Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử cây ngô bằng Agrobacterium

Luận văn thạc sĩ trình bày quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào cây ngô bằng vi khuẩn Agrobacterium, kết quả và phân tích chuyên sâu.

• Tác giả: Phạm Thị Hương
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Lý Thu
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây ngô và ứng dụng chuyển gen

Cây ngô là một trong những cây trồng quan trọng nhất trên thế giới, đóng vai trò thiết yếu trong nông nghiệp và an ninh lương thực. Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào cây ngô đã mở ra những triển vọng mới trong sản xuất nông nghiệp hiện đại. Luận văn thạc sĩ về tạo ngô chuyển gen tập trung vào việc tạo ra những giống ngô có khả năng chống chịu tốt hơn với các loại thuốc diệt cỏ phổ biến. Điều này không chỉ giúp nâng cao năng suất mà còn giảm chi phí quản lý cỏ dại trong sản xuất nông nghiệp. Nghiên cứu này được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của các chuyên gia về công nghệ di truyền và kỹ thuật biến nạp gen.

1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô

Cây ngô có nguồn gốc từ Mexico và được xem là một trong những cây trồng cổ nhất được con người thuần hóa. Cây ngô được phân loại thành nhiều loại khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái và thành phần hóa học. Hiện nay, ngô biến đổi gen đã trở thành xu hướng chính trong phát triển nông nghiệp toàn cầu, giúp tăng cường khả năng chống lại các bệnh tật, sâu bệnh và các yếu tố môi trường bất lợi.

1.2. Vai trò của cây ngô trong nông nghiệp hiện đại

Cây ngô không chỉ là cây lương thực mà còn là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến. Ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ giúp nông dân kiểm soát cỏ dại hiệu quả hơn. Công nghệ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp tiên tiến nhất hiện nay, cho phép đưa những gen mong muốn vào thực vật với độ chính xác cao.

II. Phương pháp chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ

Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ là một quá trình phức tạp đòi hỏi sự kết hợp của nhiều kỹ thuật sinh học tiên tiến. Luận văn này tập trung vào việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa gen EPSPS vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô. Gen EPSPS mã hóa enzym 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, giúp cây chuyển gen kháng lại glyphosate – một loại thuốc diệt cỏ phổ biến. Quá trình này bao gồm việc chọn lọc nồng độ glyphosate thích hợp, nuôi cấy các cây chuyển gen, và xác minh sự có mặt của gen qua các kỹ thuật phân tích sinh học phân tử.

2.1. Công nghệ vi khuẩn Agrobacterium trong biến nạp gen

Vi khuẩn Agrobacterium là một công cụ tự nhiên để chuyển gen vào cây. Phương pháp này sử dụng plasmid Ti chứa gen EPSPS để tạo ngô chuyển gen. Quá trình lây nhiễm được thực hiện trên các mô đích là phôi hợp tử chưa trưởng thành, cho phép gen tích hợp vào bộ gen của cây. Kỹ thuật này đã được chứng minh là hiệu quả và an toàn cho tạo cây trồng biến đổi gen trong các điều kiện nhà lưới cách ly côn trùng.

2.2. Gen EPSPS và khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate

Gen EPSPS từ vi khuẩn Agrobacterium sp. CP4 có khả năng mã hóa một dạng enzym kháng glyphosate. Thuốc trừ cỏ glyphosate là một thuốc diệt cỏ phổ dụng nhất thế giới, nhưng ngô chuyển gen mang gen này sẽ có khả năng chống lại tác động của nó. Việc sử dụng gen kháng thuốc trừ cỏ giúp nông dân quản lý cỏ dại hiệu quả mà không làm hại đến cây chính.

III. Quá trình nghiên cứu và phân tích kết quả

Quá trình tạo ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ được tiến hành theo các bước nghiêm ngặt với mục đích đạt được những cây biến đổi gen ổn định. Các dòng ngô được sử dụng bao gồm CM8, CH9 và VH1, được trồng trong điều kiện nhà lưới cách ly côn trùng tại Viện Di truyền Nông nghiệp. Sau khi chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium, các cây được chọn lọc bằng cách xử lí với các nồng độ glyphosate khác nhau để xác định những cây kháng thuốc trừ cỏ thực sự. Kết quả được phân tích qua các phương pháp như PCR, Southern blot, và xác định protein EPSPS.

3.1. Kỹ thuật PCR và Southern blot trong xác minh gen

Phương pháp PCR được sử dụng để phát hiện sự có mặt của gen EPSPS trong các cây chuyển gen thế hệ T0. Southern blot giúp xác định số lượng bản sao gen và vị trí tích hợp của gen vào bộ gen cây. Những kỹ thuật này đảm bảo rằng ngô chuyển gen mang gen mong muốn và có thể chuyển truyền nó cho thế hệ tiếp theo một cách ổn định.

3.2. Đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ trong điều kiện nhà lưới

Các cây ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ được kiểm tra khả năng chống chịu glyphosate bằng cách xử lí với các nồng độ thuốc khác nhau. Cây chuyển gen có khả năng tiếp tục tăng trưởng bình thường khi tiếp xúc với thuốc diệt cỏ, trong khi cây không chuyển gen sẽ bị tẩy trắng và chết. Điều này chứng minh hiệu quả của chuyển gen trong tạo ra những giống kháng thuốc trừ cỏ có giá trị thương mại.

IV. Ý nghĩa và triển vọng của nghiên cứu chuyển gen ngô

Luận văn về tạo ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ có ý nghĩa học thuật và thực tiễn vô cùng quan trọng. Thành công trong việc tạo cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ mở ra những cơ hội mới cho nông nghiệp Việt Nam. Công nghệ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium đã được chứng minh là hiệu quả, an toàn và có thể áp dụng rộng rãi. Những giống ngô chuyển gen này không chỉ giúp tăng năng suất mà còn giảm chi phí sản xuất, giảm áp lực sử dụng hóa chất cho môi trường. Tuy nhiên, việc ứng dụng thương mại vẫn cần tuân theo các quy định pháp luật và tiêu chuẩn an toàn sinh học quốc tế.

4.1. Tác động đến nông nghiệp bền vững

Ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ góp phần vào mục tiêu nông nghiệp bền vững bằng cách giảm nhu cầu sử dụng thuốc diệt cỏ có hại. Các giống cây trồng biến đổi gen này giúp nông dân quản lý cỏ dại hiệu quả hơn với chi phí thấp hơn. Công nghệ di truyền này cũng có tiềm năng được áp dụng cho các cây trồng khác như lúa, đậu tương, tạo ra những cây trồng kháng thuốc trừ cỏ đa dạng.

4.2. Các hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào đánh giá an toàn sinh học của ngô chuyển gen trong môi trường tự nhiên dài hạn. Cần thực hiện các thí nghiệm khảo sát về tính di truyền của gen EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen qua nhiều thế hệ. Ngoài ra, việc phát triển các phương pháp chuyển gen hiệu quả hơn và tạo ra những giống kháng thuốc trừ cỏ với các tính trạng nông học khác cũng là những hướng đi tiềm năng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngô là một trong ba cây lƣơng thực quan trọng nhất trên thế giới (cùng với lúa mì và gạo) và là cây lƣơng thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất. Tính đến năm 2013 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 177 triệu ha [65]. Theo dự đoán vào năm 2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 852 triệu tấn một năm và có thể vƣợt qua cả gạo và lúa mì [35] Hiện nay ngành sản xuất ngô thế giới nói chung và nƣớc ta nói riêng đang phải đối mặt với rất nhiều vấn đề nhƣ: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày càng nặng nề hơn, đặc biệt cỏ dại cũng là một vấn đề lớn trong nông nghiệp đã làm giảm năng suất cây trồng từ 10 – 15%. Do đó, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã đƣợc áp dụng nhƣ: sử dụng các loại thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không chọn lọc.

Đặc biệt ở những vùng có hiện tƣợng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ đƣợc sử dụng nhƣ một giải pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại. Tuy nhiên, việc lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc tính cao đã và đang gây ra các hậu quả nghiêm trọng đối với môi trƣờng, hệ sinh thái và sức khỏe con ngƣời. Điều này đặt ra nhiệm vụ to lớn cho các nhà chọn giống, các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học chọn tạo ra các giống ngô mới có năng suất cao, chống chịu thuốc diệt cỏ. Các giống cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính khác nhau đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng, tăng thu nhập cho ngƣời lao động.

Hàng năm, số lƣợng nông dân và các quốc gia trồng cây trồng biến đổi gen liên tục gia tăng. Cây ngô chuyển gen đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa vào năm 1996, đến năm 2013 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 57,4 triệu ha tại 17 nƣớc, trong đó có 5 nƣớc trồng hơn 1 triệu ha bao gồm: Hoa Kỳ (35,6 triệu ha), Brazil (12,9 triệu ha), Argentina (3,2 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) và Canada (1,7 triệu ha). Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ luôn là giống cây trồng ƣu thế, chiếm 7,8 triệu ha tƣơng đƣơng với 5% diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu và đƣợc trồng tại 9 nƣớc [37] Ở Việt Nam, trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chuyển gen vào các loài cây trồng đã đƣợc quan tâm, chú ý nhiều hơn, tuy nhiên với đối tƣợng cây ngô, có 2 thể nói đây là loài cây trồng tƣơng đối khó tính trong quá trình nuôi cấy invitro cũng nhƣ chuyển nạp gen, hiệu quả biến nạp gen còn rất thấp. Mặt khác, việc tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng áp dụng vào sản xuất từ những nghiên cứu trong nƣớc đang là đòi hỏi cấp thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học và ngành nông nghiệp của Việt Nam.

Các giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ đã mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trƣờng và chi phí lao động của nông dân Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn và dựa trên các cơ sở lý luận khoa học nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả năng tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ của một số dòng ngô Việt Nam Nôi dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen EPSPS vào các dòng ngô Việt Nam 2. Phân tích sinh học phân tử PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0 và thế hệ T1 3. Phân tích Southern blot sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ 4.

Đánh giá sự có mặt của protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng cỏ 5. Đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dòng ngô chuyển gen EPSPS trong điều kiện nhà lƣới 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của cây ngô 1.

Nguồn gốc và phân loại cây ngô Phân loại khoa học Ngô (Zea mays. L) thuộc: Chi : Maydeae Họ: Poaceae (hòa thảo) Bộ: Poales (Hòa thảo) Lớp: Monocotyledons (Một lá mầm) Ngành: Angiospermatophyta (Hạt kín) Loài: Zea mays. Cây ngô (Nguồn: www.vn) Ngô, trong tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) là thuật ngữ trong tiếng Taino để chỉ loài cây này, là từ thông dụng Vƣơng quốc Anh để chỉ cây ngô. Tại Hoa Kỳ, Canada và Australia, thuật ngữ hay đƣợc sử dụng là corn, là từ trƣớc đây dùng để gọi cho một loại cây lƣơng thực, hiện nay thuật ngữ này dùng để chỉ cây ngô, là dạng rút gọn của "Indian corn" là “cây lƣơng thực của ngƣời Anh điêng”.

Lịch sử nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học, dân tộc học và địa lý học…quan tâm và đƣa ra nhiều giả thuyết. Có giả thuyết cho là nguồn gốc cây ngô khoảng năm 5.000 trƣớc công nguyên (TCN). Những nghiên cứu về di truyền học gần đây cho rằng quá trình thuần hóa ngô diễn ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico và tổ tiên của nó là loại cỏ teosinte hoang dại gần giống nhất với ngô ngày nay vẫn còn mọc trong lƣu vực sông Balsas. Liên quan đến khảo cổ học, ngƣời ta cũng đã phát hiện các bắp ngô có sớm nhất tại hang Guila Naquitz trong thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng năm 4.250 TCN, các bắp ngô cổ nhất trong các hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào khoảng 2750 TCN.

Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm nhất khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh, ngô là lƣơng thực chính của phần lớn các nền văn hóa tiền Columbus tại Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ và khu 4 vực Caribe. Với ngƣời dân bản xứ tại đây, ngô đƣợc suy tôn nhƣ bậc thần thánh và có tầm quan trọng về mặt tôn giáo do ảnh hƣởng lớn của nó đối với đời sống của họ Hiện trên thế giới đang tồn tại hai hệ thống phân loại đối với Zea: Wilkes (1967) [63] và Doebly (1980) [23]. Theo hệ thống phân loại của Wilkes ngô là Zea mays, còn theo hệ thống phân loại mới là Zea mays mays. Từ loài Zea mays L.

dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt đƣợc phân thành các loại phụ. Những loài phụ chính bao gồm: Zea mays subsp. Indurata Sturt – Ngô đá Zea mays subsp. Indentata Sturt – Ngô răng ngựa Zea mays subsp.

Ceratina Kulesh – Ngô nếp Zea mays subsp. Saccharata Sturt – Ngô đƣờng Zea mays subsp. Everta Sturt – Ngô nổ Zea mays subsp. Amylacea Sturt – Ngô bột Zea mays subsp.

Tunecata Sturt – Ngô bọc 1. Vai trò của cây ngô Cây ngô là cây lƣơng thực quan trọng đứng thứ ba trên thế giới (sau lúa mỳ và lúa gạo) và đứng thứ hai ở Việt Nam (sau lúa). Ngô đƣợc trồng rộng rãi trên toàn thế giới, với tổng sản lƣợng hàng năm lớn hơn bất kỳ loại ngũ cốc nào khác. Hoa Kỳ sản xuất khoảng 40% tổng sản lƣợng ngô trên thế giới, sau Hoa Kỳ là các nƣớc Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp và Argentina.

Chỉ tính riêng trong năm 2013, tổng diện tích trồng ngô toàn cầu là hơn 177 triệu ha, đạt sản lƣợng 963 triệu tấn, nhiều hơn gạo (745 triệu tấn) hoặc lúa mì (708,5 triệu tấn) [65]. Ngô là loại cây lƣơng thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới. Bên cạnh giá trị lƣơng thực, cây ngô còn là cây thức ăn gia súc quan trọng, 70% chất tinh trong thức ăn hỗn hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua rất tốt cho chăn nuôi gia súc lớn, đặc biệt là bò sữa.

Những năm gần đây, cây ngô còn là loại cây thực phẩm đƣợc ƣa chuộng. Ngƣời ta dùng bắp ngô bao tử để làm rau cao cấp. Đây là loại rau có hàm lƣợng chất dinh dƣỡng cao và không có dƣ lƣợng các chất bảo vệ thực vật. Các loại ngô nếp, ngô đƣờng đƣợc dùng để luộc, nƣớng hoặc đóng hộp làm đồ hộp.

Ngô có một số vai trò chính: 5 - Là nguồn có giá trị dinh dƣỡng: Ngô có chứa các chất nhƣ protein (10,6%), lipid (4-5%), glucid (69%), ngoài ra hàm lƣợng vitamin trong ngô cũng khá cao, tập chung chủ yếu ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm - Làm lƣơng thực, thực phẩm cho con ngƣời Cây ngô là một trong ba cây trồng quan trọng nhất đƣợc sử dụng làm thức ăn cho ngƣời và gia súc. Toàn thế giới sử dụng 17% sản lƣợng ngô làm lƣơng thực cho ngƣời trong đó ở các nƣớc đang phát triển là 30%, các nƣớc phát triển khoảng 40%. Các nƣớc ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lƣơng thực chính. Khẩu phần ăn ở các nƣớc châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt giống nhƣ các nƣớc châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh và các nƣớc châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa.

Tại Mỹ, hơn 90% sản lƣợng ngô đƣợc sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và 10% làm thức ăn cho ngƣời thông qua các sản phẩm chế biến công nghiệp. Ở châu Phi và một số nƣớc châu á, hơn 90% sản lƣợng ngô đƣợc sử dụng làm lƣơng thực cho con ngƣời, cung cấp 80-90% năng lƣợng [16] - Ngô làm thức ăn chăn nuôi Theo số liệu thống kê của CIMMYT, giai đoạn 1997 – 1999, thế giới dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là 66% - khoảng 400 triệu tấn/năm. Các nƣớc phát triển có tỷ lệ dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi cao, thƣờng trên 70% Hiện nay, Việt Nam cũng dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là chính (khoảng 90%) song tỷ lệ ngô trong tổng số chất tinh chỉ khoảng 50%, vì ta còn dùng thêm gạo gẫy, cám, bột sắn. Từ ngô hạt có thể xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng…), nghiền thành bột và chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn và gia cầm, chế biến thức ăn cho cá.

Thân lá ngô có thể cho trâu bò ăn tƣơi, sau khi thu hoạch (nhất là ngô thu bắp non) băm nhỏ ủ chua làm thức ăn cho gia súc. Chế biến thức ăn chăn nuôi từ ngô: Ngô nghiền thành bột và có thể trộn theo thành phần và tỷ lệ khác nhau với bột sắn (khoai mỳ), cám gạo, khô dầu lạc, khô dầu đậu tƣơng, bột cá, vỏ tôm, vỏ sò …để chế biến làm các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm và thủy sản 6 Giá trị dinh dƣỡng của thân, lá ngô khá lớn, phụ thuộc vào giống ngô và thời vụ thu hoạch.