Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam giữ vị trí chủ lực trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho thị trường nội địa và định hướng xuất khẩu. Tuy nhiên, các giống lợn nội địa của Việt Nam dù sở hữu khả năng thích nghi cao và sức đề kháng tốt nhưng lại bộc lộ nhiều hạn chế về mặt năng suất: tốc độ tăng trọng chậm, tiêu tốn thức ăn cao, tầm vóc nhỏ và tỷ lệ nạc thấp. Nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ thịt nạc chất lượng cao, từ những năm 1970, Việt Nam đã nhập khẩu các giống lợn ngoại như Landrace, Yorkshire, Đại Bạch, Hampshire, Duroc và Piétrain để cải tạo đàn giống trong nước. Hiện nay, hai giống thuần Landrace và Yorkshire đóng vai trò là nguồn giống gốc hạt nhân chủ chốt tham gia vào các công thức lai kinh tế tạo đàn lợn nái thương phẩm và thương phẩm vỗ béo.

Song song với việc đánh giá các chỉ tiêu kiểu hình truyền thống, ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống động vật đang là hướng nghiên cứu trọng điểm. Gen RNF4 (Ring finger protein 4) và gen RBP4 (Retinol binding protein 4) đã được nhiều nghiên cứu quốc tế xác định là các gen ứng viên tiềm năng liên quan chặt chẽ đến năng suất sinh sản ở lợn, đặc biệt là các tính trạng số con đẻ ra và số con đẻ ra còn sống trên lứa. Các cá thể lợn nái mang kiểu gen CC đối với gen RNF4 hoặc kiểu gen BB đối với gen RBP4 thường có năng suất sinh sản vượt trội. Mặc dù vậy, theo quy luật sinh học, khi số con sơ sinh trên ổ tăng lên thì khối lượng sơ sinh trung bình của từng cá thể có xu hướng giảm, mà khối lượng sơ sinh lại là yếu tố quyết định trực tiếp đến sức sinh trưởng và tuổi thọ kinh tế của lợn ở giai đoạn sau. Do đó, việc xác định xem các alen và kiểu gen có lợi cho sinh sản của RNF4 và RBP4 có gây ảnh hưởng bất lợi hoặc tương tác như thế nào đến khả năng sinh trưởng và chất lượng thân thịt là yêu cầu bắt buộc trước khi đưa vào chương trình chọn lọc giống dựa trên chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection - MAS). Tại thời điểm thực hiện đề tài, ở Việt Nam chưa có công trình nào công bố chi tiết về ảnh hưởng của hai gen này đến sinh trưởng và năng suất thịt trên hai giống Landrace và Yorkshire.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể gồm 4 nhiệm vụ:

  1. Xác định đa hình gen RNF4 trên quần thể lợn Landrace và Yorkshire.
  2. Xác định đa hình gen RBP4 trên quần thể lợn Landrace và Yorkshire.
  3. Đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen RNF4 đến sinh trưởng và năng suất thịt của lợn Landrace và Yorkshire.
  4. Đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen RBP4 đến sinh trưởng và năng suất thịt của lợn Landrace và Yorkshire.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Tổng số 284 lợn cái hậu bị, bao gồm 146 cá thể lợn Landrace và 138 cá thể lợn Yorkshire.
  • Phạm vi không gian: Thí nghiệm nuôi dưỡng, chăm sóc và theo dõi kiểu hình được tiến hành tại Công ty TNHH Lợn giống hạt nhân Dabaco (thôn Từ Vi, xã Tân Chi, huyện Tiên Du, tỉnh Bắc Ninh). Các phân tích sinh học phân tử được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền giống vật nuôi, Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Theo dõi sinh trưởng và năng suất thịt trong giai đoạn từ tháng 02/2017 đến tháng 06/2017, tương ứng từ giai đoạn lợn đạt 30–40 kg (70–90 ngày tuổi) đến khi kết thúc kiểm tra ở mức 80–90 kg (130–160 ngày tuổi).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết sinh trưởng vật nuôi và nguyên lý di truyền phân tử động vật:

  • Cơ sở lý thuyết về sinh trưởng: Sinh trưởng của lợn biểu thị bằng sự tăng khối lượng, kích thước và thể tích tế bào, mô, cơ quan dưới sự kiểm soát của hormone sinh trưởng (Somatotropin). Quá trình tích lũy tuân theo đường cong sinh trưởng hình chữ S và hàm tăng trọng tuyệt đối có dạng parabol. Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm sinh trưởng tích lũy, sinh trưởng tuyệt đối, sinh trưởng tương đối, tăng khối lượng bình quân ngày (ADG), độ dày mỡ lưng và độ dày cơ thăn.
  • Gen ứng viên nghiên cứu:
    • Gen RNF4 định vị trên nhiễm sắc thể số 8 của lợn, nghiên cứu khảo sát đột biến điểm tại vị trí DQ208408:g 358T>C thuộc Intron 5.
    • Gen RBP4 định vị trên nhiễm sắc thể số 14, khảo sát vùng Exon 2 và Exon 4 liên quan đến vận chuyển retinol và hình thành phôi thai.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và thu thập dữ liệu:

  • Phương pháp sinh học phân tử:
    • Lấy mẫu mô đuôi lợn con sau khi bấm số tai, bảo quản tại -20°C.
    • Tách chiết ADN tổng số bằng bộ Kit QIAamp ADN FFPE TISSUE (QIAGEN). Kiểm tra độ sạch và nồng độ ADN qua điện di gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước sóng A260/A280 (chuẩn đạt tỷ lệ 1,8–2,2, nồng độ pha loãng 50 ng/µl).
    • Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu với cặp mồi đặc hiệu:
      • RNF4: Mồi xuôi (F) 5’-CGAAATGCCAGGGAAGAG-3’ và mồi ngược (R) 5’-CCATGCAGATCGGACAACT-3’ (kích thước sản phẩm 937 bp).
      • RBP4: Mồi xuôi (F) 5’-GAGCAAGATGGAATGGGTT-3’ và mồi ngược (R) 5’-CTCGGTGTCTGTAAAGGTG-3’ (kích thước sản phẩm 550 bp).
    • Kỹ thuật PCR-RFLP: Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn đặc hiệu SacII đối với gen RNF4 và enzyme MspI đối với gen RBP4 ở 37°C trong 1–2 giờ. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 2,5%, nhuộm Red Safe và đọc kết quả dưới ánh sáng tia cực tím trên hệ thống buồng đọc IGenius3.
  • Phương pháp đánh giá kiểu hình sinh trưởng và năng suất thịt:
    • Khối lượng bắt đầu kiểm tra (KLBD) và khối lượng kết thúc kiểm tra (KLKT) được cân trực tiếp trên từng cá thể bằng cân đồng hồ.
    • Tăng khối lượng bình quân ngày (ADG) tính theo công thức: $$\text{ADG (g/ngày)} = \frac{\text{KLKT} - \text{KLBD}}{\text{Số ngày nuôi}} \times 1000$$
    • Đo độ dày mỡ lưng ($X_1$, mm) và độ dày cơ thăn ($X_2$, mm) trên lợn sống bằng máy siêu âm Agroscan AL với đầu dò ALAL350 (ECM, Pháp) tại vị trí xương sườn 3–4 cuối, cách đường sống lưng 6 cm.
    • Ước tính tỷ lệ nạc ($Y$, %) theo phương trình hồi quy của Bộ Nông nghiệp Bỉ (1998): $$Y = 59{,}902386 - 1{,}060750 \times X_1 + 0{,}229324 \times X_2$$

Phương pháp xử lý thống kê:

  • Tần số alen và tần số kiểu gen được tính toán bằng Microsoft Excel 2010 và kiểm định cân bằng di truyền Hardy-Weinberg bằng phép thử Khi bình phương ($\chi^2$).
  • Phân tích phương sai và so sánh giá trị trung bình bình phương nhỏ nhất (LSM) cùng sai số tiêu chuẩn (SE) bằng mô hình tuyến tính tổng quát (GLM) trong phần mềm SAS 9.0: $$Y_{ijklm} = \mu + b \times t_{ijk} + \text{RNF4}i + \text{RBP4}j + e{ijk}$$ Trong đó: $Y{ijklm}$ là giá trị quan sát của tính trạng; $\mu$ là giá trị trung bình quần thể; $t_{ijk}$ là biến hiệp phương sai về tuổi lợn (đối với KLBD) hoặc KLBD (đối với KLKT, ADG và năng suất thịt); $b$ là hệ số hồi quy tuyến tính; $\text{RNF4}_i$ là ảnh hưởng của kiểu gen RNF4 (TT, TC, CC); $\text{RBP4}j$ là ảnh hưởng của kiểu gen RBP4 (AA, AB, BB); $e{ijk}$ là sai số ngẫu nhiên. So sánh cặp LSM thực hiện bằng phép kiểm định Tukey.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các tư liệu nghiên cứu trong và ngoài nước về đặc điểm sinh học, di truyền và điều kiện chăn nuôi liên quan đến đề tài:

  • Giống lợn Landrace và Yorkshire: Trình bày nguồn gốc xuất xứ (Landrace tạo từ Đan Mạch, Yorkshire từ Anh), đặc điểm ngoại hình, khả năng sinh trưởng và năng suất sinh sản. Landrace có thân hình dài, tai cụp che mắt, tỷ lệ nạc 58–60%, ADG đạt 700–800 g/ngày, tiêu tốn thức ăn 2,7–3,01 kg/kg tăng trọng. Yorkshire có tai đứng, thân hình vững chắc, tỷ lệ nạc 52–55%, tăng trọng nhanh, mắn đẻ (11–13 con/lứa).
  • Cơ sở khoa học của sinh trưởng: Phân tích cơ chế tác động của hormone Somatotropin, biến đổi thành phần hóa học của cơ thể theo tuổi, các công thức tính sinh trưởng tích lũy, tuyệt đối, tương đối, cùng hệ số di truyền của các tính trạng vỗ béo ($h^2$ của tăng trọng từ 0,3–0,6; độ dày mỡ lưng từ 0,5–0,7).
  • Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng: Phân tích ảnh hưởng của di truyền (giống, ưu thế lai, các gen Halothane, IGF2, RNF4, RBP4), dinh dưỡng (năng lượng, protein, axit amin giới hạn Lysin, khoáng chất Ca, P, Cu, Zn, vitamin A, D, E), tính biệt (lợn đực thiến tăng trọng cao hơn lợn cái nhưng mỡ lưng dày hơn), tiểu khí hậu chuồng nuôi (nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ gió), thời gian nuôi và mùa vụ.
  • Tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế: Tổng kết các công trình chọn giống theo tháp giống hạt nhân, ứng dụng marker phân tử trên thế giới (Mỹ, Đan Mạch, Đức, Canada...) và thực tiễn cải tạo giống, "nạc hóa" đàn lợn tại Việt Nam.
  • Giới thiệu cơ sở nghiên cứu Dabaco: Nêu quy mô trang trại hạt nhân 1.200 nái tại Tân Chi - Tiên Du, quy trình an toàn sinh học 3 cổng nghiêm ngặt, hệ thống chuồng kín làm mát tự động, lịch vaccine phòng bệnh toàn đàn (PRRS, Dịch tả, LMLM, Glasser, Circo, APP...) và quy trình dinh dưỡng chuyển đổi cám theo giai đoạn (DB4000A, DB4000B, DB962).

Chương 2: Đối tượng – Nội dung và Phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ thiết kế thực nghiệm, quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm và phương pháp thu thập chỉ tiêu:

  • Đối tượng: 284 lợn cái hậu bị (146 Landrace, 138 Yorkshire) được nuôi giữ tại trại Dabaco.
  • Quy trình tách chiết ADN 10 bước qua cột silica (cột SV) sử dụng proteinase K phá màng tế bào, các dung dịch đệm Buffer TL, TB, BW, TW, AE.
  • Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho gen RNF4 (biến tính 94°C 4 phút; 35 chu kỳ gồm 94°C 45 giây, 53°C 45 giây, 72°C 2 phút; kéo dài cuối 72°C 10 phút) và gen RBP4 (biến tính 95°C 3 phút; 35 chu kỳ gồm 95°C 30 giây, 56°C 45 giây, 72°C 45 giây; kéo dài cuối 72°C 5 phút).
  • Quy trình cắt enzyme giới hạn PCR-RFLP với SacII và MspI, cách nhận diện các băng điện di đặc trưng cho từng kiểu gen.
  • Phương pháp đo đạc kiểu hình bằng cân cơ học, đo siêu âm thời gian thực bằng máy Agroscan AL và giải thuật thống kê GLM của phần mềm SAS.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các phát hiện thực nghiệm về đa hình phân tử và phân tích tương quan kiểu gen – kiểu hình:

  • Kết quả nhân ADN đặc hiệu: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy các đoạn khuếch đại đơn băng, rõ nét, kích thước chính xác 937 bp đối với gen RNF4 và 550 bp đối với gen RBP4, hoàn toàn phù hợp với công bố của Niu et al. (2009) và Rothschild et al. (2000).
  • Kết quả phân tích đa hình gen qua PCR-RFLP:
    • Đối với gen RNF4 cắt bằng enzyme SacII: Xác định được 3 kiểu gen trên gel agarose 2,5% gồm kiểu gen đồng hợp tử CC (2 băng: 545 bp và 392 bp), dị hợp tử TC (3 băng: 937 bp, 545 bp và 392 bp), đồng hợp tử TT (1 băng duy nhất: 937 bp).
    • Đối với gen RBP4 cắt bằng enzyme MspI: Xác định các kiểu gen AA, AB và BB.
  • Tần số kiểu gen và alen: Khảo sát sự phân bố tần số alen C, T (RNF4) và alen A, B (RBP4) trên hai quần thể Landrace và Yorkshire.
  • Ảnh hưởng của đa hình gen RNF4 và RBP4 đến các tính trạng sinh trưởng và năng suất thịt:
    • Phân tích sự khác biệt về khối lượng bắt đầu kiểm tra, khối lượng kết thúc kiểm tra, tăng trọng bình quân ngày (ADG) giữa các nhóm kiểu gen trên từng giống lợn.
    • Đánh giá mức độ sai khác về độ dày mỡ lưng, độ dày cơ thăn và tỷ lệ nạc ước tính giữa các nhóm mang kiểu gen đồng hợp và dị hợp của hai locus gen.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả kỹ thuật và số liệu thực nghiệm cụ thể sau:

Chỉ tiêu / Thông số Gen RNF4 Gen RBP4
Vị trí nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể số 8 (Intron 5, DQ208408:g 358T>C) Nhiễm sắc thể số 14 (Exon 2 và Exon 4)
Kích thước sản phẩm PCR 937 bp 550 bp
Enzyme cắt giới hạn SacII MspI
Các kiểu gen phát hiện CC (545 bp, 392 bp), TC (937 bp, 545 bp, 392 bp), TT (937 bp) AA, AB, BB
Nhiệt độ gắn mồi PCR 53°C 56°C

Đóng góp khoa học và thực tiễn của đề tài:

  • Đóng góp khoa học: Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam cung cấp dẫn liệu đầy đủ về đa hình phân tử của hai gen ứng viên sinh sản (RNF4 và RBP4) gắn với các chỉ tiêu sinh trưởng (ADG, khối lượng kết thúc) và năng suất thân thịt (độ dày mỡ lưng, tỷ lệ nạc siêu âm) trên hai giống lợn ngoại Landrace và Yorkshire thuần chủng nuôi thích nghi tại miền Bắc.
  • Đóng góp thực tiễn: Kết quả xác định mối liên kết kiểu gen làm cơ sở khoa học giúp các nhà chọn giống kiểm chứng tính an toàn sinh học khi chọn lọc ưu tiên kiểu gen sinh sản (CC ở RNF4, BB ở RBP4), hỗ trợ xây dựng quy trình chọn giống kết hợp kiểu hình và chỉ thị phân tử tại các trại hạt nhân.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Dung lượng mẫu còn giới hạn ở mức 284 cá thể và chỉ thực hiện trên đối tượng lợn cái hậu bị, chưa khảo sát trên đàn lợn đực hậu bị và đàn lợn thương phẩm nuôi thịt.
  • Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại một cơ sở chăn nuôi duy nhất (Trại lợn giống hạt nhân Dabaco, Bắc Ninh) trong một giai đoạn mùa vụ nhất định (từ tháng 2 đến tháng 6/2017).
  • Chỉ tiêu năng suất thịt được xác định gián tiếp qua kỹ thuật siêu âm lợn sống và phương trình hồi quy, chưa tiến hành mổ khảo sát thân thịt trực tiếp để đánh giá chi tiết tỷ lệ thịt xẻ, tỷ lệ mỡ giắt và các chỉ tiêu hóa lý của thịt.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng quy mô khảo sát trên đàn lợn đực giống và các tổ hợp lai thương phẩm ($F_1$, lợn nuôi thịt 3 giống) nuôi ở các vùng sinh thái khác nhau.
  • Theo dõi liên tục khả năng sinh sản thực tế qua các lứa đẻ của chính đàn nái hậu bị này để đối chiếu tương quan tổng thể giữa sức sinh trưởng giai đoạn hậu bị và năng suất sinh sản thực tế theo từng kiểu gen RNF4 và RBP4.

Giá trị tham khảo

Đề tài có giá trị tham khảo học thuật và ứng dụng chuyên môn cao:

  • Đối tượng sử dụng: Giảng viên, học viên cao học, sinh viên chuyên ngành Chăn nuôi, Thú y, Di truyền học động vật, Công nghệ sinh học nông nghiệp; các kỹ sư giống và nhà quản lý kỹ thuật tại các trung tâm, công ty chăn nuôi lợn giống thương mại.
  • Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
    • Quy trình chuẩn hóa tách chiết ADN từ mô đuôi và chu trình phản ứng PCR-RFLP đối với hai gen RNF4 và RBP4.
    • Phương pháp ứng dụng siêu âm đo mỡ lưng, cơ thăn và mô hình phương trình hồi quy tuyến tính của Bỉ để ước lượng tỷ lệ nạc trên lợn sống.
    • Mô hình thống kê GLM có hiệu chỉnh biến hiệp phương sai (tuổi, khối lượng bắt đầu) phục vụ phân tích dữ liệu di truyền - số lượng trong chăn nuôi.

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước đoạn gen khuếch đại bằng PCR của gen RNF4 và RBP4 trong nghiên cứu là bao nhiêu?
Sản phẩm khuếch đại ADN từ cặp mồi đặc hiệu cho kích thước chính xác là 937 bp đối với gen RNF4 và 550 bp đối với gen RBP4.

2. Enzyme cắt giới hạn nào được sử dụng để xác định kiểu gen của RNF4 và RBP4, các băng cắt hiển thị như thế nào?
Enzyme SacII được dùng cho gen RNF4 (kiểu gen CC cho 2 băng 545 bp và 392 bp; TC cho 3 băng 937 bp, 545 bp và 392 bp; TT cho 1 băng 937 bp). Enzyme MspI được dùng để cắt sản phẩm PCR của gen RBP4.

3. Tỷ lệ nạc của lợn trong thí nghiệm được tính toán bằng phương pháp nào?
Tỷ lệ nạc ($Y$, %) được ước tính gián tiếp trên lợn sống qua độ dày mỡ lưng ($X_1$, mm) và độ dày cơ thăn ($X_2$, mm) thu thập bằng máy siêu âm Agroscan AL, áp dụng phương trình hồi quy của Bộ Nông nghiệp Bỉ (1998): $Y = 59{,}902386 - 1{,}060750 X_1 + 0{,}229324 X_2$.

4. Đề tài sử dụng mô hình thống kê nào để đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen đến các chỉ tiêu sinh trưởng và thân thịt?
Nghiên cứu sử dụng mô hình tuyến tính tổng quát (GLM) trong phần mềm SAS 9.0 với phương trình: $Y_{ijklm} = \mu + b \times t_{ijk} + \text{RNF4}_i + \text{RBP4}j + e{ijk}$, sử dụng ngày tuổi hoặc khối lượng bắt đầu làm biến hiệp phương sai và so sánh cặp LSM bằng phép thử Tukey.

5. Thí nghiệm thực hiện trên bao nhiêu cá thể lợn và ở giai đoạn khối lượng nào?
Nghiên cứu tiến hành trên tổng số 284 lợn cái hậu bị (146 Landrace và 138 Yorkshire) tại Trại lợn giống hạt nhân Dabaco, theo dõi từ khối lượng 30–40 kg (70–90 ngày tuổi) đến 80–90 kg (130–160 ngày tuổi).

Kết luận

Khóa luận của tác giả Vũ Thị Hạnh đã xác định thành công đa hình di truyền của hai gen ứng viên RNF4 và RBP4 bằng kỹ thuật PCR-RFLP trên quần thể 284 lợn cái hậu bị Landrace và Yorkshire tại Công ty TNHH Lợn giống hạt nhân Dabaco. Đề tài đã làm rõ sự phân bố tần số kiểu gen, tần số alen cũng như tác động của từng kiểu gen đến tốc độ sinh trưởng (ADG) và các chỉ tiêu năng suất thân thịt (độ dày mỡ lưng, tỷ lệ nạc siêu âm). Đây là công trình thực nghiệm có giá trị khoa học và thực tiễn, cung cấp luận cứ quan trọng phục vụ công tác chọn lọc và nhân giống lợn dựa trên chỉ thị phân tử tại Việt Nam.