Phát hiện người mang gen Tăng sản thượng thận thiếu 21-hydroxylase (Luận văn)

Luận văn thạc sĩ trình bày phương pháp phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (thiếu 21-hydroxylase) bằng kỹ thuật MLPA.

• Tác giả: Dương Thị Giang
• Người hướng dẫn: TS.BS Trần Huy Thịnh
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Bệnh Tăng Sản Thượng Thận và Gen CYP21A2

Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, gây nên do thiếu hụt enzyme 21-hydroxylase (21-OH). Đây là bệnh nội tiết phổ biến nhất ở trẻ em, với tần suất mắc từ 1/10.000 đến 1/15.000 ca sinh sống. Bệnh này do các đột biến gen trên CYP21A2 gây ra, làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp corticoid và androgen ở vỏ thượng thận. Hiểu rõ về cơ sở phân tử của bệnh sẽ giúp các nhà nghiên cứu và bác sĩ chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn.

1.1. Định nghĩa và Đặc điểm của TSTTBS

Tăng sản thượng thận bẩm sinh là hội chứng do thiếu hụt enzyme 21-hydroxylase, dẫn đến sự suy giảm tổng hợp cortisol và aldosterone. Bệnh biểu hiện lâm sàng đa dạng, từ dạng cổ điển nặng (mất muối, nam hóa) đến dạng không cổ điển nhẹ hơn. Bệnh có tính di truyền lặn, người mang gen dị hợp tử thường không có triệu chứng nhưng có thể truyền gen bệnh cho con em.

1.2. Cơ Chế Bệnh Sinh và Vai trò của Gen CYP21A2

Gen CYP21A2 nằm trên nhiễm sắc thể số 6, mã hóa enzyme steroid 21-hydroxylase. Enzyme này là chất xúc tác quan trọng trong con đường tổng hợp hormone corticoid. Khi gen bị đột biến, enzyme hoạt động không đủ hoặc hoàn toàn mất chức năng, gây nên tích tụ các chất tiền thân và sản sinh quá mức androgen, dẫn đến các biểu hiện lâm sàng của bệnh.

II. Các Phương Pháp Phát Hiện Đột Biến Gen CYP21A2

Phát hiện đột biến gen CYP21A2 là bước quan trọng trong chẩn đoán phân tử của TSTTBS. Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng để phát hiện các đột biến này, mỗi kỹ thuật có ưu điểm và hạn chế riêng. Kỹ thuật PCR truyền thống có thể gặp khó khăn do sự tương đồng giữa gen CYP21A2 và gen CYP21A1 giả. Các phương pháp DNA sequencing và MLPA cho kết quả chính xác và toàn diện hơn trong việc phát hiện cả đột biến điểm và xóa sóc gen.

2.1. Kỹ Thuật PCR và Giới Hạn của Nó

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là công cụ cơ bản để nhân đôi DNA và phát hiện đột biến. Tuy nhiên, vì gen CYP21A2 có sự tương đồng cao với gen giả CYP21A1, PCR thông thường dễ gây khuếch đại nhầm hoặc bỏ sót các vùng đặc biệt. Để khắc phục, các nhà nghiên cứu sử dụng PCR lồng (nested PCR) hoặc PCR đặc hiệu để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu.

2.2. Kỹ Thuật MLPA Phương Pháp Tối Ưu

Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là phương pháp tiên tiến cho phát hiện cả đột biến điểm và xóa sóc gen trong CYP21A2. MLPA sử dụng nhiều probe đặc hiệu kết hợp với ligation để phát hiện sự thay đổi trong số bản sao gen. Kỹ thuật này có độ chính xác cao, không yêu cầu sequencing và tiết kiệm chi phí, do đó được xem là giải pháp lý tưởng cho chẩn đoán TSTTBS ở quy mô lâm sàng.

III. Ứng Dụng MLPA trong Phát Hiện Người Mang Gen Bệnh

Phát hiện người mang gen bệnh (người mang gen dị hợp tử) là mục tiêu quan trọng của chẩn đoán phân tử TSTTBS, đặc biệt là trong tư vấn di truyền và tầm soát sơ sinh. Những người mang một bản sao đột biến thường không có triệu chứng nhưng có khả năng truyền bệnh cho con em. Kỹ thuật MLPA cho phép phát hiện chính xác người mang gen trong gia đình bệnh nhân, giúp tư vấn di truyền hiệu quả hơn. Điều này đặc biệt quan trọng trong kế hoạch sinh đẻ của các cặp vợ chồng có tiền sử gia đình mắc TSTTBS.

3.1. Tầm Soát Sơ Sinh và Phát Hiện Sớm

Tầm soát sơ sinh là quy trình lâm sàng giúp phát hiện TSTTBS ở trẻ sơ sinh trước khi có triệu chứng lâm sàng. Việc sử dụng MLPA trong tầm soát cho phép xác định chính xác những trẻ mắc bệnh hoặc mang gen bệnh. Phát hiện sớm này giúp can thiệp sớm bằng liệu pháp hormone thay thế, ngăn chặn các biến chứng nặng nề như sốc giảm muối hay viêm vòng quanh ở bé gái.

3.2. Tư Vấn Di Truyền và Lập Kế Hoạch Sinh Sản

Tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân TSTTBS giúp đánh giá rủi ro sinh con mắc bệnh. Khi cả hai bố mẹ đều là người mang gen dị hợp tử, xác suất sinh con mắc bệnh là 25%. MLPA giúp xác định chính xác kiểu gen của các thành viên gia đình, từ đó dự báo chính xác rủi ro cho các con em sắp sinh. Thông tin này hỗ trợ cha mẹ trong quyết định sinh sản và lập kế hoạch cho sức khỏe của con em.

IV. Ý Nghĩa Lâm Sàng và Triển Vọng Phát Triển

Phát hiện gen bệnh TSTTBS bằng kỹ thuật MLPA có ý nghĩa lâm sàng sâu sắc trong chẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnh. Với độ chính xác cao và khả năng phát hiện cả đột biến điểm lẫn xóa sóc gen, MLPA đã trở thành phương pháp tiêu chuẩn tại các trung tâm y tế lớn. Triển vọng phát triển của chẩn đoán phân tử bao gồm tích hợp kỹ thuật MLPA vào quy trình tầm soát sơ sinh, phát hiện trước sinh thông qua xét nghiệm sin vô, và phát triển liệu pháp gen trong tương lai gần.

4.1. Lợi Ích của MLPA trong Chẩn Đoán Lâm Sàng

MLPA mang lại nhiều lợi ích thực tiễn cho chẩn đoán TSTTBS: tiết kiệm thời gian (kết quả trong 2-3 ngày), chi phí thấp so với sequencing toàn bộ gen, không yêu cầu điều kiện đặc biệt để bảo quản mẫu. Phương pháp này cho phép bác sĩ lâm sàng đưa ra chẩn đoán chính xác, từ đó bắt đầu điều trị kịp thời với liệu pháp hormone thay thế và quản lý các biến chứng.

4.2. Hướng Phát Triển Tương Lai

Triển vọng tương lai của chẩn đoán phân tử TSTTBS bao gồm: (1) tích hợp MLPA vào chương trình tầm soát sơ sinh quốc gia, (2) phát triển kiểm tra trước sinh cho gia đình nguy cao, (3) ứng dụng sequencing thế hệ tiếp theo (NGS) để phát hiện các biến thể hiếm gặp. Những tiến bộ này sẽ cải thiện tiên lượng và chất lượng sống của bệnh nhân TSTTBS.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia - CAH) là bệnh gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham gia vào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình tổng hợp hormon vỏ thƣợng thận; trong đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất và chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp theo là thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm 5 - 9%, còn lại là các thể bệnh rất hiếm gặp do thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α-hydroxylase và 20, 22- desmolase [1]. Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền đơn gen lặn, trên nhiễm sắc thể thƣờng do đột biến gen CYP21A2 gây nên. Đối với thể nặng, nếu bệnh không đƣợc chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến cơn suy thƣợng thận cấp và bệnh nhân có thể tử vong. Các thể bệnh khác có thể dẫn đến nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; do đó bệnh ảnh hƣởng nặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh sản, tâm lý của ngƣời bệnh và gia đình [6].

Sự phát triển và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, giải trình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification)… đã phát hiện đƣợc hầu hết các đột biến gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh, trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, các dạng đột biến mất đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% các trƣờng hợp [25]. Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy mối tƣơng quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh bằng cách xác định các đột biến đặc trƣng của từng thể bệnh. Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng nhƣ: mất đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm mất hoàn toàn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây ra những thể bệnh nặng và hay gặp ở thể mất muối. Đột biến sai nghĩa nhƣ I172N làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase chỉ còn 1 - 2% so với bình thƣờng gặp ở thể nam hoá đơn thuần hay P30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase chỉ còn 20 - 50% so với bình thƣờng gặp ở thể bệnh không điển hình.

Xác định chính xác các dạng 1 đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán sớm và có những biện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm những tác động của việc thiếu hụt enzym 21 - hydroxylase đối với bệnh nhân. Bên cạnh đó việc xác định ngƣời lành mang gen sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền và chẩn đoán trƣớc sinh giúp giảm tỷ lệ sinh ra những đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơ sinh để quản lý và chăm sóc tốt những trẻ có nguy cơ cao bị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh trong cộng đồng. Các đột biến mất đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, là dạng đột biến gây ra thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán chính xác và kịp thời. Tuy nhiên, các dạng đột biến này rất khó xác định bằng các kỹ thuật PCR thông thƣờng.

Gần đây, kỹ thuật MLPA là một phƣơng pháp mới với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản và độ nhạy cao đã phát hiện chính xác các dạng đột biến này trên gen CYP21A2. Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA vẫn chƣa đƣợc khai thác nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là trong việc xác định ngƣời lành mang gen gây các bệnh di truyền. Chính vì vậy nhằm mục đích giúp quản lý tốt ngƣời mang gen và cung cấp những thông tin hữu ích cho tƣ vấn di truyền và chẩn đoán trƣớc sinh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát hiện ngƣời mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE 1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS Bệnh tăng sản tuyến thƣợng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinh dục- thƣợng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thƣờng, do sự thiếu hụt các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thƣợng thận. Trong đó, sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) là hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp đến là sự thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase (11- OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), 17α- hydroxylase (17- OH) và ít gặp hơn là sự thiếu hụt 20 - 22 desmolase [35]. Sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase dẫn đến sự tổng hợp cortisol và phần lớn aldosterron của tuyến thƣợng thận bị suy giảm, gây tăng tiết Adreno Corticotropin Hormon (ACTH) tuyến yên, tăng sản vỏ thƣợng thận và sản xuất thừa androgen.

Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện ở các mức độ nặng hay nhẹ khác nhau. Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thƣợng thận cấp và cƣờng androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase ở mức độ vừa phải (1 - 3%) sẽ biểu hiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cƣờng androgen và khi enzym 21- hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) sẽ xuất hiện thể bệnh không cổ điển [15]. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới Theo y văn, trƣờng hợp bệnh TSTTBS đầu tiên trên thế giới đƣợc mô tả bởi nhà giải phẫu học De Crecchico vào năm 1865.

Đầu thế kỷ 19, Emil Huschke, một nhà giải phẫu và phôi thai học, đã phân biệt vỏ và tủy thƣợng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan giữa tuyến thƣợng thận và tuyến sinh dục [8]. Bệnh nhân TSTTBS thể mất muối đầu tiên đƣợc Butler (1939) và Wilkins (1940) mô tả. Năm 1950 - 1951, Wilkins, Bartter và cộng sự đã chứng minh rằng việc sử dụng cortisol có thể ức chế sự tổng hợp thừa androgen trong hội chứng sinh dục - thƣợng thận do TSTTBS [9]. Trong giai đoạn này, các nhà nghiên cứu đã xác định 6 steroid vỏ thƣợng thận có tác dụng sinh học, chúng đƣợc tổng hợp từ cholesterol và đƣợc chia thành 3 nhóm: (i) Steroid chuyển hóa muối gồm DOC, corticosteron và aldosteron; (ii) Steroid chuyển hóa đƣờng gồm hydrocortisone, cortisol; (iii) Steroid sinh dục nam (androgen) gồm dehydroepiandrosteron và androstendion [10].

Từ những năm 1970, nghiên cứu và định lƣợng 17- OHP, một tiền chất trực tiếp tạo ra cortisol, đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh TSTTBS. Năm 1979 - 1980, Migeon và Rosenwaks hoàn chỉnh tiêu chuẩn chẩn đoán hóa sinh của bệnh TSTTBS: do thiếu enzym 21- OH gây tích tụ các tiền chất trƣớc chỗ ứ đọng chuyển hóa bao gồm 17- OHP và progesteron, dẫn đến tăng tổng hợp testosteron ở vỏ thƣợng thận, nồng độ testostrron trong máu tăng và sản phẩm đào thải của testosteron trong nƣớc tiểu là 17- Cetosteroid (17-CS) tăng. Nồng độ 17- OHP tăng cao trong máu là tiêu chuẩn có giá trị đặc hiệu để chẩn đoán TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH. Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã đƣợc nhận biết từ những năm 1930 và đƣợc mô tả chi tiết bởi Knudson năm 1951, đó là bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên nhiễm sắc thể thƣờng.

Năm 1977, Dupont thông báo bản đồ gen và sự liên kết gần giữa TSTTBS và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC). Sau đó, Komainami phân lập đƣợc Cytochrome P450c21 là chuỗi peptid đơn. Năm 1982 - 4 1983, O’ Neill và Fleishwicle phát hiện sự liên quan giữa gen CYP21 với MHC nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37]. Năm 1984, Hite và cộng sự đã xác định đƣợc gen CYP21A2 và giả gen CYP21A2P có kích thƣớc 3,4 kb; nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, bên trong phức hợp MHC cùng với các gen C4 bổ thể [27].

Năm 1986, Higashi và cộng sự đã phân tích trình tự nucleotid toàn bộ gen CYP21A2 và giả gen CYP21A2P. Sau đó, các đột biến điển hình của gen CYP21A2 đã đƣợc tìm thấy, chúng đƣợc coi là nguyên nhân chính gây thiếu hụt enzym 21- OH [23]. Phƣơng pháp lai Southern blot do Edward Southern đề xuất năm 1975 đã đƣợc nhiều tác giả sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen CYP21A2 thƣờng gặp [24]. Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với một số kỹ thuật sinh học phân tử khác nhƣ giải trình tự gen, hầu hết các đột biến của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS đã đƣợc phát hiện [26].

Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam Ở nƣớc ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh TSTTBS. Các công trình nghiên cứu có thể kể đến nhƣ: Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn và cộng sự đã tổng kết 36 bệnh nhân mắc hội chứng sinh dục - thƣợng thận trong giai đoạn 1981 - 1990, chiếm tỷ lệ 1,9% tổng số bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% [9]. Năm 1994, nhóm nghiên cứu Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thu Nhạn đã tổng kết chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS. Chẩn đoán dựa vào lâm sàng và xét nghiệm hóa sinh progesteron, testosteron, cortisol, Follice Stimulating Hormon (FSH), Luteinizing Hormon (LH), điện giải đồ, 17 Cetosteroid (17- CS) và 17 – Hydroxycetosteroid (17- OHCS); điều trị bệnh bằng prednisolone và nƣớc muối đƣờng với thể mất muối [8].

Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ và cộng sự công bố nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH ở 43 bệnh nhân khám và điều trị tại 5 Bệnh viện Nhi Trung ƣơng 1989 - 1997. Nghiên cứu đƣa ra các dấu hiệu lâm sàng và giới hạn giá trị của 17- OHP, progesteron và testosteron giúp chẩn đoán và sử dụng Hydrocortison và Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả đã sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện đột biến [3]. Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH [7]. Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hƣởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia đình và bệnh nhân [2].

Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH và phát hiện ngƣời lành mang gen bệnh [4]. Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và một số yếu tố ảnh hƣởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ƣơng nhận thấy bệnh gây ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là chiều cao [1].