Luận Văn Thạc Sĩ Công Nghệ Thực Phẩm: Nghiên Cứu Ứng Dụng Vi Bao Kháng Thể IgY

Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm nghiên cứu vi bao kháng thể IgY, ứng dụng công nghệ vi bao trong bảo quản và phát triển sản phẩm.

• Tác giả: Huỳnh Thành Đạt
• Người hướng dẫn: TS. Trần Bích Lam
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
• Đề tài: Nghiên Cứu Vi Bao Kháng Thể IgY
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Kháng thể IgY
• 1.2. Kỹ thuật vi bao
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Kháng thể IgY kháng Enterovirus 71 (EV 71)
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Quy trình vi bao kháng thể IgY kháng EV71
• 2.3.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.3. Các phương pháp phân tích
• 2.3.3.1. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.3.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp ELISA
• 2.3.3.3. Xác định độ bền của chế phẩm vi bao với điều kiện mô phỏng môi trường dạ dày (simulated gastric fluid - SGF)
• 2.3.3.4. Xác định phần trăm tải của IgY (IgY Loading Percentage) và hiệu quả vi bao (Encapsulation Efficiency - EE)
• 2.3.3.5. Đánh giá khả năng tự giải phóng In vitro của IgY (In vitro IgY Release)
• 2.3.4. Xác định hiệu quả vi bao (EE)
• 2.3.5. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy)
• 2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến hiệu quả vi bao
• 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hiệu quả vi bao
• 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường vi bao đến khả năng vi bao
• 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Chitosan đến hiệu quả vi bao
• 3.5. Khảo sát độ bền của chế phẩm vi bao trong điều kiện mô phỏng môi trường dạ dày
• 3.6. Xác định tải lượng IgY của chất bao (IgY Loading Percentage)
• 3.7. Đánh giá khả năng tự giải phóng In vitro của IgY
• 3.8. Đánh giá khả năng vi bao của chế phẩm vi bao
• 3.9. Đặc điểm hạt vi bao
• 3.10. Đánh giá kết quả nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1 - CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
• PHỤ LỤC 2 - CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Luận Văn Thạc Sĩ Công Nghệ Thực Phẩm

Luận văn thạc sĩ với chủ đề Nghiên cứu vi bao kháng thể IgY được thực hiện bởi Huỳnh Thành Đạt tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP.HCM. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình vi bao kháng thể IgY trong khuôn gel chitosan-alginate, nhằm bảo vệ hoạt tính kháng thể chống lại các yếu tố gây biến tính trong môi trường in vitro và in vivo. Mục tiêu chính là tạo tiền đề cho việc bổ sung chế phẩm vi bao vào các sản phẩm thực phẩm, đặc biệt là trong phòng ngừa bệnh tay chân miệng do virus EV71 gây ra.

1.1. Bối cảnh nghiên cứu

Bệnh tay chân miệng do virus EV71 gây ra đã trở thành vấn đề y tế nghiêm trọng tại Việt Nam và khu vực Châu Á - Thái Bình Dương. Hiện nay, chưa có thuốc đặc trị hoặc vắc-xin phòng ngừa hiệu quả. Kháng thể IgY được sản xuất từ lòng đỏ trứng gà đã được chứng minh có hiệu quả cao trong phòng ngừa và điều trị bệnh. Tuy nhiên, việc bảo vệ hoạt tính của IgY trong môi trường axit dạ dày là thách thức lớn. Nghiên cứu này nhằm giải quyết vấn đề đó thông qua kỹ thuật vi bao.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu hướng đến xây dựng quy trình vi bao kháng thể IgY trong khuôn gel chitosan-alginate, đảm bảo hoạt tính kháng thể được bảo vệ trong môi trường axit dạ dày và giải phóng hiệu quả trong ruột. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng chứa IgY, góp phần phòng ngừa bệnh tay chân miệng.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp vi bao để bao bọc kháng thể IgY trong khuôn gel chitosan-alginate. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vi bao như nồng độ sodium alginate, CaCl2, chitosan, và pH môi trường được khảo sát kỹ lưỡng. Quy trình vi bao được tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao nhất, đồng thời đánh giá độ bền của chế phẩm trong môi trường mô phỏng dạ dày (SGF) và khả năng giải phóng IgY trong môi trường ruột (SIF).

2.1. Quy trình vi bao

Quy trình vi bao kháng thể IgY bao gồm các bước: chuẩn bị dung dịch sodium alginate, tạo gel với CaCl2, và bao bọc bằng chitosan. Các thông số tối ưu được xác định thông qua thí nghiệm, bao gồm nồng độ sodium alginate 2.5%, pH môi trường 3, và nồng độ chitosan 2.2%. Hiệu suất vi bao đạt 63%, với khả năng tải IgY lên đến 80.572%.

2.2. Đánh giá độ bền và giải phóng

Chế phẩm vi bao được đánh giá độ bền trong môi trường SGF có pepsin. Kết quả cho thấy hoạt tính IgY được duy trì đến 3 giờ. Trong môi trường SIF, hạt vi bao bắt đầu phân rã và giải phóng hoàn toàn IgY sau 16 giờ. Điều này chứng tỏ hiệu quả bảo vệ và giải phóng của phương pháp vi bao.

III. Kết quả và ứng dụng

Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu hóa quy trình vi bao kháng thể IgY, đạt hiệu suất cao và độ bền tốt trong môi trường axit dạ dày. Kết quả này mở ra tiềm năng lớn trong việc ứng dụng IgY vào các sản phẩm thực phẩm chức năng, đặc biệt là trong phòng ngừa bệnh tay chân miệng. Nghiên cứu cũng góp phần thúc đẩy sự phát triển của công nghệ thực phẩm tại Việt Nam.

3.1. Hiệu quả vi bao

Hiệu suất vi bao đạt 63%, với khả năng tải IgY lên đến 80.572%. Chế phẩm vi bao sau sấy có hoạt tính kháng thể còn lại đạt 35.011%, đáp ứng yêu cầu về độ ẩm và độ bền. Kết quả này chứng minh tính khả thi của phương pháp vi bao trong bảo vệ hoạt tính IgY.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu tạo tiền đề cho việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng chứa IgY, đặc biệt là trong phòng ngừa bệnh tay chân miệng. Việc ứng dụng công nghệ vi bao không chỉ bảo vệ hoạt tính kháng thể mà còn tăng cường hiệu quả sử dụng trong thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tay chân miệng do Enterovirus 71 (EV71) gây ra là một vấn đề y tế nghiêm trọng, đặc biệt ở trẻ em, với các biến chứng nguy hiểm như viêm màng não, liệt mềm cấp và tỉ lệ tử vong cao. Tại Việt Nam, năm 2011 ghi nhận hơn 106.000 ca bệnh và 162 trường hợp tử vong, trong khi từ 2012 đến 2015 vẫn còn nhiều ca bệnh với tỉ lệ tử vong đáng kể. Hiện chưa có thuốc đặc trị hay vắc xin phòng ngừa hiệu quả cho bệnh này. Trong bối cảnh đó, kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà được xem là giải pháp tiềm năng nhờ khả năng miễn dịch đặc hiệu và an toàn khi sử dụng qua đường uống.

Luận văn tập trung nghiên cứu công nghệ vi bao kháng thể IgY kháng EV71 trong khuôn gel chitosan-alginate nhằm bảo vệ hoạt tính kháng thể trong môi trường tiêu hóa, đồng thời kiểm soát giải phóng IgY tại vị trí mục tiêu. Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ sodium alginate, CaCl₂, chitosan và pH môi trường vi bao đến hiệu quả vi bao, độ bền của chế phẩm trong môi trường mô phỏng dạ dày (SGF) và khả năng tự giải phóng IgY in vitro. Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại phòng thí nghiệm Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. Hồ Chí Minh trong năm 2017-2018.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng chứa IgY kháng EV71, góp phần phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tay chân miệng, đồng thời mở rộng ứng dụng công nghệ vi bao trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm và dược phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Kháng thể IgY: Là kháng thể chính trong lòng đỏ trứng gà, có cấu trúc tương tự IgG ở động vật có vú nhưng có đặc tính sinh học riêng biệt như không kích hoạt hệ thống bổ thể, không liên kết với thụ thể Fc, giúp giảm phản ứng miễn dịch không mong muốn khi sử dụng qua đường uống.

• Công nghệ vi bao tạo gel: Sử dụng các polymer đa điện ly tự nhiên như chitosan (polycaton) và sodium alginate (polyanion) để tạo mạng lưới gel ba chiều thông qua liên kết ion với Ca²⁺, tạo thành hạt vi bao bảo vệ các thành phần nhạy cảm như kháng thể IgY.

• Khái niệm chính:

  • Hiệu quả vi bao (Encapsulation Efficiency - EE%): Tỷ lệ kháng thể IgY được giữ lại trong hạt vi bao so với lượng ban đầu.
  • Tải lượng IgY (IgY Loading Percentage): Phần trăm kháng thể IgY có trong hạt vi bao so với khối lượng hạt.
  • Độ bền trong môi trường mô phỏng dạ dày (SGF): Khả năng duy trì hoạt tính kháng thể khi tiếp xúc với dịch dạ dày chứa pepsin.
  • Khả năng tự giải phóng in vitro: Mức độ IgY được phóng thích từ hạt vi bao trong môi trường mô phỏng dạ dày và ruột.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Kháng thể IgY kháng EV71 được cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Các hóa chất như chitosan, sodium alginate, CaCl₂ và các dung dịch đệm được chuẩn bị theo tiêu chuẩn phòng thí nghiệm.

• Phương pháp vi bao: Dung dịch IgY được phối trộn với sodium alginate theo tỷ lệ thể tích 1:3, nhỏ giọt vào môi trường vi bao gồm dung dịch chitosan hòa tan trong acid acetic và CaCl₂ theo tỷ lệ 1:1. Hạt vi bao được ổn định ở 4-6°C trong 1 giờ, sau đó lọc, rửa và sấy thăng hoa ở áp suất 3.6 Pa trong 16-17 giờ.

• Phân tích hiệu quả vi bao: Định lượng protein bằng phương pháp Bradford và ELISA để xác định nồng độ IgY và hoạt tính kháng thể còn lại trong hạt vi bao.

• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng: Thí nghiệm thay đổi nồng độ sodium alginate (1.5%, 2.5%, 3%), CaCl₂ (1%, 1.5%, 2%), chitosan (0.1% đến 0.3%) và pH môi trường vi bao (3 đến 6) để đánh giá ảnh hưởng đến hiệu quả vi bao.

• Đánh giá độ bền trong SGF: Hạt vi bao được ủ trong môi trường mô phỏng dạ dày chứa pepsin ở 37°C, lấy mẫu tại các thời điểm 0, 0.5, 2, 3, 4 giờ để đo hoạt tính IgY còn lại.

• Đánh giá khả năng tự giải phóng in vitro: Hạt vi bao được ủ trong SGF không có pepsin 2 giờ, sau đó chuyển sang môi trường mô phỏng ruột (SIF) không có pancreatin, lấy mẫu liên tục đến 16 giờ để đo lượng IgY phóng thích.

• Phân tích dữ liệu: Tất cả thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả trình bày dưới dạng trung bình ± SD, phân tích phương sai ANOVA với mức ý nghĩa 5% sử dụng phần mềm Statgraphic Centurion.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến hiệu quả vi bao:
   Hiệu quả vi bao tăng dần khi nồng độ sodium alginate tăng từ 1.5% đến 2.5%, đạt mức cao nhất 63% tại 2.5% (w/v). Tuy nhiên, khi tăng lên 3%, hiệu quả giảm khoảng 31% do độ nhớt cao gây khó khăn trong tạo hạt và kết dính hạt vi bao.

2. Ảnh hưởng của nồng độ CaCl₂ đến hiệu quả vi bao:
   Hiệu quả vi bao tăng khi nồng độ CaCl₂ tăng từ 1% đến 1.5%, đạt đỉnh tại 1.5%, sau đó giảm khi vượt quá nồng độ này. Điều này phản ánh vai trò quan trọng của ion Ca²⁺ trong việc tạo gel và ổn định cấu trúc hạt vi bao.

3. Ảnh hưởng của pH môi trường vi bao:
   Khả năng vi bao và hoạt tính IgY còn lại đạt cao nhất tại pH 3.5. Khi pH tăng lên, hiệu quả vi bao giảm do sự thay đổi độ ion hóa của alginate và chitosan, ảnh hưởng đến cấu trúc mạng lưới gel và khả năng bảo vệ IgY.

4. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan:
   Hiệu quả vi bao đạt tối ưu ở nồng độ chitosan 0.2% (w/v), với khả năng giữ IgY trong hạt đạt 51%. Tăng nồng độ chitosan giúp tạo màng vi bao dày hơn, tăng liên kết ion và giảm thất thoát protein.

5. Độ bền của chế phẩm vi bao trong môi trường mô phỏng dạ dày (SGF):
   Hoạt tính IgY không vi bao giảm nhanh, chỉ còn 10.71% sau 1 giờ tiếp xúc với SGF chứa pepsin. Trong khi đó, IgY được vi bao giữ được 76% hoạt tính sau 3 giờ, chứng tỏ màng chitosan-alginate có khả năng bảo vệ hiệu quả kháng thể khỏi sự phân hủy enzym.

6. Khả năng tự giải phóng in vitro của IgY:
   IgY bắt đầu giải phóng sau 2 giờ ủ trong SGF không pepsin, và gần như hoàn toàn được phóng thích sau 16 giờ trong môi trường mô phỏng ruột (SIF). Điều này cho thấy hạt vi bao có khả năng kiểm soát giải phóng IgY phù hợp với điều kiện tiêu hóa.

Thảo luận kết quả

Các kết quả cho thấy sự phối hợp giữa sodium alginate, CaCl₂ và chitosan trong điều kiện pH tối ưu tạo thành mạng lưới gel chitosan-alginate ổn định, bảo vệ hiệu quả IgY khỏi môi trường acid và enzym tiêu hóa. Việc tăng nồng độ sodium alginate và chitosan giúp tăng độ dày và tính bền vững của màng vi bao, nhưng vượt quá ngưỡng sẽ gây ảnh hưởng tiêu cực do tăng độ nhớt và kết dính hạt.

So với các nghiên cứu trước đây, kết quả này tương đồng với báo cáo của Xiao-Yu Li và Kawin Punyokun về ảnh hưởng của pH và nồng độ polymer đến hiệu quả vi bao IgY. Đặc biệt, khả năng duy trì hoạt tính IgY trong SGF đến 3 giờ là điểm nổi bật, mở ra triển vọng ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm chức năng.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ thể hiện mối quan hệ giữa các yếu tố (nồng độ polymer, pH) và hiệu quả vi bao, cũng như biểu đồ đường thể hiện hoạt tính IgY còn lại theo thời gian trong SGF, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả bảo vệ của công nghệ vi bao.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu quy trình vi bao IgY:
   Áp dụng nồng độ sodium alginate 2.5% (w/v), CaCl₂ 1.5% (w/v), chitosan 0.2% (w/v) và pH môi trường vi bao 3.5 để đạt hiệu quả vi bao tối ưu, bảo vệ hoạt tính IgY. Thời gian thực hiện quy trình nên duy trì ổn định trong 1 giờ ở 4-6°C.

2. Phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng chứa IgY vi bao:
   Khuyến nghị các doanh nghiệp công nghệ thực phẩm nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi bao IgY trong sản phẩm bổ sung nhằm phòng ngừa bệnh tay chân miệng, với thời gian bảo quản và sử dụng phù hợp để duy trì hoạt tính kháng thể.

3. Nghiên cứu mở rộng về giải phóng IgY in vivo:
   Thực hiện các thử nghiệm lâm sàng và mô hình động vật để đánh giá hiệu quả bảo vệ và giải phóng IgY trong hệ tiêu hóa thực tế, từ đó hoàn thiện công nghệ và quy trình sản xuất.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ:
   Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật vi bao chitosan-alginate cho các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp, đồng thời xây dựng hướng dẫn chuẩn để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Thực phẩm:
   Nghiên cứu về công nghệ vi bao, ứng dụng polymer tự nhiên trong bảo quản và vận chuyển các thành phần sinh học nhạy cảm.

2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm:
   Áp dụng công nghệ vi bao IgY để phát triển sản phẩm phòng ngừa bệnh tay chân miệng và các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa.

3. Chuyên gia y tế và phòng chống dịch bệnh:
   Tìm hiểu giải pháp bổ sung miễn dịch qua đường uống, hỗ trợ phòng ngừa bệnh tay chân miệng trong cộng đồng.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách:
   Đánh giá tiềm năng công nghệ mới trong lĩnh vực y tế công cộng và phát triển sản phẩm an toàn, hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi bao IgY là gì và tại sao cần thiết?
   Vi bao IgY là kỹ thuật bao gói kháng thể IgY trong các hạt gel chitosan-alginate để bảo vệ hoạt tính kháng thể khỏi môi trường acid và enzym tiêu hóa, giúp IgY đến được vị trí tác động trong ruột.

2. Các yếu tố nào ảnh hưởng đến hiệu quả vi bao IgY?
   Nồng độ sodium alginate, CaCl₂, chitosan và pH môi trường vi bao là các yếu tố chính ảnh hưởng đến cấu trúc hạt vi bao và khả năng giữ hoạt tính IgY.

3. Khả năng bảo vệ IgY trong môi trường dạ dày như thế nào?
   Chế phẩm vi bao giữ được 76% hoạt tính IgY sau 3 giờ trong môi trường mô phỏng dạ dày có pepsin, trong khi IgY không vi bao giảm xuống còn khoảng 10.7% sau 1 giờ.

4. IgY được giải phóng như thế nào trong hệ tiêu hóa?
   IgY bắt đầu giải phóng sau 2 giờ trong môi trường mô phỏng dạ dày không pepsin và gần như hoàn toàn được phóng thích sau 16 giờ trong môi trường mô phỏng ruột, đảm bảo tác dụng tại vị trí mục tiêu.

5. Ứng dụng thực tế của công nghệ vi bao IgY?
   Công nghệ này có thể được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, thuốc bổ sung miễn dịch qua đường uống, đặc biệt phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tay chân miệng do EV71.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình vi bao kháng thể IgY kháng EV71 trong gel chitosan-alginate với hiệu quả vi bao đạt 63% tại điều kiện tối ưu.
• Chế phẩm vi bao giữ được 76% hoạt tính IgY sau 3 giờ trong môi trường mô phỏng dạ dày chứa pepsin, cải thiện đáng kể độ bền của kháng thể.
• Khả năng tự giải phóng IgY in vitro phù hợp với điều kiện tiêu hóa, bắt đầu sau 2 giờ trong SGF và hoàn toàn sau 16 giờ trong SIF.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng chứa IgY vi bao nhằm phòng ngừa bệnh tay chân miệng.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu lâm sàng và chuyển giao công nghệ để ứng dụng rộng rãi trong thực tế.

Học viên và các nhà nghiên cứu được khuyến khích tiếp tục phát triển công nghệ vi bao IgY, đồng thời phối hợp với các đơn vị sản xuất để đưa sản phẩm ra thị trường, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TONG QUAN 1. Kháng thé IgY [5] Dựa theo chức năng hoạt dong, hệ thống miễn dịch ở gà được phân chia thành hệ thống miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch đặc hiệu. Trong đó hệ thông đáp ứng miễn dịch dịch thể (thuộc hệ thống miễn dịch đặc hiệu) của gà gồm 3 lớp kháng thể IgM, IgA và IgY. Hai lớp kháng thé IgM va IgA ở ga tương tự như ở động vật có vú về trọng lượng phân tử, đặc điểm hình thái học và tính linh động (Diana Pauly, 2011).

So với IgM va IgA của gà, kháng thé IgY gà có trọng lượng phan tử thấp hon, chiếm đến 75% tong số lượng kháng thé (E. IgY trong huyết thanh được truyền vào noãn hoản trưởng thành trong nang trứng thông qua màng noãn (oolemma). Vì vậy kháng thể này có tên gọi là “kháng thể lòng đỏ trứng”: Yolk Immunoglobulin — IgY). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra răng, lượng kháng thể IgY được chuyển vào lòng đỏ tỉ lệ thuận với lượng kháng thé trong huyết thanh của gà mẹ.

Ngoài ra, thời gian kháng thé IgY đặc hiệu được tìm thay trong trứng gà mới đẻ, trễ từ 5-6 ngày so với nồng độ kháng thé trong huyết thanh (E. Hiện nay, khuynh hướng sử dụng trứng gà làm nguồn sản xuất kháng thể ứng dụng trong chuẩn đoán và điều trị bệnh ở người và vật nuôi rất được quan tâm. So với phương pháp sản xuất kháng thể truyền thống, thì thu thập trứng và tách chiết kháng thể từ lòng đỏ được xem là một phương pháp sản xuất mang lại hiệu suất cao, giảm sự xâm lấn, cũng như đau đớn đối với động vật dùng làm thí nghiệm. Thông thường một con gà có thé đẻ 200 - 280 trứng mỗi năm va một lòng đỏ trứng chứa hơn 100mg kháng thể IgY (Carlander D, 2002).

Về cấu trúc, kháng thé IgY gần giống với kháng thé IgG ở người, bao gôm 2 chuỗi nặng (Hv) với trọng lượng phân tử từ 67-70 kDa và hai chuỗi nhẹ với trọng lượng phân tử 25kDa/chuỗi liên kết với nhau bang các cầu nối disulfide. Kháng thé IgY có trọng lượng phân tử xấp xỉ 180kDa, lớn hơn so với trọng lượng 150kDa của kháng thé IgG. Điểm khác biệt chủ yếu của IgY va IgG là số lượng vùng hang định (constant region) C trên chuỗi nặng, IgG có 3 vùng C (Cul, CH2 và CH3), IgY có 4 vùng C (CHI, CH2, C3 và Ca4). Trong cau trúc ở chuỗi nặng của kháng thé IgG, hai vùng Culva C2 được phân biệt bởi vùng bản lề, do đó làm tăng tính linh hoạt đoạn Fab trong cầu trúc phân tử của kháng thê.

Ngược lại, chuỗi nặng của IgY không chứa vùng bản lẻ, nhưng các vùng gan với ranh giới của CHI- CH2 và CH2-CH3 có chứa các nhóm proline và glycine. Các vùng này góp phân làm giảm tính linh hoạt của cấu trúc phân tử. Cấu trúc bên ngoài chuỗi nhẹ trong kháng thé IgY tương tự như ở IgG, bao gồm một vùng biến đổi (VL) và một vùng hang định (CL). Tuy nhiên, cầu nối disulfide giữa VL và vùng CL hiện diện trong kháng thé IgG lại không có trong cau trúc của kháng thé IgY.

Điều nay làm cho lực nội phân tử (intra-molecular force) của kháng thể IgY yếu hơn so với IgG (Hình 1. Sự khác nhau trong cau trúc phân tử dẫn đến sự khác nhau trong cách liên kết va tương tác hoá sinh học của kháng thé IgY so với kháng thé IgG. Kháng thể IgY không hoạt hoá các nhân tố bố thé, không bám với vùng thụ thé Fe ở động vật có vu, cũng như các nhân tố RF (rheumatoid factors), HAMA (human anti-murine antibodies). Các ưu điểm này giúp mở ra một phương hướng mới trong việc sử dụng IgY vào các lĩnh vực nghiên cứu, chan đoán va ứng dụng y học.

Cấu tr cc a kháng thé IgY va IgG Bang 1. So sánh t nh chất kháng thé IgG ở déngv tc v valgY ở gà Động vật có vú Gà (IgY) (IgG) Nguôn thu nhận Huyét tương Lòng đỏ trứng Loại kháng thể Đa dòng Đa dòng Phương pháp thu nhận Lây máu (mang | Thu thập trứng tính xâm lan) Lượng thu nhận 200 mg/40 ml 50-100 mg/1 mau trứng Kháng thê đích ~ 5% 2—10% Khôi lượng phân tử 150 kDa 180 kDa Tuong tac protein A/G Có Không Tương tác với yeu tô Có Không rheumatoid Kích hoạt bô thê Có Không Liên kết với thụ thê Fc Có Không Điểm đăng điện của kháng thể IgY dao động từ 5.5, hoạt tính IgY giảm và gân như hoàn toàn mất hoạt tính sinh học ở pH 3 (Shimizu et al. Trong môi trường kiém, hoat tinh IgY 6n dinh khi pH không vượt quá 11. Do đoạn Fe của IgY có cau trúc lớn hơn IgG, nên cau trúc của kháng thé IgY có tính ky nước hon so với IgG.

Các nghiên cứu thực hiện vé tính bền vững của kháng thé IgY với nhiệt độ cho thấy, ngưỡng nhiệt độ của kháng thé IgY tôn tại bền vững trong khoảng 60°C đến xấp xỉ 70°C. Khi nâng nhiệt độ lên cao hơn, hoạt tính của IgY bị phá huỷ hoàn toàn. Kháng thể IgY có khả năng kháng lại sự phân huỷ của trypsin và chymotrypsin, nhưng lại rất nhạy cảm với enzyme pepsin. Tính bền vững của IgY đối với pepsin phụ thuộc rất nhiều vào độ pH của môi trường va tỉ lệ giữa cơ chất và enzyme.

Với môi trường có độ pH từ 5 trở lên, IgY có thé kháng lại sự phân huỷ bởi enzyme pepsin. Tuy nhiên ở độ pH thấp hơn, IgY bị phân cắt gân như hoàn toàn [5]. Ky thuật vi bao 1. Các kỹ thuật vi bao Vi bao là một phương pháp bao gói các vi chất hay vật liệu (các thành phần thực phâm, enzyme, tê bao, hoặc các vật liệu khác) trong các viên bao nhỏ và chỉ giải phóng các thành phần bên trong khi gặp điều kiện thích hợp (dung môi, lực cắt, nhiệt độ, pH, enzyme), thường được gọi la “microcapsules”.

Microcapsules giúp bảo vệ các thành phan thực phẩm nhạy cảm, đảm bảo chồng lại sự mất mát về chất dinh dưỡng, giữ được hương vi và có thé chuyển chất lỏng thành các thành phan ran dé dàng xử lý [6]. Kích thước của các hạt vi bao trong khoảng từ vai pm đến vài mm và có vô số các hình dạng khác nhau. tùy thuộc vao vật liệu và phương pháp được sử dụng làm ra nó. Câu tử được được bao bên trong gọi là lõi nhân, vật liệu bao bên ngoài được gọi là vỏ bao.

Việc hình thành các dạng vi bao phụ thuộc chu yếu vào cầu tao của lõi nhân cần vi bao và quá trình hình thành lớp vỏ bao. Các hạt vi bao với 4 hình thái thường gap: — Đơn lõi (monocore): hạt vi bao bao gồm 1 nhân và lớp vỏ bao bên ngoài. — Dạng đệm (matrix): nguyên liệu cần vi bao là lõi nhân được phân tán đồng nhất trong vỏ bao. — Vi bao nhiều lớp (multi-layer capsule): màng vi bao là sự kết hợp của nhiều lớp mang có tinh chất khác nhau.

Mononuclear Polynuclear Matnx Hình 1. Các loại cấu tr cco banc. a hạt vi bao Vật liệu nhân thường có những tính chất sau: — Là chất rắn hoặc lỏng. — Chất lỏng có khả năng hòa tan hoặc phân tán.

— Chất có hoạt tính sinh học hoặc được tính. Chất mang thường có những đặc tính: — Không phản ứng với vật liệu nhân. — Hoạt động ôn định va tương thích với vật liệu nhân. — Đa dạng va giá thành rẻ.

Kỹ thuật vi bao phụ thuộc vào tính chất vật lý và hóa học của vật liệu sử dụng vi bao. Có nhiều phương pháp khác nhau sử dụng trong vi bao. Có 3 phương pháp vi bao thường được sử dụng như sau [7]: — Phương pháp vật lý: sấy phun, ép dun. — Phương pháp hóa lý: tạo giọt đơn hay phức hợp (phân tách pha nước), quá trình phân chia nhũ tương — dung môi (phân tách pha hữu cơ), tạo gel.

— Phương pháp hóa học: trùng hợp bề mặt, bao thé phân tử. Phương pháp vi bao tạo gel Phương pháp vi bao tạo gel được sử dụng rất phố biến trong ngành dược phẩm đặc biệt là trong sản xuất thuốc cung cấp qua đường miệng. Phương pháp này dựa trên khả năng liên kết chéo của các chất đa điện ly dưới sự hiện diện của các ion như Ca?*, Ba?" và Al** tạo thành dang hydrogel [7]. Các hạt hydrogel được tao ra bang cách nhỏ dung dich polymer có chứa chat nhân vào dung dich ion dương da hóa trị.

Các ion dương này sẽ khuếch tán vào polymer mang chất nhân, tạo thành mạng lưới ba chiều của liên kết ion chéo [8]. Polyelectrolyte solution [Sodium Alginate (-)/Gellan gum (-)/CMC (-)/Pectin (-)/ Chitosan (+) + Drug] { Added drop wise under magnetic stirring by needle | Counter ion solution [Calcium chloride solution (+)/Sodium tripolyphosphate (-)] | Gelispheres Hình 1. Quá trình vi bao tạo gel[8] Trong phương pháp vi bao tao gel, các nghiên cứu hiện nay ngày càng quan tam đến việc sử dụng polymer tự nhiên làm chất mang do khả năng tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học cao. Các polymer tự nhiên hoặc bán tong hợp như: Alginates, Gellan Gum, Chitosan, Pectin và Carboxymethyl cellulose được sử dụng rộng rãi trong phương pháp vi bao này.

Các chất đa điện ly tự nhiên chứa anion/ cation nhât định trên câu trúc hóa hoc của chúng, những anion/ cation tạo thành câu trúc mạng lưới băng cách kết hợp với ion trái dau cùng điện tích trong dung dịch và tạo gel bang các liên kết chéo [8]. Các chất da điện li sử dụng trong phương pháp vi bao tạo gel[8] Table 1: Polyelectrolytes used in lonotropic gelation Natural polymers Synthetic monomers/polymers Multivalent Cations Chitosan Hydroxyethylmethacryate (HEMA) Calcium (Ca‘?) Alginate N-(2-Hydroxy propyl}methacrylate (HPMA) Potassium (K') Fibrin N-Vinyl-2-pyrrolidone (NVP) Ferric (Fe), Barium (BA?) Sodium (Na*) Magnesium(Me*) Collagen N-Isopropylacrylamide (NIPAMM) Aluminium (Al*) Gelatin Vinyl acetate (VAc) Zinc (7n?) Hyaluronic acid Acryolic acid (AA) Dextran Methacrylic acid (MAA) Polyethylene glycol acrylate/methacrylate (PEGA/PEGMA) Polyethylene glycol diacrylate/dimethacrylate (PEGDA/PEGDMA) 10 1. Chitosan Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tach nhóm acetyl (quá trình deacetyl hoá chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino. Nói cách khác, chitosan là một polymer của D-glucosamin, được phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859 [9].

Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở carbon thứ 2. Chitosan là sản phẩm của quá trình deacetyl hóa chitin băng kiểm đặc (mức độ deacetyl hoá của chitin đạt trên 50%); là một polymer chứa các don vi là Glucosamine và N-acetyl-glucosamine liên kết với nhau băng liên kết B-14- glycoside. Trong tự nhiên, chitosan xuất hiện ở thành tế bào của một số loài nắm, tuy nhiên, trong thương mai chitosan được sản xuất bang cách deacetyl hoá chitin [9]. Công thức phan tử: (C6H1104N)n Khối lượng phân tử: Mehitosan= (161.