bào từ các mẫu hài cốt khác nhau (răng và xương). 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Xuân Toàn Luận văn thạc sỹ khoa học 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4. Đối tượng: Các mẫu răng và xương được thu trực tiếp tại hiện trường hoặc thi thể của nạn nhân trong các vụ án xảy ra từ năm 2005 đến nay.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu việc tách chiết ADN nhân tế bào bằng bộ kit PrepFiler đối với các mẫu răng và xương thu từ các bộ hài cốt có thời gian từ 1 - 10 năm tính từ khi nạn nhân bị chết. Phƣơng pháp nghiên cứu 5. Phương pháp làm sạch mẫu. Phương pháp nghiền mẫu.
Tách chiết ADN nhân tế bào từ răng xương bằng bộ kit PrepFiler®. Định lượng sản phẩm ADN sau khi tách chiết. Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR. Điện di và phân tích ADN thu được.
Những đóng góp của đề tài: 6. Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt. Đưa ra được quy trình tối ưu sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định ADN từ hài cốt nói riêng và giám định ADN hình sự nói chung. Từ đó ứng dụng vào thực tế phân tích ADN hài cốt trong các vụ án hình sự.
Đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ khám nghiệm hiện trường có các giải pháp thu thập và bảo quản những mẫu hài cốt để có khả năng phân tích được ADN tốt nhất. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Xuân Toàn Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 1. Giám định ADN từ nhân tế bào trong Khoa học hình sự 1. Lịch sử giám định ADN trong khoa học hình sự Năm 1956 Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể được xếp thành 23 cặp tương đồng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính.
Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội). Thế hệ con cái nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng. Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46. Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhận biết qua vân tay, nhận biết các yếu tố di truyền có bản chất là protein (xác định nhóm máu, xác định một số yếu tố trong huyết thanh, xác định một số enzym) nhưng nói chung khả năng phân biệt còn thấp. Phải đến cuối thế kỉ 20, đặc biệt là trong thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sự mới ứng dụng công nghệ gen (DNA-Technology) vào trong xác định tội phạm. Năm 1985, Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester nước Anh khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hóa cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base nitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10 - 15 bp hoặc vài chục bp, các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh (Minisatellite) hay VNTR. Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm đầu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (Hypervariable regions) ở các vật liệu di truyền khác nhau của người.
Kỹ thuật để Jeffreys phân tích các đoạn lặp VNTR là kỹ thuật RFLP. Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng. Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong ADN của người. Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Xuân Toàn Luận văn thạc sỹ khoa học khác nhau.
Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể. Giám định ADN cho mục đích tư pháp ra đời từ đây. Phương pháp RFLP này lần đầu tiên được sử dụng để xác định đối tượng trong một vụ hiếp dâm xảy ra tại Anh vào năm 1986. Kể từ đó, việc kiểm tra truy nguyên cá thể bằng giám định ADN được phổ biến rộng rãi.
Cũng vào thời điểm năm 1985, tác giả Kary Mullis phát minh phản ứng chuỗi nhân gen PCR. Phản ứng PCR có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng kỹ thuật RFLP là chỉ cần một lượng rất ít ADN khuôn ban đầu sau hơn 20 - 30 chu kỳ phản ứng đã tạo ra được hàng triệu bản sao giống hệt nhau giúp cho việc phân tích trình tự ADN được dễ dàng. Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định ADN được giới thiệu, đó là phương pháp phân tích sử dụng các đoạn lặp ngắn (STR) có gắn chất huỳnh quang hay còn gọi là Microsatellite. Các STR thường có đoạn lặp từ 2 - 6 bp.
Năm 1997, trên thế giới đã đưa ra thông báo rằng có thể phân tích được ADN từ các vi vết trên các đồ vật đã được tiếp xúc với cơ thể con người. Từ đó mở ra cơ hội thu thập vi vết ADN từ nhiều loại vật chứng hơn (bao gồm: các công cụ, quần áo, phương tiện, súng, bao cao su, son môi, ví tiền, trang sức, kính, da, giấy tờ, bàn chải đánh răng). Giám định ADN Bằng việc sử dụng bộ kit Identifiler , Identifiler Plus và Identifiler Direct , cùng hệ thống máy móc đồng bộ của hãng ABI – Mỹ để phân tích 16 locus (gen) của các phân tử ADN nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau, các locus này có tính đặc trưng và sự đa hình cao ở người Việt Nam. Đây là bộ kit được dùng phổ biến nhất và là bộ kit chuẩn CODIS (Hệ thống chỉ số kết hợp ADN) của FBI, Mỹ gồm 15 locus STR trên nhiễm sắc thể thường và 1 marker giới tính.