Luận văn thạc sĩ Lê Minh Tuấn: Tạo dòng và biểu hiện gene STb của E. coli

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene STb của E. coli gây tiêu chảy ở lợn, tối ưu điều kiện nhằm tạo nguyên liệu sản xuất vắc xin.

• Tác giả: Lê Minh Tuấn
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Thị Bích Lân
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Huế
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt STb của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thành Phố Huế

Tóm tắt

I. Tổng quan về gene STb của E

Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) là một trong những tác nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy ở lợn, đặc biệt là ở giai đoạn lợn con sau cai sữa. Trong số các chủng gây bệnh, E. coli ETEC (Enterotoxigenic E. coli) đóng vai trò quan trọng do khả năng sản sinh các độc tố ruột mạnh. Các độc tố này được chia thành hai nhóm chính: độc tố không bền nhiệt (LT) và độc tố bền nhiệt (ST). Độc tố ST lại được phân thành hai loại là STa và STb, trong đó độc tố ruột STb (enterotoxin STb) là một polypeptide gồm 48 axit amin, chủ yếu được tìm thấy ở các chủng ETEC phân lập từ lợn. Gene mã hóa cho độc tố này là estB, nằm trên plasmid và thường đi kèm với các gen độc lực khác. Việc nghiên cứu biểu hiện gene STb có ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn. Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép sản xuất một lượng lớn kháng nguyên STb tinh sạch. Nguồn kháng nguyên này là nguyên liệu cốt lõi để phát triển các loại vắc-xin cho lợn thế hệ mới, giúp phòng ngừa hiệu quả bệnh tiêu chảy do ETEC, giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi. Hơn nữa, protein tái tổ hợp còn có thể được ứng dụng trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán E. coli nhanh và chính xác tại thực địa.

1.1. Đặc điểm vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh trên lợn

Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, thường trú trong đường ruột của động vật máu nóng. Tuy nhiên, một số chủng mang các yếu tố độc lực có thể gây bệnh nghiêm trọng. Dựa trên cơ chế gây bệnh, E. coli được phân thành nhiều nhóm, trong đó E. coli ETEC là nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở lợn con. Đặc điểm của ETEC là khả năng bám dính vào niêm mạc ruột non nhờ các yếu tố bám dính (fimbriae) như F4 (K88) và F5 (K99), sau đó sản sinh các độc tố ruột (enterotoxin) gây mất nước và chất điện giải. Các chủng này thường mang các plasmid chứa các gen độc lực mã hóa cho cả yếu tố bám dính và độc tố, tạo nên một cơ chế gây bệnh phức tạp và hiệu quả.

1.2. Cơ chế gây bệnh của độc tố ruột STb trong cơ thể lợn

Độc tố ruột STb là một polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 5.1 kDa. Sau khi được tiết ra, STb có thể đi vào tế bào chất của tế bào biểu mô ruột. Không giống như độc tố STa làm tăng nồng độ cGMP nội bào, cơ chế của STb phức tạp hơn. Theo các nghiên cứu, STb kích thích tế bào ruột tiết ra bicarbonate (HCO3-) và giải phóng Prostaglandin E2 (PGE2) cũng như serotonin. Quá trình này làm thay đổi cân bằng ion, dẫn đến sự thẩm thấu nước vào lòng ruột và gây ra triệu chứng tiêu chảy cấp. Việc hiểu rõ cơ chế gây bệnh của enterotoxin STb là nền tảng quan trọng để thiết kế các loại vắc-xin và liệu pháp điều trị nhắm trúng đích, vô hiệu hóa tác động của độc tố.

II. Thách thức trong phòng trị bệnh tiêu chảy do E

Bệnh tiêu chảy ở lợn do E. coli ETEC gây ra là một thách thức lớn trong ngành chăn nuôi công nghiệp, gây thiệt hại kinh tế đáng kể do tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao ở lợn con, cùng với chi phí điều trị và sự suy giảm tăng trưởng. Việc sử dụng kháng sinh tràn lan để kiểm soát bệnh đã dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, làm giảm hiệu quả của các phác đồ điều trị truyền thống. Các loại vắc-xin hiện có, chủ yếu là vắc-xin vô hoạt (bacterin), thường chỉ có hiệu quả với một số chủng E. coli nhất định và không tạo được miễn dịch chéo rộng rãi. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát triển các giải pháp phòng bệnh mới, bền vững và hiệu quả hơn. Hướng đi đầy hứa hẹn là sản xuất các vắc-xin tiểu đơn vị dựa trên protein tái tổ hợp. Bằng cách tập trung vào các kháng nguyên bảo tồn và quan trọng như độc tố ruột STb, vắc-xin thế hệ mới có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, trung hòa độc tố và bảo vệ vật nuôi chống lại nhiều chủng ETEC khác nhau. Tuy nhiên, quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp cũng đối mặt với nhiều thách thức kỹ thuật, đòi hỏi phải tối ưu hóa từ khâu dòng hóa gen đến điều kiện nuôi cấy để đạt được hiệu suất và chất lượng protein cao nhất.

2.1. Tác động kinh tế của bệnh tiêu chảy ở lợn con

Tiêu chảy là một trong những hội chứng bệnh lý phổ biến và gây tổn thất nặng nề nhất cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt ở giai đoạn lợn con sau cai sữa. Tác động kinh tế không chỉ đến từ tỷ lệ chết trực tiếp, mà còn bao gồm các chi phí gián tiếp như: chi phí thuốc thú y, giảm tốc độ tăng trưởng, tăng tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR), và chi phí lao động cho việc chăm sóc lợn bệnh. Theo các báo cáo, tỷ lệ lợn con chết do tiêu chảy có thể chiếm tới 60-80% tổng số lợn chết trong giai đoạn theo mẹ, nhấn mạnh mức độ nghiêm trọng của vấn đề.

2.2. Hạn chế của vắc xin truyền thống và kháng kháng sinh

Các phương pháp phòng bệnh truyền thống bộc lộ nhiều hạn chế. Việc lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các chủng Escherichia coli đa kháng thuốc, gây khó khăn cho công tác điều trị. Mặt khác, các vắc-xin cho lợn dạng bacterin truyền thống thường có tính đặc hiệu hẹp, chỉ bảo hộ chống lại các chủng có trong thành phần vắc-xin. Do sự đa dạng về kháng nguyên của E. coli, các vắc-xin này không thể bảo vệ toàn diện, đòi hỏi phải có một chiến lược mới dựa trên các kháng nguyên chung như độc tố ruột.

III. Phương pháp phân lập và dòng hóa gene STb từ E

Để thực hiện biểu hiện gene STb của E. coli, bước đầu tiên và quan trọng nhất là phân lập và tạo dòng thành công gene estB. Quá trình này bắt đầu bằng việc thu thập mẫu phân từ lợn con có triệu chứng tiêu chảy. Vi khuẩn E. coli được phân lập trên môi trường chọn lọc MacConkey. Các khuẩn lạc nghi ngờ sau đó được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng chuỗi polymerase (kỹ thuật PCR). Sử dụng một cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gene estB đã công bố, đoạn gene mong muốn có kích thước khoảng 220 bp đã được khuếch đại thành công. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và tiến hành dòng hóa gen. Trong nghiên cứu này, vector tạo dòng pGEM-T Easy đã được sử dụng. Đây là một vector tiện lợi cho phương pháp TA cloning, cho phép gắn trực tiếp sản phẩm PCR (có đầu 3'-A do Taq polymerase tạo ra) vào vector đã được mở vòng và có sẵn đầu 3'-T. Hỗn hợp gắn sau đó được biến nạp vào tế bào chủ E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Việc chọn lọc các dòng tái tổ hợp thành công được thực hiện bằng phương pháp sàng lọc xanh-trắng trên môi trường chứa Ampicillin, IPTG và X-Gal. Các khuẩn lạc màu trắng (mang plasmid tái tổ hợp) được chọn lọc và kiểm tra lại bằng PCR để khẳng định sự hiện diện của gene estB trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

3.1. Quy trình khuếch đại gene estB bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR là một kỹ thuật PCR cốt lõi trong sinh học phân tử để nhân bản một đoạn DNA mục tiêu. Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được tách chiết từ khuẩn lạc E. coli phân lập từ phân lợn được dùng làm khuôn. Cặp mồi đặc hiệu cho gen độc lực estB được sử dụng để khuếch đại vùng mã hóa của gene. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy một vạch băng duy nhất, rõ nét ở kích thước dự kiến (khoảng 220 bp), xác nhận rằng quá trình khuếch đại đã diễn ra thành công và đặc hiệu.

3.2. Tạo dòng gene vào vector pGEM T Easy và biến nạp

Quá trình dòng hóa gen là bước đưa đoạn gene mục tiêu vào một plasmid (vector) để nhân bản. Sản phẩm PCR của gene estB được gắn vào vector pGEM-T Easy nhờ enzyme T4 DNA ligase. Sau đó, plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli TOP10. Các tế bào biến nạp thành công được sàng lọc dựa trên khả năng kháng kháng sinh Ampicillin và màu sắc khuẩn lạc. Các khuẩn lạc màu trắng, là những khuẩn lạc tiềm năng mang gene estB chèn vào làm gián đoạn gene lacZα trên vector, được chọn để nuôi cấy và tách chiết plasmid, chuẩn bị cho bước giải trình tự và tạo dòng biểu hiện.

IV. Hướng dẫn biểu hiện protein tái tổ hợp STb trong E

Sau khi xác nhận trình tự gene estB là chính xác, bước tiếp theo là biểu hiện protein tái tổ hợp. Gene estB được chuyển từ vector tạo dòng sang vector biểu hiện pET (pET200/D-TOPO). Hệ thống vector này được thiết kế đặc biệt để biểu hiện protein mạnh mẽ trong chủng E. coli BL21(DE3). Vector pET200/D-TOPO chứa promoter T7, một promoter rất mạnh và được điều khiển chặt chẽ. Ngoài ra, vector này còn gắn thêm một đoạn mã hóa cho 6 axit amin Histidine (đuôi 6xHis) vào đầu N- hoặc C- của protein mục tiêu, tạo thành một protein dung hợp. Đuôi His-tag này cực kỳ hữu ích cho việc tinh sạch protein sau này bằng phương pháp sắc ký ái lực kim loại (IMAC). Plasmid tái tổ hợp pET200/estB sau đó được biến nạp vào tế bào chủ E. coli BL21(DE3). Chủng vi khuẩn này mang gene mã hóa cho T7 RNA polymerase trong bộ gene của nó, dưới sự kiểm soát của promoter lacUV5. Khi bổ sung chất cảm ứng IPTG, T7 RNA polymerase sẽ được tổng hợp, sau đó nhận biết promoter T7 trên plasmid và tiến hành phiên mã mạnh mẽ gene estB, dẫn đến việc sản xuất một lượng lớn protein STb tái tổ hợp. Quá trình biểu hiện được tối ưu hóa bằng cách thay đổi các điều kiện như nồng độ IPTG, nhiệt độ và thời gian cảm ứng để thu được lượng protein hòa tan cao nhất.

4.1. Sử dụng vector biểu hiện pET và chủng E. coli BL21 DE3

Hệ thống vector biểu hiện pET và chủng E. coli BL21(DE3) là một trong những hệ thống phổ biến và hiệu quả nhất cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp. Vector pET cung cấp promoter T7 mạnh mẽ, trong khi chủng BL21(DE3) cung cấp enzyme T7 RNA polymerase cần thiết cho quá trình phiên mã. Sự kết hợp này cho phép kiểm soát chặt chẽ sự biểu hiện: protein chỉ được sản xuất khi có mặt chất cảm ứng IPTG, tránh gây độc cho tế bào trong giai đoạn sinh trưởng.

4.2. Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng biểu hiện protein dung hợp

Để tối đa hóa lượng protein dung hợp 6xHis-STb, các điều kiện nuôi cấy và cảm ứng cần được tối ưu. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nhiều yếu tố, bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy (LB, TB, YJ), nồng độ chất cảm ứng IPTG (từ 0.2-1.4 mM), thời điểm cảm ứng (dựa trên mật độ quang OD600), và nhiệt độ cảm ứng (16-37°C). Kết quả cho thấy các điều kiện tối ưu là môi trường YJ, cảm ứng bằng 0.8 mM IPTG trong 10 giờ ở nhiệt độ 30-37°C khi OD600 đạt 0.6.

V. Kết quả phân tích và tiềm năng ứng dụng kháng nguyên STb

Kết quả của quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp đã được phân tích và xác nhận bằng các kỹ thuật sinh hóa. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE là công cụ chính để đánh giá. Dịch ly giải tế bào E. coli BL21(DE3) sau khi được cảm ứng với IPTG đã được chạy điện di. Kết quả cho thấy sự xuất hiện của một vạch protein đậm nét, có trọng lượng phân tử khoảng 9 kDa. Kích thước này tương ứng với trọng lượng dự kiến của protein dung hợp 6xHis-STb (STb khoảng 5.1 kDa cộng với phần đuôi His-tag và các trình tự khác từ vector). Sự vắng mặt của vạch protein này trong mẫu đối chứng không cảm ứng đã khẳng định rằng gene estB đã được biểu hiện thành công dưới sự điều khiển của IPTG. Bước tiếp theo, protein tái tổ hợp được tinh sạch sơ bộ bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA, dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa đuôi 6xHis và ion Ni2+. Sản phẩm protein tinh sạch này chính là kháng nguyên STb, mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng thực tiễn. Hướng ứng dụng quan trọng nhất là phát triển vắc-xin cho lợn. Kháng nguyên STb có thể được sử dụng làm thành phần chính trong vắc-xin tiểu đơn vị, giúp kích thích cơ thể lợn tạo ra kháng thể đặc hiệu trung hòa độc tố, từ đó bảo vệ lợn khỏi bệnh tiêu chảy.

5.1. Phân tích protein tái tổ hợp bằng điện di SDS PAGE

Kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) được sử dụng để tách các protein dựa trên trọng lượng phân tử của chúng. Kết quả từ gel điện di cho thấy một băng protein biểu hiện vượt trội ở vị trí khoảng 9 kDa trong mẫu được cảm ứng bằng IPTG, xác nhận sự thành công của quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp. Để xác nhận chính xác hơn, kỹ thuật Western Blot sử dụng kháng thể kháng His-tag có thể được thực hiện để khẳng định danh tính của protein dung hợp.

5.2. Tiềm năng phát triển vắc xin và kit chẩn đoán E. coli

Nguồn kháng nguyên STb tái tổ hợp tinh khiết là tiền đề cho nhiều ứng dụng. Tiềm năng lớn nhất là sản xuất vắc-xin cho lợn. Một vắc-xin tiểu đơn vị chứa kháng nguyên STb hứa hẹn sẽ an toàn và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo hộ rộng. Ngoài ra, protein này còn có thể được dùng để sản xuất kháng thể đa dòng hoặc đơn dòng, làm cơ sở để phát triển các bộ kit chẩn đoán E. coli ETEC nhanh chóng và chính xác, giúp giám sát dịch tễ và đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam đóng vai trò then chốt trong cơ cấu nông nghiệp khi hàng năm cung cấp khoảng 30% giá trị sản xuất toàn ngành. Tuy nhiên, mô hình chăn nuôi tập trung đang phải đối mặt với thách thức dịch bệnh nghiêm trọng, trong đó hội chứng tiêu chảy phân trắng ở lợn con theo mẹ và lợn sau cai sữa gây thiệt hại kinh tế nặng nề nhất. Theo các khảo sát dịch tễ học thú y, tỷ lệ lợn con mắc tiêu chảy tại các nông hộ dao động từ 31,3% đến 66%, thậm chí chạm ngưỡng 100% ở đàn lợn sơ sinh từ 1 đến 20 ngày tuổi. Đáng chú ý, tỷ lệ tử vong do tiêu chảy chiếm tới 67% đến 80% tổng số lợn chết trong giai đoạn bú mẹ, và vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) chính là căn nguyên chiếm khoảng 48% tổng số các ca bệnh đường ruột.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm xuất phát từ việc vi khuẩn E. coli sinh độc tố ruột (ETEC) tiết ra hai nhóm độc tố chính là độc tố không bền nhiệt (LT) và độc tố bền nhiệt (ST). Trong đó, phân nhóm độc tố STb là tác nhân độc lực nguy hiểm đặc thù trên loài lợn nhưng cơ chế sinh bệnh và khả năng ứng dụng làm kháng nguyên phòng trị bệnh vẫn còn nhiều khoảng trống. Trong bối cảnh vi khuẩn ngày càng gia tăng mức độ kháng kháng sinh, việc phát triển vắc-xin tái tổ hợp và chế phẩm sinh học là giải pháp mang tính bền vững.

Mục tiêu cụ thể của đề tài là phân lập thành công gene estB mã hóa kháng nguyên độc tố STb từ các chủng E. coli thực địa gây bệnh tiêu chảy ở lợn con, tiến hành tạo dòng vào vector tách dòng pGEM-T Easy và chuyển tiếp vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO để biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Đồng thời, nghiên cứu xác định các thông số nuôi cấy tối ưu nhằm thu nhận sinh khối protein dung hợp 6xHis-STb với hiệu suất cao nhất.

Nghiên cứu được triển khai từ tháng 8 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016 tại Phòng thí nghiệm Miễn dịch học và Vắc-xin thuộc Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế. Kết quả mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc: tạo tiền đề công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp độ tinh sạch cao, giảm thiểu 20% đến 35% tỷ lệ phát bệnh tiêu chảy trên đàn lợn, tối ưu hóa chi phí phòng bệnh so với phương pháp ly trích kháng nguyên truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết độc lực học vi sinh vật đường ruột và công nghệ DNA tái tổ hợp hiện đại. Lý thuyết phân loại vi khuẩn đường ruột xác định E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae gồm 6 nhóm gây bệnh chính, nổi bật là nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli) có khả năng sản sinh độc tố đường ruột và yếu tố bám dính fimbriae (F4/K88, F5/K99, F6/987P). Lý thuyết cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn chỉ rõ sự phân hóa phức tạp với hơn 170 kháng nguyên thân O, 70 kháng nguyên bề mặt K, 56 kháng nguyên lông H cùng hệ thống lông bám pili.

Mô hình nghiên cứu tập trung vào 4 khái niệm cốt lõi:

1. Độc tố bền nhiệt STb: Một chuỗi polypeptide hoàn chỉnh gồm 48 axit amin (khối lượng phân tử khoảng 5,1 kDa), xuất phát từ tiền protein 71 axit amin. Cấu trúc không gian được ổn định nhờ 4 gốc Cysteine tạo nên 2 cầu nối disulfide giữa vị trí Cys10–Cys48 và Cys21–Cys36, giúp độc tố duy trì hoạt tính độc ở 100°C trong 15 phút.
2. Cơ chế bệnh sinh của STb: Kích thích tế bào biểu mô ruột non gia tăng dòng thẩm xuất ion bicarbonate (HCO3-), tăng nồng độ canxi nội bào và phóng thích prostaglandin E2 cũng như serotonin, dẫn đến mất nước và mất cân bằng điện giải cấp tính.
3. Gene estB: Trình tự nucleotide mã hóa độc tố STb khu trú trên plasmid mang yếu tố độc lực liên kết.
4. Hệ thống biểu hiện protein dị nguồn pET: Sử dụng promoter T7 mạnh kết hợp gắn đuôi dung hợp 6xHis để kiểm soát quá trình phiên mã và hỗ trợ tinh sạch qua cột sắc ký ái lực kim loại Ni2+.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập trực tiếp từ các mẫu phân lợn con mắc hội chứng tiêu chảy chưa qua điều trị kháng sinh tại các cơ sở chăn nuôi thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế. Cỡ mẫu gồm hàng chục mẫu phân tươi được lấy bằng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng, bảo quản lạnh ở 4°C và chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Phương pháp chọn mẫu phân tầng có chủ đích được áp dụng nhằm thu thập chính xác các chủng vi khuẩn đang gây bệnh thực địa.

Quy trình phân tích và thực nghiệm bao gồm:

• Nuôi cấy phân lập vi khuẩn trên môi trường chọn lọc MacConkey ở 37°C trong 24 giờ.
• Khuếch đại đoạn gene estB bằng kỹ thuật colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có bổ sung trình tự liên kết CACC ở đầu mồi xuôi. Chu trình nhiệt gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút, tiếp nối bởi 30 chu kỳ (95°C/45 giây, 46°C/1 phút, 72°C/1 phút) và kéo dài chuỗi ở 72°C trong 10 phút.
• Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 100V trong 25 đến 30 phút, nhuộm huỳnh quang Ethidium Bromide và soi dưới tia UV.
• Tạo dòng vào vector pGEM-T Easy (kích thước 3015 bp) và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42°C trong 60 giây. Sàng lọc khuẩn lạc trắng xanh trên môi trường LB agar bổ sung 100 µg/mL Ampicillin, 100 mM IPTG và 20 mg/mL X-Gal.
• Tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng kit EZ-10 Spin Column và giải trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy terminator trên hệ thống ABI-3130.
• Chuyển gene mục tiêu vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO (kích thước 5741 bp), biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) trên môi trường LB bổ sung 100 µg/mL Kanamycin.
• Khảo sát biểu hiện protein dung hợp 6xHis-STb bằng kỹ thuật điện di biến tính SDS-PAGE 15% ở dòng điện 30 mA và nhuộm xanh Coomassie Blue R250.
• Khảo sát các điều kiện tối ưu sinh khối và biểu hiện (môi trường dinh dưỡng, tỷ lệ tiếp giống 0,1% đến 5%, thời gian cảm ứng 2 đến 14 giờ, nồng độ IPTG 0,2 đến 1,4 mM, mật độ tế bào OD600 và nhiệt độ 16°C đến 37°C). Các số liệu thực nghiệm được đo lặp lại 3 lần và xử lý thống kê ANOVA qua phần mềm SAS với độ tin cậy p < 0,05.

Lý do lựa chọn chuỗi phương pháp này là đảm bảo tính chính xác phân tử tuyệt đối, loại bỏ tối đa tạp nhiễm và cho phép định lượng chính xác hiệu suất sinh tổng hợp protein mục tiêu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện khoa học quan trọng có giá trị thực tiễn cao:

Thứ nhất, phân lập và nhân bản thành công đoạn gene estB từ các chủng E. coli thực địa. Sản phẩm PCR cho một vạch điện di duy nhất, rõ nét trên gel agarose 2% với kích thước khoảng 230 bp. Kích thước này hoàn toàn tương thích với tính toán lý thuyết gồm 216 bp của vùng mã hóa phân tử STb, 4 nucleotide định hướng CACC và đoạn nucleotide adenine do enzyme Taq DNA polymerase gắn thêm.

Thứ hai, kết quả giải trình tự nucleotide của plasmid tái tổ hợp từ dòng E. coli TOP10 dương tính cho thấy đoạn gene estB hoàn chỉnh có chiều dài chính xác 216 bp. Trình tự này đạt mức độ tương đồng 100% khi so sánh với trình tự tham chiếu chuẩn của E. coli trên ngân hàng gene quốc tế NCBI (mã số AY028790), đồng thời chuỗi axit amin suy diễn khớp hoàn toàn với chuỗi protein STb tham chiếu mang mã số WP_015056453.

Thứ ba, thiết kế thành công hệ thống biểu hiện tái tổ hợp pET200/D-TOPO/estB trong tế bào chủ E. coli BL21 (DE3). Kết quả điện di SDS-PAGE 15% xác nhận phân tử protein tái tổ hợp dung hợp 6xHis-STb được biểu hiện rõ nét ở kích thước khoảng 9 kDa sau 6 giờ cảm ứng với chất cảm ứng IPTG. Đuôi dung hợp 6xHis liên kết chọn lọc và đặc hiệu với phối tử Ni2+, cho phép thu hồi protein sạch hoàn toàn qua quy trình rửa giải với dung dịch đệm Imidazole 250 mM.

Thứ tư, xác lập các thông số tối ưu cho sinh trưởng và biểu hiện sinh khối:

• Đường cong sinh trưởng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp trải qua pha lag kéo dài khoảng 2 giờ, pha log tăng sinh mạnh mẽ từ 2 đến 12 giờ và đạt mật độ quang cực đại OD600 = 4,011 tại thời điểm 12 giờ trước khi bước vào pha cân bằng từ 12 đến 16 giờ.
• Môi trường nuôi cấy YJ cho hiệu quả sinh khối cao nhất với mật độ quang OD600 đạt 2,853 sau 9 giờ, vượt trội hơn khoảng 39% so với môi trường SOC (OD600 = 2,052) và cao hơn rõ rệt so với các môi trường LB (2,487), SOB (2,540) và TB (2,615).
• Tỷ lệ tiếp giống ban đầu ở mức 2% (v/v) đạt mật độ tế bào OD600 trung bình là 2,807, tạo sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với các tỷ lệ tiếp giống 0,1%, 0,5%, 1% và 5% (dao động từ 2,613 đến 2,650).
• Điều kiện biểu hiện kháng nguyên STb tối ưu nhất được xác định là: môi trường dinh dưỡng YJ, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,8 mM đến 1,0 mM, thời điểm bổ sung chất cảm ứng khi mật độ tế bào đạt OD600 = 0,6 đến 0,8, nhiệt độ nuôi cảm ứng từ 30°C đến 37°C và thời gian cảm ứng duy trì trong 10 giờ ở tốc độ lắc 200 đến 220 vòng/phút.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất sinh trưởng vượt trội của chủng tái tổ hợp trên môi trường YJ có thể giải thích do thành phần dinh dưỡng cân bằng gồm 2% glycerol đóng vai trò nguồn carbon phân giải chậm kết hợp với hàm lượng cao dịch chiết nấm men (2%) và tryptone (1,5%), giúp hạn chế hiện tượng tích lũy axit axetic độc hại cho tế bào so với nguồn carbon glucose trong môi trường SOC. Khi mật độ quang đạt OD600 = 0,6 đến 0,8, bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn đang ở trạng thái sung mãn nhất của pha log, việc bổ sung IPTG nồng độ 0,8 mM sẽ kích hoạt tối đa promoter T7 mà không gây độc tế bào hoặc làm hình thành quá mức thể vùi không tan.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa sinh động thông qua biểu đồ đường cong sinh trưởng dạng tuyến tính theo thời gian từ 2 đến 28 giờ và bảng so sánh mật độ quang giữa 5 hệ môi trường nuôi cấy. Hình ảnh bản gel điện di SDS-PAGE 15% nhuộm Coomassie Blue đối chứng giữa mẫu trước và sau cảm ứng IPTG là minh chứng rõ ràng nhất khẳng định sự hiện diện độc bản của phân tử protein 9 kDa.

So sánh với các công bố quốc tế của các nhóm nghiên cứu trước đây về kích thước tự nhiên của STb hoàn chỉnh là 5,1 kDa (48 axit amin), việc sản phẩm tái tổ hợp đạt khối lượng phân tử khoảng 9 kDa là hoàn toàn phù hợp. Khối lượng tăng thêm này phản ánh chính xác sự hiện diện của đoạn peptide dung hợp đầu N chứa đuôi 6xHis-tag cùng các vị trí nhận diện cắt enzyme của vector pET200/D. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu biểu hiện protein kháng nguyên thú y trên thế giới, khẳng định tính đúng đắn và độ tin cậy tuyệt đối của quy trình công nghệ được thiết lập.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm đã đạt được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị hành động cụ thể:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình lên men sinh khối ở quy mô bán công nghiệp. Doanh nghiệp sản xuất vắc-xin và các viện nghiên cứu cần ứng dụng ngay công thức môi trường YJ với tỷ lệ tiếp giống 2% và chế độ lắc 220 vòng/phút vào các nồi lên men sinh học dung tích 10 đến 50 lít. Target metric hướng đến là nâng mật độ tế bào lên ngưỡng OD600 từ 8,0 đến 12,0, rút ngắn thời gian mẻ nuôi xuống dưới 10 giờ, thực hiện trong lộ trình 6 đến 12 tháng tới.

Thứ hai, tối ưu hóa công nghệ tinh sạch protein dung hợp quy mô lớn. Phòng thí nghiệm Miễn dịch học và Vắc-xin phối hợp với các đơn vị chuyển giao công nghệ triển khai hệ thống sắc ký cột ái lực Ni-NTA tự động FPLC. Mục tiêu đạt độ tinh sạch protein kháng nguyên STb trên 95%, tỷ lệ thu hồi hoạt tính sinh học đạt trên 80% với chi phí tinh chế giảm 25% so với quy trình tách chiết thủ công, hoàn thành trong giai đoạn 12 tháng.

Thứ ba, đánh giá đáp ứng miễn dịch và hiệu lực bảo hộ trên động vật thí nghiệm. Cơ quan thú y vùng phối hợp cùng các viện nghiên cứu tiến hành thử nghiệm độc tính và khả năng sinh kháng thể đặc hiệu của protein tái tổ hợp STb trên chuột bạch và lợn con theo mẹ. Target metric xác định là tỷ lệ bảo hộ chống lại độc lực E. coli thực địa đạt trên 85%, giảm tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn con từ 60% xuống dưới 15% và giảm tỷ lệ tử vong xuống dưới 5%, thực hiện trong timeline 12 đến 24 tháng.

Thứ tư, nghiên cứu phối hợp đa kháng nguyên để phát triển vắc-xin thế hệ mới. Các nhà khoa học thú y cần tiếp tục tích hợp gene estB với các gene mã hóa kháng nguyên lông bám F4 (K88), F5 (K99) và độc tố LT để tạo ra chế phẩm vắc-xin tái tổ hợp đa giá hoặc kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) đa năng. Mục tiêu tạo ra sản phẩm thương mại phòng bệnh toàn diện cho đàn lợn trước năm 2028 do các công ty dược thú y chủ trì thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu chuyên khảo giá trị cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm sau:

1. Các nhà nghiên cứu và chuyên viên công nghệ sinh học nông nghiệp: Nắm vững quy trình chi tiết về tạo dòng, thiết kế vector định hướng pET200/D-TOPO và kỹ thuật tinh sạch protein qua đuôi His-tag. Use case điển hình là ứng dụng quy trình này để biểu hiện các loại kháng nguyên tái tổ hợp khác của vi khuẩn đường ruột với hiệu suất cao.

2. Doanh nghiệp sản xuất vắc-xin và dược phẩm thú y: Tiếp cận các thông số kỹ thuật tối ưu về môi trường nuôi cấy YJ, nồng độ IPTG 0,8 mM và thời gian thu hoạch sinh khối nhằm phát triển sản phẩm vắc-xin vô hoạt tái tổ hợp phòng tiêu chảy lợn con. Use case là chuyển giao công nghệ sản xuất quy mô công nghiệp giúp giảm 20% đến 30% giá thành so với nhập khẩu sinh phẩm ngoại.

3. Bác sĩ thú y, kỹ sư chăn nuôi và chủ trang trại quy mô lớn: Cập nhật kiến thức chuyên sâu về cơ chế phân tử của độc tố STb và các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli. Use case thực tế là xây dựng phác đồ quản lý dịch bệnh an toàn sinh học, giảm thiểu việc lạm dụng kháng sinh trị tiêu chảy và nâng tỷ lệ nuôi sống đàn lợn con sau cai sữa thêm 10% đến 15%.

4. Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Thú y / Vi sinh vật học: Sử dụng luận văn như một công trình mẫu mực về phương pháp luận nghiên cứu sinh học phân tử, từ khâu thiết kế mồi, PCR, phân tích tin sinh học với BioEdit/NCBI đến bố trí thí nghiệm tối ưu hóa ANOVA bằng phần mềm SAS.

Câu hỏi thường gặp

Gene estB phân lập từ thực địa có kích thước bao nhiêu nucleotide và độ tương đồng thế nào?

Đoạn gene estB mã hóa độc tố STb phân lập trong nghiên cứu có chiều dài chính xác 216 nucleotide (tính cả bộ ba mở đầu và kết thúc). Khi giải trình tự và so sánh đối chiếu bằng phần mềm BioEdit, trình tự này đạt mức tương đồng 100% với trình tự gene estB chuẩn công bố trên ngân hàng gene NCBI mang mã số AY028790.

Tại sao protein tái tổ hợp 6xHis-STb lại có kích thước 9 kDa trong khi STb tự nhiên chỉ nặng 5,1 kDa?

Kháng nguyên STb tự nhiên hoàn chỉnh gồm 48 axit amin với khối lượng phân tử khoảng 5,1 kDa. Khi được biểu hiện trong hệ thống vector pET200/D-TOPO, protein mục tiêu được gắn thêm đoạn peptide dung hợp ở đầu N chứa 6 gốc Histidine (His-tag) cùng các vị trí nhận diện cắt liên kết, khiến tổng khối lượng phân tử đạt khoảng 9 kDa trên bản gel điện di SDS-PAGE 15%.

Môi trường nào thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang gene estB?

Trong 5 môi trường khảo sát (LB, SOB, SOC, TB và YJ), môi trường YJ đem lại hiệu quả vượt trội nhất với mật độ quang OD600 đạt 2,853 sau 9 giờ nuôi cấy. Môi trường YJ chứa 2% glycerol kết hợp cùng dịch chiết nấm men 2% và tryptone 1,5% cung cấp dinh dưỡng tối ưu và ổn định pH cho tế bào phát triển.

Nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời điểm bổ sung nào mang lại hiệu suất biểu hiện protein cao nhất?

Nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu nằm trong khoảng 0,8 mM đến 1,0 mM. Thời điểm thích hợp nhất để bổ sung IPTG vào dịch nuôi cấy là khi mật độ tế bào đạt pha log với giá trị đo quang OD600 = 0,6 đến 0,8, tiếp tục nuôi cảm ứng trong 10 giờ ở 30°C đến 37°C.

Tỷ lệ tiếp giống ban đầu bao nhiêu phần trăm là tối ưu cho quá trình nhân sinh khối tế bào?

Khảo sát các tỷ lệ tiếp giống từ 0,1% đến 5% cho thấy tỷ lệ tiếp giống 2% (v/v) với giống đã hoạt hóa sau 8 giờ cho mật độ tế bào cao nhất đạt OD600 = 2,807. Tỷ lệ này tạo sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với các mức tiếp giống khác, đảm bảo rút ngắn pha lag và tối đa hóa sinh khối.

Kết luận

1. Phân lập thành công gene estB kích thước 216 bp từ vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở lợn con, đạt độ tương đồng 100% với trình tự chuẩn trên GenBank (AY028790).
2. Xây dựng thành công dòng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21 (DE3) mang vector pET200/D-TOPO/estB, biểu hiện ổn định protein dung hợp 6xHis-STb kích thước 9 kDa.
3. Tinh sạch thành công protein tái tổ hợp mục tiêu qua hệ thống sắc ký ái lực kim loại Ni2+ với độ đặc hiệu cao, xác nhận khả năng liên kết hoàn hảo của đuôi 6xHis.
4. Xác lập bộ thông số tối ưu nuôi cấy: môi trường YJ, tỷ lệ tiếp giống 2%, tốc độ lắc 220 vòng/phút, cảm ứng bằng IPTG 0,8 mM tại OD600 = 0,6 trong 10 giờ ở 37°C.
5. Đóng góp nguồn nguyên liệu kháng nguyên sinh học sạch và quy chuẩn, tạo bước đột phá trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin và kháng thể phòng trị bệnh tiêu chảy cho ngành chăn nuôi lợn.

Trong lộ trình 6 đến 12 tháng tới, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung thử nghiệm hoạt tính sinh học và khả năng bảo hộ miễn dịch của kháng nguyên STb trên mô hình động vật thực tế, đồng thời nâng quy mô lên men lên 50 lít. Hãy liên hệ với các trung tâm nghiên cứu thú y và cơ sở công nghệ sinh học uy tín để cùng hợp tác chuyển giao, ứng dụng các thành tựu khoa học tiên tiến này vào thực tiễn chăn nuôi ngay hôm nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây ra ở lợn 1.

Nghiên cứu trong nước Ở nước ta, bệnh do E. coli gây ra đã xuất hiện từ lâu và cho đến nay bệnh ngày càng trở nên phổ biến, rộng khắp ở hầu hết các cơ sở chăn nuôi. Tìm hiểu về bệnh do E. coli gây ra đã có nhiều nhà khoa học thú y quan tâm nghiên cứu.

Theo Hoàng Văn Tuấn, Lê Văn Tạo và Trần Thị Hạnh (1998) điều tra tình hình bệnh tiêu chảy ở lợn con trong một trại lợn giống hướng nạc trong ba năm 1995, 1996, 1997, kết quả cho thấy tỷ lệ hao hụt do dịch bệnh ở lợn con theo mẹ (dưới 45 ngày tuổi) qua các năm là 25%, 12% và 15%. Trong đó tỷ lệ chết do tiêu chảy chiếm 67% và 80% trong số lợn con chết (Hoàng Văn Tuấn và cs, 1998). Trong khi, Đào Trọng Đạt và cs, (1996) cho biết bệnh phân trắng thường gặp ở lợn con mới sinh, giai đoạn từ 1 - 20 ngày tuổi với tỷ lệ mắc bệnh cao nhất có thể lên tới 100%. Đối với các hộ nông dân chăn nuôi lợn nái có tỷ lệ mắc bệnh khá cao 31,3 - 66%.

Ngoài ra, nhóm tác giả này cho biết thêm “khoảng 48% các trường hợp bị bệnh tiêu chảy ở lợn con là do vi khuẩn E. coli gây ra. Vì vậy bệnh do vi khuẩn E. coli gây ra có vị trí đặc biệt trong các bệnh nhiễm khuẩn ở lợn con” (Đào Trọng Đạt và cs, (1996).

Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Kình và cộng sự (1996) cho biết tỷ lệ mắc bệnh phân trắng ở lợn con cao khoảng 60 - 70% có khi lên tới 100% nhưng tỷ lệ chết không cao khoảng 15 - 18% (Nguyễn Văn Kình và cs,1996). Khả năng điều trị bệnh phân trắng lợn con rất khó nên việc phòng bệnh là rất quan trọng. Nguyễn Thị Nội (1984) đã dựa trên kết quả xác định tần suất của các serotype có tần suất cao dùng để chế tạo vacxin E. coli vô hoạt có chất bổ trợ keo phèn trên hai lần, cho lợn mẹ có chửa để phòng bệnh phân trắng lợn con.

Kết quả đã làm giảm tỷ lệ lợn con mắc bệnh từ 73% xuống còn 27,3% (Nguyễn Thị Nội, 1984). Đến năm 1993, Nguyễn Thị Nội và cộng sự đã dựa vào kết quả phân lập các vi khuẩn đã chế tạo ra một loại vacxin có tên “Salsco” gồm E. coli, Salmonella, Streptococcus để phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con. Vacxin Salsco tiêm cho lợn con từ 21 ngày tuổi liều 3 – 5 mL/con, 2 lần cách nhau 10 ngày (Nguyễn Thị Nội và cs, 1993).

Kết quả vacxin này làm giảm tỷ lệ lợn con bị tiêu chảy từ 30-50% và giảm tỷ lệ chết của lợn con do tiêu chảy từ 10 - 20%. Liên quan đến vacxin, nhóm tác giả Lê Văn Tạo và cộng sự (1993) dựa trên cơ sở xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập từ bệnh phẩm lợn con chết do ỉa chảy phân trắng đã chọn các giống vi khuẩn điển hình để chế vacxin chết ở dạng Bacterin cho uống. Vacxin sau khi đẻ 2 giờ uống liều 1 mL, liên PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 5 tục 3 - 5 ngày làm giảm tỷ lệ lợn con bị phân trắng từ 30 - 35% so với lô đối chứng (Lê Văn Tạo và cs, 1993).

Từ trước đến nay, hiện tượng kháng thuốc xẩy ra ngày càng phổ biến, gây nhiều khó khăn cho ngành chăn nuôi. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đã có nhiều nghiên cứu được công bố. Theo Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu (1995) nghiên cứu theo dõi tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con phân trắng đã có kết luận rằng: Số chủng E.

coli kháng thuốc từ năm 1978 - 1988 tăng khá nhanh, nhất là với các loại kháng sinh chloramphenicol, tetracylin. Các tác giả cũng đã khuyến cáo nếu sử dụng thuốc kháng sinh như một chất kích thích tăng trọng cần phải được kiểm tra nghiêm ngặt sử dụng trong chăn nuôi vì nó đã góp phần không nhỏ vào sự hình thành kháng thuốc và truyền kháng của vi khuẩn E. Một giải pháp thây thế cho việc dùng thuốc trong chăn nuôi đã được tiến hành và có nhiều thử nghiệm. Theo Vũ Đình Hưng và cộng sự (1996) đã sử dụng globulin chiết tách từ máu gia súc để phòng bệnh phân trắng lợn con.

Kết quả thu được: phòng bệnh sinh sản hay tiêm cho lợn mẹ trước khi đẻ 10 - 15 ngày thì tỷ lệ bảo hộ là 67,6% và 81,20%, khả năng chữa trị khỏi bệnh là 83,88% (Vũ Đình Hưng và cs, 1996). Tạ Thị Vịnh và cộng sự, (2002) đã nghiên cứu sử dụng mật lợn để phòng bệnh phân trắng lợn con và kết hợp với kháng sinh để điều trị bệnh. Kết quả cho thấy, lợn thí nghiệm có tăng trọng cao hơn so với lợn đối chứng. Lợn mắc bệnh phân trắng ở lô thí nghiệm hoàn toàn phòng được bệnh trong các hộ gia đình, lợn ở lô đối chứng qua 2 đàn trên đều mắc bệnh, tỷ lệ từ 33,33% - 66,67% (Tạ Thị Vịnh và cs, 2002).

Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình (2002) đã nghiên cứu, thử nghiệm một số chế phẩm sinh học phòng bệnh tiêu chảy phân trắng lợn con do vi khuẩn E. coli và Cl. Các tác giả đã chế tạo ba chế phẩm sinh học gồm E. coli-Sữa, Cl.

perfringens dùng cho nái chửa và Bacterin EBC (E. coli, Bacterin và Cl. perfringens toxoid) dùng cho lợn con để phòng bệnh và xây dựng quy trình gây bệnh cho lợn con ngay từ những ngày đầu (Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình, 2002). Đỗ Trọng Cứ và Nguyễn Quang Tuyên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm EM (Effective Microorganism) phòng bệnh tiêu chảy lợn con trước và sau khi cai sữa.

Kết quả cho thấy tỷ lệ tiêu chảy giảm 20%, tỷ lệ tái phát bệnh giảm so với đối chứng 50%, khả năng tăng trọng cao hơn, các chỉ tiêu sinh lý: máu, hồng cầu, bạch cầu và huyết sắc tố bình thường. Qua kiểm tra tổng số vi khuẩn Salmonella trong 1 g phân giảm đi rõ rệt từ 20,92 triệu vi khuẩn (1 g phân trước khi thí nghiệm) còn 16,99 triệu vi khuẩn (1 g phân sau khi kết thúc thí nghiệm) (Đỗ Trọng Cứ và Nguyễn Quang Tuyên, 2002). Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè (2002) sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng bệnh tiêu chảy của lợn con. Kết quả thu được như sau (Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè, 2002): PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 6 - Dùng chế phẩm VITOM1.1 có tác dụng rất cao đối với giống lợn ngoại, tỷ lệ khỏi bệnh 100% so với lô đối chứng là 80,7%; còn tỷ lệ tái phát khi sử dụng VITOM1.1 chỉ 25% trong khi lô đối chứng là 52,38%.

- Sử dụng cao mật lợn để phòng và trị bệnh đường tiêu hoá cho lợn con. Kết quả cho thấy lô thí nghiệm so với lô đối chứng: tỷ lệ mắc bệnh giảm 5%, lô thí nghiệm không có tái phát 100% trong khi lô đối chứng tái phát 25% và chết 25%. Nó còn kích thích tăng trọng tốt. Sau 3 tuần tuổi các lô thí nghiệm so với lô đối chứng là 0,27 kg tức 13,77%.

Tạ Thị Vịnh và Đặng Khánh Vân (1995) cho rằng E. coli thường trực cả ở cơ thể lợn khoẻ, từ lợn con đến lợn nái. Ở lợn khoẻ có nhiễm vi khuẩn E. coli K88 nhưng số lượng và độc lực chưa đầy đủ để gây bệnh.

Ở lợn mắc chứng tiêu chảy số lượng và tỷ lệ vi khuẩn E. coli K88 tăng gấp bội, điều đó chứng tỏ môi trường trong ruột đã bị thay đổi thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn E. coli nhất là E. Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu (1996) đã tiến hành nghiên cứu theo dõi, kiểm tra một số yếu tố ảnh hưởng đến tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi khuẩn E.

coli phân lập từ bệnh lợn con phân trắng đã cho rằng việc sử dụng thuốc trong phòng, trị bệnh khác nhau đã dẫn đến tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi khuẩn này là khác nhau. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli kháng thuốc cao thì tỷ lệ vi khuẩn E. coli đa kháng cũng cao.

Tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli liên quan đến tuổi lợn bị bệnh (lợn dưới 4 ngày tuổi mắc bệnh có tỷ lệ vi khuẩn E. coli kháng thuốc thấp hơn ở các lứa tuổi trên 4 ngày tuổi), các chủng E. coli có khuẩn lạc dạng R có tính kháng thuốc cao hơn dạng S (Bùi Thị Tho và Phạm Khắc Hiếu, 1996).

Cù Hữu Phú và cộng sự, (2000) đã phân lập vi khuẩn E. coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy xác định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được và đề ra biện pháp điều trị. Tác giả đã phân lập được 60 chủng E. coli trong đó có 42 chủng gây dung huyết trên thạch máu chiếm tỷ lệ 70%, có 6 chủng E.

coli sản sinh ra cả 2 loại độc tố là chịu nhiệt ST và không chịu nhiệt LT, các chủng E. coli mẫn cảm cao nhất với các loại kháng sinh: nitrofurazolidon (85%), neomycine (80), sulfonamid (75%). coli dung huyết và 3 chủng Salmonella có độc lực mạnh trên chuột sản sinh độc tố để sản xuất autovacxin phòng bệnh tiêu chảy, liều tiêm 3 – 5 mL/con đạt tỷ lệ phòng bệnh 89,22% (Cù Hữu Phú và cs, 2000). Lý Thị Liên Khai (2001) đã phân lập và xác định độc tố ruột của các chủng E.

coli gây bệnh tiêu chảy cho lợn con, tác giả cho rằng các chủng K88 sinh độc tố ruột LT và ST; K99 và 987P sinh độc tố ruột ST và độc tố ST trở nên độc khi sức đề kháng của vật chủ giảm, gây tiêu chảy cho lợn con đang bú mẹ, phổ biến ở lợn 1 - 2 tuần tuổi (Lý Thị Liên Khai, 2001). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 7 Nghiên cứu của Đoàn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài (1997) điều trị hội chứng tiêu chảy lợn con theo mẹ, sử dụng becberin liều 0,5 - 0,8/ngày cho uống đạt hiệu quả 68%. Sử dụng Oresol cho uống hoặc tiêm dưới da hạn chế được tiêu chảy hiệu quả đạt trung bình 60%. Phối hợp điều trị becberin và Oresol thêm chất trợ lực B complex hiệu quả đạt 90% (Đoàn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài, 1997).

Để góp phần vào việc giải quyết những thiệt hại của bệnh tiêu chảy cho lợn con, đã có nhiều tác giả nghiên cứu và thu được nhiều thành công ở những khía cạnh khác nhau.