Luận văn: Sàng lọc và phân tích đột biến FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy

Luận văn thạc sĩ sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến gen FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) tại Việt Nam.

• Tác giả: Đỗ Thị Thanh Trung
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bảo Yên
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy AML

Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia - AML) là một bệnh lý máu nguy hiểm với tỷ lệ morbidity cao trên toàn thế giới. AML xảy ra khi các tế bào gốc tuỷ xương bị biến chứng, dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào myeloid immature. Tại Việt Nam, bạch cầu cấp dòng tủy ngày càng phổ biến, đặc biệt ở nhóm bệnh nhân trẻ tuổi. Sự phát triển của công nghệ chẩn đoán hiện đại cho phép các bác sĩ phát hiện sớm hơn thông qua các chỉ số hình thái học và phân tích hoá tế bào. Việc hiểu rõ về cơ chế bệnh sinh và các đặc điểm phân tử của AML là nền tảng quan trọng cho việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả và cải thiện tiên lượng bệnh.

1.1. Định nghĩa và đặc điểm lâm sàng

Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là bệnh ác tính được đặc trưng bởi sự tăng sinh bất thường của các tế bào myeloid immature trong tuỷ xương. Bệnh nhân AML thường biểu hiện các triệu chứng như sốt, mệt mỏi, chảy máu dưới da, nhiễm trùng tái diễn. Sự phân loại bệnh theo WHO 2008 dựa trên các tiêu chí hình thái học, hoá tế bào và di truyền, giúp xác định tiên lượng và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

1.2. Thực trạng dịch tễ học toàn cầu và tại Việt Nam

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp trên thế giới dao động từ 2-3 ca/100.000 dân/năm. Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về các đặc điểm phân tử của AML còn hạn chế, đòi hỏi cần thiết phải thiết lập các quy trình phát hiện và phân tích các đột biến gen gây bệnh. Những tìm hiểu sâu hơn về cơ chế di truyền sẽ giúp cải thiện chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân Việt Nam.

II. Gen FLT3 và vai trò trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

Gen FLT3 (Fms-Like Tyrosine Kinase 3) mã hóa protein receptor kinase tyrosine quan trọng, đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và hóa trị của tế bào máu. Khi gen FLT3 bị đột biến, nó dẫn đến sự tăng cường hoạt động kinase, kích thích sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào myeloid. Đột biến FLT3 xuất hiện trong khoảng 30-35% các trường hợp AML, được coi là một yếu tố tiên lượng xấu. Các nghiên cứu cho thấy sự liên quan chặt chẽ giữa đặc điểm phân tử của đột biến FLT3 và đáp ứng điều trị cũng như tỷ lệ sống sót của bệnh nhân. Việc phát hiện chính xác các loại đột biến này giúp xác định nhóm bệnh nhân nguy hiểm cao và điều chỉnh chiến lược điều trị.

2.1. Cấu trúc và chức năng của gen FLT3

Protein FLT3 là một receptor tyrosine kinase thuộc họ Fms, bao gồm các miền ngoài tế bào (extracellular domain) gắn ligand, miền xuyên màng (transmembrane domain) và miền nội tế bào (intracellular domain) chứa tyrosine kinase. Gen FLT3 điều hòa sự phát triển của các tế bào gốc hematopoietic thông qua cơ chế singling pathway. Hoạt động bình thường của FLT3 là cần thiết để duy trì quá trình tạo máu.

2.2. Các loại đột biến FLT3 và cơ chế bệnh sinh

Hai loại đột biến FLT3 chính gặp trong AML bao gồm: FLT3-ITD (Internal Tandem Duplication) chiếm 20-25%, và FLT3-TKD (Tyrosine Kinase Domain point mutation) chiếm 7-10%. Cả hai đều dẫn đến mất kiểm soát hoạt động tyrosine kinase, khiến protein FLT3 liên tục phát tín hiệu giúp tế bào ung thư tăng sinh và chống lại quá trình apoptosis.

III. Phương pháp sàng lọc và phân tích đột biến FLT3

Việc sàng lọc và phân tích các đặc điểm phân tử của đột biến FLT3 trên bệnh nhân AML ở Việt Nam đòi hỏi các kỹ thuật phân tử hiện đại. Luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Thanh Trung đã thiết lập các quy trình phát hiện đột biến gen FLT3 sử dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi đặc hiệu. Quy trình bao gồm tách chiết DNA từ mẫu máu, thiết kế mồi nhân bản, thực hiện phản ứng PCR, và phân tích kết quả bằng điện di agarose/acrylamide. Phương pháp này cho phép phát hiện chính xác các loại đột biến FLT3-ITD cùng với việc xác định kích thước, trình tự và mức độ đột biến trong mỗi mẫu bệnh phẩm.

3.1. Tách chiết DNA và thiết kế mồi PCR

DNA tổng số được tách từ mẫu máu toàn phần sử dụng các kit kháng axit. Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân bản vùng gen FLT3 chứa đột biến ITD. Quy trình tối ưu hóa PCR bao gồm điều chỉnh nồng độ mồi, Mg2+, và các thông số nhiệt độ để đạt hiệu suất cao nhất và độ đặc hiệu cao.

3.2. Phân tích kết quả và nhân dòng gen

Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di agarose để phát hiện các băng có kích thước khác so với bình thường, chỉ ra sự có mặt của đột biến FLT3-ITD. Các mẫu dương tính được nhân dòng vào vectơ tái tổ hợp và tiến hành đọc trình tự gen bằng phương pháp Sanger để xác định chính xác vị trí và tính chất của đột biến.

IV. Kết quả nghiên cứu và ý nghĩa lâm sàng

Kết quả từ luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Thanh Trung cho thấy quy trình phát hiện đột biến FLT3 đã được thiết lập thành công ở Việt Nam. Các đặc điểm phân tử của đột biến gen FLT3-ITD được phân tích chi tiết bao gồm số lượng đột biến trên mẫu, kích thước đột biến, trình tự đột biến, và mức độ đột biến. Kích thước các đột biến FLT3-ITD được ghi nhận dao động trong khoảng nhất định, và tỷ lệ các mẫu dương tính phản ánh tỷ lệ mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy có chứa đột biến này ở bệnh nhân Việt Nam. Những phát hiện này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh AML, giúp định tính được nhóm bệnh nhân có tiên lượng xấu cần can thiệp điều trị tích cực hơn.

4.1. Các đặc điểm phân tử của đột biến FLT3 ITD

Phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 cho thấy đa số mẫu dương tính chứa đột biến FLT3-ITD với kích thước khác nhau, từ 15 bp đến hàng trăm base pair. Trình tự đột biến được xác định bằng phương pháp Sanger cho thấy các vùng lặp lại khác nhau giữa các bệnh nhân. Mức độ đột biến (tỷ lệ %) trong mỗi mẫu biến thiên, phản ánh beban khối u di truyền.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và dự báo tiên lượng

Việc phát hiện đột biến FLT3-ITD có ý nghĩa lâm sàng quan trọng trong chẩn đoán xác định bệnh AML và đánh giá tiên lượng. Bệnh nhân mang đột biến FLT3 thường có tiên lượng xấu hơn, tỷ lệ tái phát cao, và đáp ứng điều trị kém hơn so với nhóm không mang đột biến. Do đó, sàng lọc đột biến FLT3 nên được thực hiện thường quy để hướng dẫn lựa chọn phương pháp điều trị và theo dõi tiên lượng bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, di truyền học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học ở cấp độ phân tử (gen và hệ gen) ngày càng được xem một tiêu chuẩn quan trọng trong chẩn đoán và tiên lượng các loại bệnh, trong đó có bệnh ung thư bạch cầu. Ung thư bạch cầu được chia làm 4 loại tùy theo tính chất cấp tính hay mạn tính và phân loại tế bào dòng tủy hay dòng lympho. Và theo thống kê trên thế giới, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) là loại có mức độ phổ biến cao và bộc phát nhanh nên được quan tâm nhất. Các bác sĩ thường tiến hành các xét nghiệm di truyền đối với bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy, nhằm quyết định phác đồ điều trị đặc hiệu cho người bệnh để đạt được kết quả tốt nhất.

Hầu hết bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy đạt tỉ lệ lui bệnh 100% sau một đợt điều trị tấn công, 75- 80% lui bệnh hoàn toàn trên 5 năm và phần nhiều trong số đó có thể coi là đã được chữa khỏi. Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy có đặc điểm là các tế bào tăng sinh không kiểm soát, chưa biệt hoá, gọi là tế bào non, cùng với các đặc điểm tế bào dòng tuỷ. Tỷ lệ mắc là 1/150.000 trong suốt thời kỳ niên thiếu và dậy thì. Thống kê cho thấy , mỗi năm số bêṇ h nhân vào Viên Huyết h ọc Truyền máu trung ương đều gia tăng , và trong tổng số bêṇ h nhân bi ̣ung thư máu có tới 2/3 bêṇ h nhân ung thư bac̣ h cầu cấp dòng tủy.

Hầu hết các trường hợp này đều không có nguyên nhân rõ ràng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan giữa tỷ lệ mắc bệnh và các yếu tố liên quan như nhiễm phóng xạ, tiếp xúc với hóa chất, hoặc kèm theo mắc các bệnh khác như thiếu máu Fanconi hay hội chứng Down. Ngoài ra, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy phát sinh do các thay đổi bất thường (đột biến) trong tế bào gốc tạo bạch cầu gây ra trong đời sống của một cá thể, làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu, tạo ra nhiều tế bào bạch cầu bất thường, dẫn đến mất chức năng bảo vệ cơ thể. Nếu không được chẩn đoán, điều trị kịp thời và hiệu quả, bệnh nhân AML có thể tử vong do bị nhiễm trùng, chảy máu, thiếu máu.

Những bệnh nhân đã phát hiện ra bệnh ung thư bạch cầu cấp thường sẽ được điều trị ngay, nhằm tiêu diệt các tế bào bạch cầu ác tính và để tuỷ xương phục hồi 1 Luận văn thạc Đỗ Thị Thanh trở lại bình thường. Điều trị hoá chất là phương thức điều trị chính đối với bệnh ung thư bạch cầu cấp. Thông thường, sự kết hợp giữa các thuốc hoá chất (các thuốc steroid) được sử dụng theo một kế hoạch điều trị (thường được gọi là một phác đồ). Điều trị hóa chất được chia làm nhiều giai đoạn: điều trị tấn công, điều trị dự phòng thâm nhiễm hệ thần kinh trung ương, điều trị duy trì.

Ngoài điều trị bằng hóa chất, bệnh nhân AML có thể được điều trị theo một số phương pháp khác: ghép tuỷ xương, tia xạ khối u. Yếu tố tiên lượng là yếu tố quan trọng nhất để xây dựng các phác đồ điều trị trên các bệnh nhân có kết quả di truyền tế bào bình thường. Một số yếu tố tiên lượng tốt là các biến đổi ở mức độ phân tử (gen và ADN) thường xuyên xuất hiện ở các bệnh nhân leukemia cấp dòng tủy, như: đột biến gen NPM1 và gen CEBPA. Tuy nhiên, sự có mặt của đột biến nhân đoạn của gen FLT3 là một yếu tố tiên lượng xấu.

Chẩn đoán chính xác đột biến gây bệnh là công đoạn mang tính chất quyết định trong việc đưa ra tiên lượng và phác đồ điều trị cho bệnh nhân. Đối với bệnh nhân AML, điều này góp phần quan trọng để tăng hiệu quả chữa bệnh cũng như khả năng sống sót. Các đột biến gen thường gặp ở bệnh nhân AML đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, nhưng ở Việt Nam hiện vẫn chưa có một nghiên cứu nàothống kê đầy đủ về loại đột biến cũng như tỉ lệ đột biến, và nghiên cứu các đặc điểm phân tử của các đột biến này. Đây là một thiếu sót lớn trong việc đưa ra phương pháp điều trị chính xác và kịp thời nhất.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu tập trung vào đột biến trên gen FLT3 có tên:“Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam”với các mục tiêu: 1. Thiết lập quy trình sàng lọc các đột biến FLT3-ITD trên bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy. Bước đầu ứng dụng quy trình đã xây dựng để sàng lọc các đột biến FLT3-ITD trên bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy trong quy mô phòng thí nghiệm. 2 Luận văn thạc Đỗ Thị Thanh 3.

Phân tích các đặc điểm phân tử của các đột biến FLT3-ITD tìm được. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML) Tất cả các tế bào máu do tuỷ xương tạo ra, bao gồm:hồng cầu: mang oxy đi khắp cơ thể; bạch cầu: chống lại các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể, bảo vệ cơ thể khỏi các bệnh nhiễm trùng; tiểu cầu: giúp hình thành cục máu đông trong quá trình đông máu. Có nhiều loại bạch cầu xuất phát từ hai dòng tế bào khác nhau: dòng tế bào lympho (T và B) và dòng tuỷ (bạch cầu đơn nhân, ưa axit, ưa kiềm và trung tính) (Hình 1.1: Sự phát sinh các loại tế bào máu [55] Bạch cầu có nhiệm vụ chống vi khuẩn, protein lạ xâm nhập vào cơ thể, tạo khả năng miễn dịch của cơ thể đối với nhiều bệnh do virus và vi khuẩn gây nên.

Bình thường, các tế bào bạch cầu tự sửa chữa và tái sinh theo con đường được kiểm soát [55]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp quá trình này thoát khỏi sự kiểm soát và các tế bào tiếp tục phân chia, nhưng không trưởng thành, chiếm đầy trong tuỷ xương và ngăn cản sự tạo ra các tế bào máu khoẻ mạnh. Nguy hiểm hơn là, các tế bào bạch cầu ác tính không trưởng thành, không thực hiện được chức năng bình 3 Luận văn thạc Đỗ Thị Thanh thường của chúng, dẫn tới nguy cơ nhiễm khuẩn tăng. Hơn nữa, tuỷ xương không sản xuất đủ hồng cầu và tiểu cầu khoẻ mạnh, hậu quả là xuất hiện các triệu chứng như thiếu máu và ban đỏ.

Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là một trong bốn loại ung thư bạch cầu. Đây là một bệnh lý của tủy xương, do sự chuyển dạng bất thường của tế bào nguồn tạo máu, từ đó đưa đến các dòng tế bào không biệt hóa hay biệt hóa bất thường. Mỗi loại bệnh ung thư bạch cầu có đặc trưng và cách điều trị riêng[49]. Vậy thì nguyên nhân của bệnh ung thư bạch cầu là gì? Cho đến nay, nguyên nhân chính xác của các bệnh ung thư bạch cầu vẫn chưa được khẳng định rõ ràng, đầy đủ.

Các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm ra nguyên nhân có khả năng gây ra bệnh này. Một số nghiên cứu về AML tập trung vào việc tìm hiểu về trẻ em mắc các rối loạn di truyền, như hội chứng Down, được cho rằng có nguy cơ phát triển thành bệnh ung thư bạch cầu cao. Nguy cơ này cũng tăng nhẹ đối với anh chị em của những bệnh nhân AML, mặc dù nguy cơ này vẫn còn ít. Trong những năm gần đây, một số công bố cho thấy các trẻ em sống ở gần các nhà máy hạt nhân hơn hoặc ở gần các đường điện cao thế có nguy cơ mắc bệnh AML cao hơn, tuy nhiên, chưa có bằng chứng xác thực nào[34], [44].

Đặc trưng về mặt dịch tễ của bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là giống như các loại ung thư khác, không lây nhiễm và không thể truyền sang cho người khác được. Khi các tế bào bạch cầu ác tính nhân lên trong tuỷ xương, sự sản xuất các tế bào máu giảm. Do đó bệnh nhân có thể có một số triệu chứng sau: mệt mỏi và khó chịu do thiếu máu, trên cơ thể xuất hiện các vết thâm tím và chảy máu kéo dài do thiếu tiểu cầu trong máu. Đôi khi, bệnh nhân bị nhiễm khuẩn vì số lượng bạch cầu bình thường thấp.

Một số bệnh nhân có các cơn đau ở các chi hoặc có thể sưng hạch lympho. Đầu tiên, các triệu chứng của bệnh giống như các triệu chứng của bệnh cúm, nhưng khi bệnh kéo dài hơn 1 hoặc 2 tuần thì có thể chẩn đoán rõ ràng. Sau khi các xét nghiệm di truyền được thực hiện, bệnh nhân nên được điều trị hoá chất ngay, nhằm tiêu diệt tế bào non trong tuỷ xương để đẩy lui bệnh ngay sau đợt điều trị tấn công đầu tiên này. Tiếp theo, bác sĩ có thể đánh giá lại tiên lượng và 4 Luận văn thạc Đỗ Thị Thanh quyết định thay đổi liều lượng hay số liệu trình điều trị, hoặc chuyển sang phương pháp ghép tuỷ xương [2], [4].

Thực trạng bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy và tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp, trong đó có bạch cầu cấp dòng tủy ngày càng tăng cao. Hơn nữa, tỷ lệ tử vong do chưa có phương thức chẩn đoán và điều trị kịp thời cũng rất lớn. Vì vậy, nhiều nhà khoa học đã tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm ra các phương pháp chẩn đoán, phân biệt các loại bệnh ung thư bạch cầu dựa trên đặc điểm di truyền học nhằm có sự chẩn đoán chính xác, giúp điều trị hướng đích hiệu quả hơn.

Các nhà nghiên cứu đã xác định sự thay đổi trong vật chất di truyền của người bệnh có hai cấp độ là: đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen. Khoảng 55% bệnh nhân AML có đột biến nhiễm sắc thể, được tìm thấy khi quan sát tiêu bản tế bào (karyotyping). Tuy nhiên, 45% bệnh nhân AML còn lại lại có kiểu hình NST bình thường (AML-NK) không thể phát hiện được (Hình 1. Từ đó, nhiều nghiên cứu đã chuyển hướng nhằm phát hiện ra các đột biến gen trên các gen khác nhau ở bệnh nhân AML.

Trong đó, hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ở bệnh nhân mắc AML-NK là đột biến trên 3 gen nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) và CCAAT-enhancer binding protein alpha (CEBPA)[5], [7], [9]. 5 Luận văn thạc Đỗ Thị Thanh Kiểu hình Kiểu hình NST bình NST bất thường thường 45% 55% Hình 1.