Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 chịu hạn

Luận văn thạc sĩ trình bày chi tiết quy trình nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7, một gen quan trọng giúp tăng cường tính chịu hạn ở cây trồng.

• Tác giả: Nguyễn Thùy Linh
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Thị Thu Huệ
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ngô chuyển gen DREB2

Nghiên cứu tạo ngô chuyển gen DREB2 là một đề tài quan trọng trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ biến đổi gen. Đây là luận văn thạc sĩ khoa học được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập và thiết kế gen DREB2.7 từ cây ngô Tẻ vàng 1, sau đó chuyển gen này vào cây ngô để tạo ra giống ngô có tính chịu hạn cao hơn. Với bối cảnh biến đổi khí hậu và hạn hán ngày càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam, việc phát triển giống cây chuyển gen chịu hạn là cấp thiết. Nghiên cứu này đóng góp quan trọng vào công tác cải tiến giống lúa ngô và nâng cao năng suất nông sản trong điều kiện khí hậu khắc nghiệt.

1.1. Tình hình cây ngô ở Việt Nam

Cây ngô là một trong những cây trồng chủ lực của Việt Nam với tình hình sản xuất liên tục tăng. Tổng sản lượng ngô tiêu thụ qua các năm tài chính 2015-2018 cho thấy nhu cầu tiêu dùng cao. Tuy nhiên, hạn hán và điều kiện thời tiết khắc nghiệt là những thách thức lớn ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất. Việc phát triển giống ngô chịu hạn là yêu cầu cấp bách để đảm bảo an ninh lương thực quốc gia và phát triển nông nghiệp bền vững.

1.2. Vai trò của gen DREB2 trong chịu hạn

Gen DREB2 (Dehydration Responsive Element Binding factor 2) là nhân tố phiên mã quan trọng liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật. Gen này mã hóa các protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp stress nước. Khi cây thiếu nước, DREB2 hoạt động để điều khiển biểu hiện của các gen bảo vệ tế bào, giúp cây chống lại tác hại của hạn hán. Nghiên cứu chuyển gen DREB2.7 vào cây ngô nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của giống mới.

II. Phương pháp nghiên cứu tạo ngô chuyển gen DREB2

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử và kỹ thuật công nghệ gen tiên tiến để tạo cây ngô biến đổi gen. Quá trình nghiên cứu bao gồm nhiều bước: tách chiết DNA từ cây ngô Tẻ vàng 1, phân lập và nhân dòng gen ZmDREB2.7, thiết kế vector biểu hiện, và chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sử dụng Real-time PCR để định lượng số bản sao gen và đánh giá mức độ biểu hiện. Các cây chuyển gen được kiểm tra ở nhiều thế hệ (T0, T1, T2) để xác định tính ổn định của gen chuyển. Phương pháp điện di và phân tích DNA được áp dụng để xác nhận sự hiện diện của gen target.

2.1. Tách chiết và phân lập gen ZmDREB2.7

Bước đầu tiên là tách chiết DNA tổng số từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 bằng các phương pháp sinh hóa tiêu chuẩn. Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR với các mồi thiết kế đặc hiệu để khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7. Sản phẩm PCR được tinh sạch và nhân dòng vào vector pJET1.2 sử dụng tế bào khả biến E. coli. Phân lập plasmid và kiểm tra bằng điện di gel để xác nhận sự hiện diện của gen đích.

2.2. Thiết kế vector và chuyển gen vào cây ngô

Vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2 được thiết kế để biểu hiện gen trong điều kiện hạn hán. Promoter rd29A là promoter cảm ứng hạn, đảm bảo gen chỉ hoạt động khi cây gặp stress. Vector được chuyển vào A. tumefaciens EHA105, sau đó tái tổ hợp hóa vào cây ngô con trỏi bằng phương pháp Agrobacterium-mediated transformation. Cây chuyển gen được lựa chọn và nhân lên trong phòng thí nghiệm.

III. Kết quả chính của luận văn

Luận văn đạt được những kết quả đáng kể trong việc tạo cây ngô chuyển gen DREB2. Nghiên cứu đã thành công phân lập gen ZmDREB2.7tv từ giống ngô Tẻ vàng 1 và thiết kế được vector biểu hiện mang gen này. Cây ngô chuyển gen thế hệ T0 và T1 đã được tạo ra bằng công nghệ Agrobacterium tumefaciens. Phân tích Real-time PCR cho thấy số bản sao gen DREB2.7tv ổn định trong cây chuyển gen thế hệ T1. Mức độ biểu hiện tương đối của gen được đánh giá qua thế hệ T2, xác nhận tính ổn định di truyền của gen chuyển. Các cây chuyển gen này có tiềm năng tạo ra giống ngô với tính chịu hạn được cải thiện, mở ra hướng phát triển mới cho nông nghiệp bền vững.

3.1. Phân lập thành công gen ZmDREB2.7tv

Gen DREB2.7tv đã được phân lập thành công từ cây ngô Tẻ vàng 1 thông qua kỹ thuật PCR khuếch đại. Trình tự gene được xác nhận và so sánh với trình tự tham chiếu từ giống ngô B73 bằng công cụ BioEdit. Sự giống nhau giữa trình tự phân lập và tham chiếu chứng minh tính chính xác của quá trình phân lập gen. Plasmid pJET1.7tv mang gen này được tách và tinh sạch để chuẩn bị cho bước thiết kế vector tiếp theo.

3.2. Tạo cây chuyển gen ổn định

Cây ngô chuyển gen thế hệ T0 được tạo ra bằng cách chuyển vector pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2 vào cây ngô con trỏi. Sau khi nuôi cấy và chọn lọc, cây T1 được sinh sản và phân tích di truyền. Real-time PCR cho thấy số bản sao gen ổn định qua các thế hệ, chứng minh tính ổn định di truyền của gen chuyển. Cây chuyển gen thế hệ T2 tiếp tục được đánh giá và theo dõi, tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về khả năng chịu hạn.

IV. Ý nghĩa và ứng dụng trong nông nghiệp Việt Nam

Nghiên cứu tạo ngô chuyển gen DREB2 có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng đối với Việt Nam. Việc phát triển giống ngô chuyển gen chịu hạn góp phần giải quyết vấn đề suy giảm năng suất do biến đổi khí hậu. Giống ngô mới có thể tăng năng suất khi trồng trong điều kiện hạn hán, đảm bảo an ninh lương thực cho đất nước. Luận văn này là sản phẩm khoa học từ Đề tài cấp nhà nước về phân lập thiết kế gen chịu hạn, do Viện Nghiên cứu hệ gen chủ trì. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong chương trình phát triển giống và được sử dụng để tạo các giống ngô thế hệ tiếp theo. Ngoài ra, phương pháp thiết kế vector và kỹ thuật chuyển gen được áp dụng trong luận văn này có thể mở rộng cho các cây trồng khác như lúa, cỏ dâu tây, v.v.

4.1. Tác động đến sản xuất nông nghiệp

Giống ngô chuyển gen DREB2 có khả năng chịu hạn cao hơn sẽ giúp nông dân tăng năng suất trong những năm khô hạn. Đây là giải pháp lâu dài cho vấn đề mất mùa do thiếu nước. Việc phủ rộng giống ngô mới sẽ giảm rủi ro sản xuất và tăng thu nhập cho nông dân. Ngoài ra, giống này cũng tiết kiệm nước tưới, giảm chi phí sản xuất, và thân thiện với môi trường. Đây là công nghệ nông nghiệp tiên tiến phù hợp với nông nghiệp thông minh.

4.2. Hướng phát triển tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần đánh giá kinh tế-kỹ thuật của giống ngô chuyển gen DREB2 trong thử nghiệm đồng ruộng. Cần khảo sát hiệu suất chịu hạn thực tế của cây chuyển gen khi áp dụng tại các vùng nông thôn. Đánh giá tác động sinh thái và an toàn thực phẩm là các bước quan trọng trước khi phát triển thương mại. Kết hợp kỹ thuật chuyển gen DREB2 với các phương pháp cải thiện giống khác sẽ tạo ra giống ngô vượt trội hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Cây ngô là một trong các loài cây trồng quan trọng đối với con người. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Mặc dù sản lượng tăng lên đáng kể trong vài năm trở lại đây, năng suất trồng ngô vẫn chưa đạt được giá trị tiềm năng của nó do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó, nguyên nhân chính ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất ngô là khô hạn, nhất là khi hiện tượng biến đổi khí hậu khiến các đợt hạn hán xảy ra thường xuyên hơn và nghiêm trọng hơn.

Do đó, bên cạnh các biện pháp thủy lợi, việc nghiên cứu tạo giống ngô có khả năng thích ứng cao với điều kiện hạn hán là một trong những mục tiêu chính trong các chương trình lai tạo giống. Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật và sự chấp thuận cây trồng biến đổi gen ở nước ta đã mở ra một cơ hội, đồng thời là thách thức lớn trong việc tạo ra giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn. Nguyên nhân gồm cả khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều, công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó để chuyển gen. Giống ngô Tẻ vàng 1 sống ở vùng núi đá thuộc tỉnh Điện Biên, nơi có nhiệt độ và lượng mưa hằng năm thấp.

Giống ngô này đang được sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho các chương trình cải tạo giống bởi khả năng chịu hạn và chịu lạnh tốt. Đặc điểm có lợi này có thể liên quan đến các gen tham gia vào con đường chống chịu với bất lợi của cây. Thực vật đáp ứng với các yếu tố bất lợi thông qua các thay đổi về hình thái và sinh lý, mà cơ sở là thay đổi sự biểu hiện của các gen tham gia quá trình đáp ứng và bảo vệ. Sự biểu hiện của gen có liên quan chặt chẽ với hoạt động của các nhân tố khởi đầu phiên mã.

DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ nhân tố phiên mã lớn, tham gia vào con đường đáp ứng với bất lợi của cây. Các gen mã hóa cho các protein trong họ này lần lượt được phân lập và nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Ở ngô, họ gen DREB gồm nhiều thành viên và trong đó ZmDREB2.7 đã được nhận định là một gen tiềm năng và tham gia đáng kể vào phản ứng chịu hạn ở cây. 1 Do đó, với mục đích cung cấp nguyên liệu cho việc tạo giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn, luận văn thạc sĩ được tiến hành với nội dung: ―Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn‖.

Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập gen DREB2.7 từ dòng ngô Tẻ vàng 1 chịu hạn. Từ đó, phân tích đặc điểm trình tự của gen và protein được dự đoán. Tiếp theo, gen ZmDREB2.7tv dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng mạnh với hạn - rd29A được chuyển vào dòng ngô thuần để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây ngô chuyển gen. 2 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.

Cây ngô và hạn hán 1. Tình hình về cây ngô ở nước ta Ngô là cây lương thực quan trọng ở nước ta, đứng vị trí thứ hai sau lúa. Ngô là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và là bữa ăn chính của người dân tại nhiều khu vực đồi núi Việt Nam. Ngô cũng được sử dụng để sản xuất một vài sản phẩm công nghiệp như cồn, siro ngô, bột ngô.

Đồng thời, thân và hạt ngô được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Trong đó, 80% tổng sản lượng ngô tiêu thụ hằng năm phục vụ cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, diện tích trồng ngô ở nước ta vào năm 2017 là 1,1 triệu héc ta [1]. Con số này được dự báo sẽ tăng trưởng nhẹ vào các năm tới, sau đó giữ ổn định trong khoảng 0,95 – 1,1 triệu héc ta sau năm 2025 [1].

Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc, Việt Nam đứng thứ 24 về sản lượng ngô và thứ 28 về diện tích trồng ngô nhưng chỉ đứng thứ 56 về năng suất ngô vào năm 2016 [31]. Năng suất ngô trung bình năm 2016/2017 chỉ đạt 4,60 tấn/ha và với chi phí sản xuất lớn, sản lượng ngô quốc nội không thể cạnh tranh với ngô từ các nước khác. Ngô sản xuất trong nước chỉ đủ để đáp ứng từ 40 - 50% nhu cầu của thị trường. Do đó, hàng năm, Việt Nam phải nhập khẩu hàng triệu tấn hạt để phục vụ công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi (Hình 1.

Vài năm trở lại đây, lượng ngô nhập nhẩu tăng đáng kể khiến nhà nước phải có các chính sách khuyến khích người dân chuyển đổi các vùng trồng lúa sang trồng ngô. Tuy nhiên, lợi nhuận từ việc trồng ngô thấp, chi phí trồng ngô cao khiến người nông dân từ bỏ nhiều diện tích trồng ngô. Theo dự đoán, để đáp ứng được nhu cầu về ngô, năng suất ngô nước ta phải đạt ít nhất 5 tấn/ha, giảm giá thành sản xuất và tăng thu nhập trong người nông dân [19]. Do đó, vấn đề nâng cao sản xuất ngô nội địa không chỉ đóng vai trò trong nông nghiệp mà còn quan trọng đối với kinh tế nước nhà.

Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta. Đơn vị: triệu tấn [33] 1. Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô Năng suất trồng ngô nước ta tăng đáng kể trong những năm gần đây. Tuy nhiên, con số 4,60 tấn/ha vẫn tương đối thấp và chưa đạt được đúng tiềm năng có thể có ở cây ngô (so với Mỹ 11,08 tấn/ha) [31].

Năng suất của cây ngô có thể cao hơn nhiều, nhưng trên thực tế, nhiều nhân tố chủ quan và khách quan có tác động tiêu cực đến sản lượng ngô. Trong đó, hạn hán là một trong những nguyên nhân chính gây mất mùa ở ngô. Nhất là khi, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu, các đợt nắng nóng và hạn hán kéo dài xảy ra với tần suất ngày càng cao. Năm 2018 chứng kiến nhiều đợt hạn hán nghiêm trọng kéo dài ở khu vực châu Âu; Mỹ phải chịu đựng nhiều làn sóng nhiệt trong suốt mùa hè; châu Úc cũng báo cáo năm 2018 là năm nắng nóng kỉ lục.

Ở nước ta, thời điểm cuối tháng 6, đầu tháng 7 năm nay, nắng nóng gay gắt xảy ra trên diện rộng các tỉnh Bắc Bộ và Trung Bộ đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động canh tác của nông dân. Trong khi đó, vụ đông xuân năm 2018-2019 cũng dược dự báo sẽ xảy ra nắng hạn đối với các tỉnh nam Trung bộ và Tây Nguyên. Do đó, hạn hán là vấn đề cấp bách không chỉ đối với cây ngô mà cả sản xuất nông nghiệp nói chung. Hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống của cây ngô, đặc biệt nghiêm trọng nếu hạn xảy ra vào giai đoạn phát triển, trước và sau khi ra hoa [12].

4 Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các triệu chứng như toàn bộ thân và lá sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại từ dưới lên trên ngọn, khí khổng lá đóng lại, quang hợp giảm mạnh, giảm cố định carbon và do đó sinh trưởng bị chậm lại. Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7-10 ngày, sự phát triển của bắp sẽ chậm hơn cờ, do đó quá trình phun râu chậm hơn sự tung phấn, điều này dẫn đến khả năng thụ phấn thấp. Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể dẫn đến việc mất hoàn toàn bắp và do đó mất năng suất [8]. Nếu hạn hán xảy ra trong thời gian tạo hạt, bắp ngô sẽ có ít hàng hạt và các hàng không có nhiều hạt [13].

Như vậy, hạn hán dù ngắn hay dài, nhẹ hay nghiêm trọng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất của cây ngô. Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán Hai hướng tiếp cận chính để giảm thiểu thiệt hại do thiên tai nói chung và hạn hán nói riêng đối với cây trồng là (1) giảm khả năng cây gặp điều kiện bất lợi và (2) làm tăng khả năng cây chống chịu với các bất lợi đó. Để giảm khả năng cây gặp hạn, thông thường cần cải tạo hệ thống thủy lợi tưới tiêu, xây dựng các hồ dự trữ nước để đối phó với điều kiện hạn. Đôi khi, việc thay đổi phương thức canh tác, thời gian canh tác cũng có thể giúp cây hạn chế gặp hạn ở các giai đoạn quan trọng trong chu trình sống.

Tuy nhiên, thực tế là, ước tính khoảng 80% diện tích trồng ngô của nước ta không có hệ thống thủy lợi, hoạt động tưới tiêu phụ thuộc vào nguồn nước mưa tự nhiên. Hơn nữa, phần lớn ngô được trồng trên khu vực đồi núi trọc, núi đá, các khu vực này thường có khí hậu khắc nghiệt, điều kiện thời tiết thất thường, khả năng giữ nước của đất kém. Vì vậy, biện pháp giảm khả năng cây ngô gặp hạn trở nên bất khả thi trong thời gian cấp bách khi các đợt hạn xảy ra nhiều và khó dự báo hơn. Biện pháp làm tăng khả năng chống chịu với hạn của cây ngô được cho là có tiềm năng và lợi thế hơn.

Hiện nay, người ta có thể dùng phương pháp lai tạo giống hoặc tạo cây chuyển gen để tạo ra các cây có tính trạng mới tốt hơn. Phương pháp lai tạo được coi là phương pháp truyền thống để tạo giống mới. Tuy nhiên, lai tạo 5 ngô cần nhiều thời gian, công sức và diện tích trồng. Hơn nữa, trong quá trình lai tạo, bên cạnh tính trạng mong muốn thường đi kèm với các tính trạng không mong muốn.

Ngoài ra, sự cách ly sinh sản giữa các loài cũng là một trong những hạn chế của phương pháp lai tạo giống này [6]. Trong khi đó, phương pháp tạo cây biến đổi gen mang lại nhiều lợi thế cho người tạo giống. Thời gian để tạo cây mang tính trạng mong muốn cần ít thời gian hơn, phương pháp sàng lọc đơn giản hơn. Đồng thời, sự cách biệt về khoảng cách di truyền được xóa bỏ giúp các nhà khoa học có thể đưa vào cây trồng các đặc tính tốt của những loài nằm rất xa trong cây phát sinh chủng loại [6].

Do đó, ngày càng nhiều các giống cây trồng mới được tạo ra là kết quả của công nghệ tạo cây biến đổi gen. Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn 1.