Luận văn Thạc sĩ: Vai trò protein giàu methionine ở cây Arabidopsis thaliana

Luận văn nghiên cứu vai trò protein giàu methionine trên Arabidopsis thaliana, phân tích chức năng gen và đáp ứng của cây với stress môi trường.

• Tác giả: Lê Thị Ngọc Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Tiến Dũng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây Arabidopsis thaliana
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Protein Giàu Methionine trong Arabidopsis thaliana

Protein giàu methionine (MRP) là một nhóm protein quan trọng trong cây Arabidopsis thaliana, đóng vai trò thiết yếu trong việc bảo vệ tế bào khỏi các tác động tiêu cực của môi trường. Methionine là một amino acid chứa lưu huỳnh, có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ. Các protein giàu methionine được phát hiện có liên quan mật thiết đến khả năng chịu đựng điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn và độc tính kim loại. Luận văn này nghiên cứu vai trò của MRP trong cơ chế phòng vệ của thực vật, đặc biệt là trong việc giảm thiểu các dạng oxy phản ứng (ROS) trong tế bào. Sự hiểu biết sâu sắc về protein methionine-rich sẽ giúp cải thiện khả năng chịu chịu stress của các cây trồng nông nghiệp.

1.1. Định nghĩa và đặc điểm cấu trúc

Protein giàu methionine (AtMRP) được định nghĩa là các protein có hàm lượng cao amino acid methionine trong cấu trúc. Các MRP chứa các yếu tố cis đặc biệt trên vùng promoter, cho phép chúng đáp ứng nhanh chóng với các điều kiện stress. Cấu trúc phân tử của protein methionine cho phép chúng tương tác với các dạng oxy phản ứng và neutralize các tác nhân gây oxidative stress hiệu quả.

1.2. Nguồn gốc và phân bố trong cây

Protein AtMRP được phát hiện phân bố rộng rãi trong các bộ phận khác nhau của Arabidopsis thaliana, bao gồm ty thể, lục lạp và các organelle khác. Sự phân bố này cho thấy protein giàu methionine có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý khác nhau. Nghiên cứu chỉ ra rằng gen mã hóa MRP được biểu hiện khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường cụ thể.

II. Vai trò của Methionine Sulfoxide Reductase và Cơ chế Bảo vệ

Methionine sulfoxide reductase (Msr) là enzyme quan trọng tham gia vào quá trình khử methionin sulfoxide trở về methionine nguyên gốc. Khi protein giàu methionine bị oxy hóa dưới tác động của các dạng oxy phản ứng (ROS), methionine chuyển đổi thành methionin sulfoxide hoặc methionin sulfone. Quá trình này có thể được đảo ngược nhờ vào hoạt động của enzyme Msr, giúp bảo vệ chức năng của protein và tế bào. Luận văn chứng minh rằng sự hiện diện của protein methionine-rich tạo ra một hệ thống bảo vệ phức tạp, chống lại stress oxidative trong điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn cao và tiếp xúc với cadmium.

2.1. Quá trình oxy hóa và khử methionine

Methionine trong protein giàu methionine là mục tiêu dễ bị oxy hóa của các ROS. Quá trình này tạo ra methionin sulfoxide (MetO) và tiếp tục hình thành methionin sulfone (MetO2). Enzyme methionine sulfoxide reductase có hai dạng chính là MsrA và MsrB, có khả năng đảo ngược phản ứng oxy hóa này, giúp khôi phục chức năng ban đầu của protein methionine-rich.

2.2. Cơ chế chịu stress dưới điều kiện hạn hán và mặn

Dưới điều kiện hạn hán hoặc mặn cao, protein AtMRP được biểu hiện mạnh mẽ hơn, cho thấy vai trò quan trọng của protein giàu methionine trong chịu stress. Các gen mã hóa MRP chứa nhiều yếu tố cis đáp ứng với axit abscisic (ABA) và các yếu tố điều hòa khác, cho phép chúng được hoạt hóa trong các điều kiện bất lợi.

III. Phân loại chức năng Gen AtMRP và Dự đoán Vị trí Tế bào

Trong luận văn này, các gen mã hóa protein methionine-rich (AtMRP) được phân loại theo các chức năng sinh học khác nhau bằng phương pháp MAPMAN. Kết quả phân loại cho thấy protein giàu methionine tham gia vào các quá trình quan trọng như phản ứng với stress, trao đổi chất và tín hiệu hóa học. Dự đoán vị trí tế bào của MRP bằng các phần mềm ChloroP, pSORT, CELLO và Blast2GO chỉ ra rằng các protein methionine chủ yếu định vị tại ty thể và lục lạp, những nơi xảy ra các quá trình trao đổi năng lượng mạnh mẽ. Sự phân bố này phù hợp với vai trò bảo vệ của protein AtMRP trước các dạng oxy phản ứng được tạo ra trong quá trình hô hấp và quang hợp.

3.1. Phân loại theo chức năng sinh học

Gen AtMRP được phân loại thành nhiều nhóm theo chức năng, bao gồm các gen đáp ứng với điều kiện stress, gen liên quan đến chuyển hóa methionine, và gen tham gia vào bảo vệ tế bào. Phân tích MAPMAN cho thấy protein giàu methionine đóng vai trò trung tâm trong mạng lưới sinh học phức tạp của thực vật.

3.2. Dự đoán vị trí và cấu trúc không gian

Các công cụ sinh tin học đã dự đoán rằng protein methionine-rich chủ yếu định vị tại các bộ phận có mức oxy hóa cao như ty thể và lục lạp. Sự định vị này tối ưu hóa khả năng chống lại stress oxidative của MRP, vì đây là những vị trí chính sản xuất ROS trong tế bào thực vật.

IV. Kết quả Thử nghiệm và Ứng dụng Thực tiễn

Luận văn tiến hành các thử nghiệm trên dòng cây RBC1 được chuyển gen với protein giàu methionine so sánh với cây đối chứng kiểu dại. Kết quả cho thấy dòng cây biến đổi AtMRP có khả năng chịu mặn cao, cadmium và paraquat (gây stress oxy hóa) tốt hơn cây kiểu dại. Các thử nghiệm trên môi trường ½ MS có chứa kháng sinh hygromycin xác nhận sự chuyển gen thành công. Phát hiện này chứng tỏ protein methionine-rich có tiềm năng ứng dụng trong cải thiện các cây trồng chịu stress. Nghiên cứu về gen AtMRP mở ra hướng đi mới để phát triển các giống cây nông nghiệp có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện khí hậu khắc nghiệt.

4.1. Kết quả thử nghiệm chịu mặn và độc tính kim loại

Dòng cây RBC1 biểu hiện quá mức protein giàu methionine cho thấy khả năng chịu mặn cao hơn đáng kể. Thử nghiệm với cadmium cũng chứng tỏ protein methionine bảo vệ cây khỏi độc tính kim loại. Những phát hiện này xác nhận vai trò của gen AtMRP trong chịu stress vật lý và hóa học.

4.2. Ứng dụng trong cải thiện giống cây nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu protein giàu methionine có thể được ứng dụng để tạo ra các giống cây nông nghiệp với khả năng chịu hạn hán, mặn cao và các điều kiện stress khác. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật và kỹ thuật chuyển gen, các gen AtMRP có thể được đưa vào các cây trồng chính để tăng năng suất trong điều kiện khí hậu bất lợi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu, xác lập tín hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mRNA. Do đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N (N-terminal) trong chuỗi peptide. Tuy nhiên, Met có khả năng bị loại bỏ trong quá trình cải biến protein sau dịch mã. Trung bình một protein chứa khoảng 1,5% gốc Met trong toàn bộ chuỗi polypeptide [26].

Trong Escherichia coli, hàm lượng Met trung bình khoảng từ 1-3% (các protein giàu Met nhất: nhân tố kéo dài chuỗi polypeptide TU: 2,8%; các protein liên quan đến các điều kiện bất lợi oxy hóa KatE: 1,3%; HypT: 2%; MsrA: 3,3%) [26]. Giá trị Met tương tự cũng đã được công bố với các protein nấm men và protein ở động vật [26]. Ở thực vật, một vài protein giàu Met (MRP) đã được nghiên cứu từ rất sớm trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: quả hạnh nhân của Brazil [5], hạt hướng dương [50], ngô [49, 66], và lúa [60]. Các MRP được tìm thấy trong hạt đều có hàm lượng Met trong khoảng 11-22% [6].

Prolamin từ ngô (Zea mays) được gọi là zein, trong đó chiếm số lượng lớn là α-zein, các nhóm nhỏ hơn là β, γ, δ-zein [22]. β-zein và δ-zein là MRP với các gốc Met tập trung chủ yếu gần đầu C của phân tử. Trong 5 đó, β-zein trong ngô có trọng lượng phân tử khoảng 17,5 kDa với 160 axit amin, với 18 gốc Met và 7 gốc cysteine [76]. δ-zein được hình thành từ hai tiểu phần có trọng lượng phân tử khoảng 14,4 kDa và 21,1 kDa.

Cả hai tiểu phần này đều giàu Met: tiểu phần 21,2 kDa có chứa 26,9% Met, tiểu phần 14,4 kDa có chứa 22,8% Met [76]. Phân tử β-zein do một gen quy định trong khi đó δ-zein do 2 gen khác nhau mã hóa [76]. Gen mã hóa cho một MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá kỹ do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt là cho các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các axit amin chứa sulfur như Met. 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18% methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine [7].

Protein 2S albumin cũng được biểu hiện trong một số loài thực vật như thuốc lá, hạt cải dầu và đậu tương [7]. Hạt của một số loài đậu đã được tăng gấp đôi hàm lượng Met trong các protein do chuyển gen 2S albumin từ hoa hướng dương. Tuy nhiên, việc cải thiện hàm lượng Met trong các loại hạt đậu vẫn không đủ để đáp ứng về hàm lượng Met cần thiết trong thức ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, protein 2S albumin từ quả hạnh nhân Brazil và hoa hướng dương đã được biết là nguyên nhân gây dị ứng trong một số trường hợp [47].

Chính vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu protein giàu Met còn là cơ sở để ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm cải thiện hàm lượng Met ở cây trồng. Năm 2000, Chakraborty và cs đã tinh sạch được protein mã hóa bởi gen AmA1 tách chiết từ hạt rau dền đỏ (Amaranthus hypochondriacus) [20]. Protein AmA1 có hàm lượng cân bằng các axit amin thiết yếu gồm lysine, tryptophan, tyrosine, và axit amin chứa lưu huỳnh. Đặc biệt là AmA1 không gây dị ứng do không tạo ra phản ứng với IgE.

Biểu hiện quá mức gen này trên khoai tây làm tăng hàm lượng Met 3-7 lần so với kiểu dại [20]. Năm 2005, Izquierdo và Godwin đã tách dòng trình tự cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho δ-Kafirin, protein dự trữ giàu Met có mặt trong hạt cây cao lương (Sorghum bicolor L.) và biểu hiện thành công. Protein δ-Kafirin có trọng lượng phân tử khoảng 16 kDa với 147 axit amin trong đó 17% là Met [44]. Sử dụng PCR phiên mã ngược và Realtime PCR cho thấy δ-kafirin chỉ biểu hiện ở những hạt đang trong giai đoạn 6 phát triển [44].

So sánh trình tự DNA cho thấy gen mã hóa cho δ-Kafirin có độ tương đồng cao với gen mã hóa cho tiểu phần 14,4 kDa của δ-zein ngoại trừ thiếu đi một phần quy định vùng giàu Met. Do vậy, hàm lượng Met có mặt trong δ-Kafirin thấp hơn trong δ-zein [76]. Vai trò của Met trong phân tử protein liên quan đến tính kỵ nước, tạo nên sự cuộn gấp để tạo thành các bậc cấu trúc không gian cho protein. Met được tìm thấy nhiều tại phần lõi kỵ nước trong cấu trúc không gian của protein, trong khi ở các protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép.

Tuy nhiên, đối với các protein có chứa Met bộc lộ bên ngoài bề mặt tiếp xúc thì rất dễ bị oxy hóa thành Met sulfoxide (MetO) do tác động của các dạng oxy phản ứng [15]. Do đó, MRP được xem như protein mô hình để nghiên cứu một cách hiệu quả về sự oxy hóa Met trong các loài sinh vật khác nhau. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine 1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng Quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất tối ưu của thực vật chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong bối cảnh khí hậu trái đất có nhiều thay đổi bất thường như hiện nay.

Gần đây, tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) đã chỉ ra rằng, điều kiện bất lợi từ môi trường sống ảnh hưởng đến 37% năng suất cây trồng trên toàn thế giới [46]. Hạn hán và mặn hóa là nhân tố bất lợi chính mà cây trồng gặp phải. Quá trình sống của thực vật và tạo sản phẩm thứ cấp phụ thuộc chủ yếu vào nước. Gần 20% diện tích đất trên toàn thế giới đang bị thiếu nước cho sản xuất cây trồng và con số này sẽ ngày càng tăng lên khi diện tích đất trồng ngày càng bị sa mạc hóa [17].

Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, dẫn đến quá trình sinh trưởng chậm lại. Do khí khổng đóng nên lượng CO 2 trong lá bị giảm xuống, ức chế quá trình cố định carbon nhưng lại làm tăng lượng các dạng oxy phản ứng (ROS) có mặt trong thực vật, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa [38]. Đất nhiễm mặn cũng gây ảnh hưởng lớn đến cây trồng, làm giảm đến 23% năng suất 7 cây trồng trên toàn thế giới [86]. Tăng cường nồng độ muối trong đất làm giảm khả năng hấp thụ nước của thực vật.

Khi một lượng lớn Na + và Cl- được đưa vào cây thông qua rễ, cả hai ion Na+ và Cl- đều gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển do giảm quá trình trao đổi chất và giảm hiệu suất quang hợp [25]. Do quá trình công nghiệp hóa tăng nên tình trạng đất bị nhiễm ion kim loại nặng cũng là một vấn đề đáng được đề cập đến. Các kim loại nặng cadmium (Cd), bạc, thủy ngân xâm nhập vào các hệ sinh thái từ nhiều nguồn khác nhau: khói bụi, nước thải của các xí nghiệp sản xuất chì, thiếc, sắt, thép, nước thải trong ngành đúc điện, trong phân lân bón cho cây trồng, trong các nhiên liệu diesel [34]. Cd dễ dàng được cây hấp thụ và chuyển lên mạch xylem của lá, gây ức chế tăng trưởng, ảnh hưởng đến khả năng quang hợp, sự hấp thu các hợp chất vi lượng và đa lượng dẫn đến giảm năng suất cây trồng [11].

Điều quan trọng là Cd sẽ đi vào chuỗi thức ăn và gây ra mối đe dọa cho sức khỏe con người cũng như các nhóm động vật khác [21]. Kim loại này có thể gây độc tế bào theo cách trực tiếp hay gián tiếp và có thể được giải thích thông qua cấu trúc hóa học của nó. Cd có thể liên kết với nhóm -SH của các protein và enzyme, làm cho protein, enzyme bị mất đi cấu hình, không hoạt động được chức năng, đặc biệt là với nhóm enzyme làm nhiệm vụ thu dọn ROS [24]. Bên cạnh đó, cơ chế gây độc quan trọng của cadmium với tế bào thực vật do sự tương đồng về mặt hóa học của Cd2+ và các ion kim loại liên kết với vị trí hoạt động của enzyme hay các yếu tố truyền tin.

Cd2+ ảnh hưởng đến cơ chế nội cân bằng của các ion kim loại thiết yếu và các ion kim loại hóa trị 2 như Fe và Zn, giải phóng ion Fe/Cu tự do gây kích thích hiệu ứng Fenton gây ra ROS, tăng các quá trình tổn thương do oxy hóa [24]. Chính vì vậy, Cd cũng như các ion kim loại nặng khác, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa và tăng cường hàm lượng ROS trong thực vật bằng cách gây rối loạn quá trình loại bỏ ROS của các chất chống oxy hóa [24]. Cho đến nay, paraquat vẫn giữ được tầm quan trọng của nó bên cạnh các loại thuốc diệt cỏ khác có nguồn gốc từ glyphosate và glufosinate. Paraquat là thuốc diệt cỏ có 8 hoạt lực nhanh, làm đảo chiều chiều dòng điện tử của quang hệ I (PSI) xảy ra trong lục lạp.

Kết quả là gây nên sự tích lũy superoxide trong lục lạp [39]. Superoxide được tạo ra một cách liên tục và nhanh chóng sẽ lấn át các cơ chế bảo vệ nội sinh của thực vật và gây ra hàng loạt ảnh hưởng tiêu cực đến thực vật. Paraquat có thể dễ dàng thâm nhập xuyên qua lớp biểu bì lá, làm giảm khả năng quang hợp một cách nhanh chóng, gây mất sức trương và làm vỡ màng tế bào. Các dấu hiệu này được nhận thấy chỉ sau vài giờ xử lý với paraquat trong điều kiện ánh sáng liên tục và cuối cùng là các mẫu mô bị mất nước và mất màu hoàn toàn [39].

Lá cây Arabidopsis thaliana 3 tuần tuổi kiểu dại được ngâm trong dung dịch paraquat 4 µM. Sau 2 ngày thí nghiệm dưới điều kiện ánh sáng liên tục, lá cây bị mất màu hoàn toàn do paraquat là hợp chất sản sinh ROS làm phân hủy diệp lục và phá vỡ các tế bào [91]. Các dạng oxy phản ứng (ROS) là khái niệm để chỉ các dẫn xuất của oxy có khả năng oxy hóa mạnh. ROS được chia thành hai nhóm: nhóm các gốc tự do (có chứa electron liên kết chưa cặp đôi) và nhóm các dẫn xuất không phải gốc tự do.

Các ROS không phải gốc tự do dễ dàng chuyển hóa thành các gốc tự do trong quá trình phản ứng oxy hóa. Một số ROS là gốc tự do điển hình bao gồm hydroxyl, superoxide và nitric oxide; trong khi oxy mức đơn và peroxynitrile là các ROS không phải gốc tự do thường gặp trong các quá trình sinh hóa (Bảng 1.