Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong nghiên cứu hóa sinh học các hợp chất thiên nhiên, chi nấm Pestalotiopsis sp. (thuộc họ Amphisphaeriaceae) thu hút sự quan tâm lớn của các nhà khoa học trên thế giới nhờ khả năng sản sinh nguồn chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng và có giá trị ứng dụng cao. Vi nấm thuộc chi này có khả năng sinh trưởng hoại sinh hoặc nội sinh trên nhiều giá thể thực vật bậc thấp (như địa y, nấm lỗ, san hô biển) lẫn thực vật bậc cao. Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy thành phần hóa học của nấm biến đổi linh hoạt tùy thuộc vào môi trường sống và loài cây chủ: nấm trên thực vật bậc thấp thường tạo ra các alkaloid, sesquiterpene hoặc dẫn xuất acid đặc thù; trong khi nấm nội sinh trên thực vật bậc cao (đặc biệt là thảm thực vật rừng ngập mặn) chủ yếu sinh tổng hợp các hợp chất thuộc khung polyketide như chromone, coumarin, cytosporone, lactone và peptide. Nhiều chất trong số đó thể hiện hoạt tính kháng nấm gây bệnh cây trồng, kháng khuẩn, ức chế virus HIV-1 và gây độc trên các dòng tế bào ung thư ở người.
Tại Việt Nam, nguồn vi nấm nội sinh sống trên các loài cây ngập mặn là đối tượng nghiên cứu tiềm năng nhưng chưa được khai thác toàn diện. Xuất phát từ thực tiễn đó, khóa luận thực hiện các nhiệm vụ nghiên cứu sau:
- Điều chế cao chiết ethanol thô từ nguồn sinh khối nấm Pestalotiopsis nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Phân lập và tinh chế các hợp chất hữu cơ bằng các phương pháp sắc ký cột cổ điển và sắc ký lớp mỏng điều chế.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được thông qua các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR) kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo.
- Đối tượng nghiên cứu: Sinh khối vi nấm Pestalotiopsis sp. do ThS. Trần Thị Minh Định (Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh) phân lập từ loài cây Trang (Kandelia candel (L.) Druce) thu hái tại vùng rừng ngập mặn Cần Giờ và tiến hành nuôi cấy nhân sinh khối trong phòng thí nghiệm.
- Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát thành phần hóa học trên 500,0 g sinh khối nấm; tập trung tách chiết và làm sáng tỏ cấu trúc phân tử trên hai phân đoạn cao Et3 và W1; các phân tích phổ nghiệm NMR được thực hiện tại Thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 5 năm 2016.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên từ vi sinh vật, tập trung vào các nhóm chuyển hóa thứ cấp đặc trưng của chi Pestalotiopsis như polyketide, chromone, dẫn xuất dihydropyrimidinone và các base pyrimidine.
Quy trình nghiên cứu thực nghiệm sử dụng các phương pháp và phương tiện kỹ thuật sau:
- Phương pháp chiết xuất: Sử dụng phương pháp ngâm dầm sinh khối nấm trong dung môi ethanol (EtOH) ở nhiệt độ phòng. Dịch ngâm được lọc và gom lại, sau đó cô hồi lưu thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không Buchi-111 kết hợp bể điều nhiệt Buchi 461 Water Bath để tạo cao ethanol thô.
- Phương pháp phân tách phân đoạn: Cao thô được phân tách bước đầu dựa trên độ tan trong hệ dung môi EtOH : $\text{H}_2\text{O}$ (tỉ lệ thể tích 9 : 1), chia thành phần tan trong dung dịch (ký hiệu DE) và phần tủa không tan trong dung dịch cồn-nước nhưng tan hoàn toàn trong nước (ký hiệu TE).
- Phương pháp sắc ký phân lập:
- Sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC): Sử dụng pha tĩnh là silica gel chuyên dụng cỡ hạt 0,06 mm (70–230 mesh, xuất xứ Ấn Độ). Hệ dung môi rửa giải pha động gồm: hệ A (Hexan : Ethyl Acetate : Acetone : Methanol : Acetic Acid với tỉ lệ 40 : 6 : 2 : 1 : 1) dùng cho phân đoạn DE; hệ B (Ethyl Acetate : Acetone : Methanol : Acetic Acid với tỉ lệ 3 : 1 : 1 : 0,5) dùng cho phân đoạn TE.
- Sắc ký lớp mỏng điều chế (preparative Thin-Layer Chromatography - pTLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn nhôm silica gel 60 $\text{F}_{254}$ kích thước $20 \times 20\text{ cm}$ (hãng Merck) để tinh chế phân đoạn làm giàu thành hợp chất đơn chất.
- Hóa chất dung môi: Hexan, ethyl acetate (EA), acetic acid (AcOH), acetone (Ac), ethanol (EtOH), methanol (Me) đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết của hãng Chemsol (Việt Nam).
- Phương pháp phát hiện vết sắc ký: Soi dưới đèn tử ngoại UV ở bước sóng 254 nm kết hợp phun thuốc thử hiện màu vanillin/$\text{H}_2\text{SO}_4$ và sấy nhiệt.
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm phổ 1 chiều ($^1\text{H}$-NMR đo ở tần số 500 MHz, $^{13}\text{C}$-NMR đo ở tần số 125 MHz và 100 MHz) cùng phổ 2 chiều (HSQC, HMBC) được đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker tại Phòng Phân Tích Trung Tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP.HCM. Dung môi sử dụng để hòa tan mẫu đo phổ là DMSO-$d_6$. Cấu trúc phân tử được biện luận kết hợp so sánh trực tiếp với các số liệu phổ chuẩn và góc quay cực $[\alpha]_D$ trong tài liệu quốc tế.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi nấm Pestalotiopsis sp. trong khoảng 10 năm (giai đoạn 2005–2015). Nội dung phân loại các hợp chất đã cô lập theo từng nhóm cây chủ và môi trường sinh thái:
- Nấm trên cây chưa xác định loài tại Trung Quốc: Cô lập các hợp chất pestalachloride A–C (từ P. adusta), pestaloficiol A–E và pestalofone A–E (từ P. fici). Các chất này thể hiện hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật (Fusarium culmorum, Gibberella zeae), kháng Aspergillus fumigatus và ức chế sự nhân lên của virus HIV-1 trên dòng tế bào C8166.
- Nấm trên cây đặc hữu và cây thuốc: Hợp chất pestalactam A–C từ Pestalotiopsis sp. trên cây Melaleuca quinquenervia (Úc) có khả năng ức chế ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và gây độc tế bào ung thư dòng MCF-7, NFF; dẫn xuất anthraquinone guepinone cùng isosulochrin từ P. guepinii trên cây Virola michelii (Brazil) có khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus.
- Nấm trên thực vật rừng ngập mặn:
- Cây Đưng (Rhizophora mucronata): Cô lập nhóm pestalotiopyrone A–H, pestalotiopisorin A, pestalotiollides A–B, amide pestalotiopamide A–D, nigrosporapyrone D và nhóm chromone pestalotiopsone A–F.
- Cây Sấu (Dracontomelon duperreanum): Cô lập virgatolide A–C có hoạt tính gây độc tế bào ung thư HeLa với giá trị $\text{IC}_{50}$ đạt 19,6 µM.
- Cây Bần chua (Sonneratica caseolaris): Phân lập các hợp chất pestalotiopyrone I–L, prenyl depside, methylcoumarin, endocrocin, cytosporin D và F–K.
- Cây Trang (Kandelia candel): Phân lập pestalamine A (gây độc tế bào MCF-7, HeLa, HepG2), vaccinol A–I và vaccinal A (có hoạt tính kháng enzyme COX-2 và ức chế virus đường ruột EV71).
- Cây Sú biển (Aegiceras corniculatum): Phân lập pestalols A–E, trans-harzialactone A, F và $\beta$-hydroxysterol (ức chế mạnh virus cúm $\text{H}_3\text{N}_2$ và $\text{H}_1\text{N}_1$).
- Nấm trên các loài cây khác: Tổng hợp dữ liệu các hợp chất pestalazine A–B, pestalamide A–C, pestaloficiol F–S, chloropestolide B–G (trên cây Trà Camellia sinensis); cytosporin D, pestaloquinol A–B và MP (trên Thông la hán Podocarpus macrophyllus); photinide A–F (trên Cau vua Roystonea regia); dẫn xuất ambuic acid (trên Thông trắng Pinus armandii).
Bên cạnh mô tả 126 công thức cấu trúc, chương 1 tổng hợp các nhóm hoạt tính sinh học chính thông qua các bảng thống kê:
| Nhóm hoạt tính | Các hợp chất tiêu biểu | Đối tượng vi sinh vật / Tế bào đích |
|---|---|---|
| Kháng khuẩn, kháng nấm | Pestalachloride A, B; Pestalazine A; Pestalamide A; Asperazine; Pestalofone A–E; Pestalol B | F. culmorum, G. zeae, Candida albicans, Geotrichum candidum, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans, Vi khuẩn lao |
| Kháng virus | Pestalazine A; Pestalamide A; Asperazine; Pestaloficiol J, A, B, D; Pestalofone A, B, E; Chloropestolide A; Vaccinal A; $\beta$-hydroxysterol | Ức chế virus HIV-1 (tế bào C8166); kháng virus EV71; ức chế virus cúm $\text{H}_3\text{N}_2$, $\text{H}_1\text{N}_1$ |
| Gây độc tế bào ung thư | Pestalactam A–C; Photinide A–F; Pestaloficiol L; Siccayne; Chloropestolide A, B; Pestalotriol A, B; Pestaloquinol B; Cytosporin D; Virgatolide A–C; Pestalamine A; Vaccinal A | Dòng tế bào ung thư vú MCF-7, MDA-MB-231; ung thư cổ tử cung HeLa; ung thư gan HepG2; ung thư biểu mô vòm họng CNE1-LMP1; ung thư hắc tố A375; ung thư ruột kết HT29; ung thư bàng quang T24; dòng tế bào COX-2 |
Chương 2: Thực nghiệm
Chương 2 mô tả chi tiết quy trình tách chiết và phân lập hai hợp chất tinh sạch từ 500,0 g sinh khối nấm Pestalotiopsis:
- Điều chế cao tổng: Sinh khối nấm tươi (500,0 g) ngâm dầm trong dung môi ethanol ở nhiệt độ phòng. Sau khi thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không, thu được 19,2 g cao ethanol thô (sơ đồ tổng quát ghi nhận 20,0 g).
- Tách phân đoạn cồn - nước: Hòa tan lượng cao thô trên trong 200 mL hỗn hợp dung môi $\text{EtOH} : \text{H}_2\text{O}$ (tỉ lệ 9 : 1 thể tích), tách ra được hai phần riêng biệt:
- Phần dung dịch tan trong cồn-nước (DE): thu được 2,0 g cao.
- Phần tủa lắng không tan (TE): thu được 18,0 g (phần tủa này tan hoàn toàn khi hòa tan trong nước).
- Phân lập hợp chất Et35 từ phân đoạn DE:
- Lấy 2,0 g cao DE thực hiện sắc ký cột silica gel pha thuận với hệ dung môi rửa giải A (Hexan : Ethyl Acetate : Acetone : Methanol : Acetic Acid tỉ lệ 40 : 6 : 2 : 1 : 1), thu được 5 phân đoạn chính ký hiệu từ Et1 đến Et5 (trong đó Et1 đạt 201,0 mg; Et5 đạt 150,0 mg; Et3 đạt 405,0 mg).
- Phân đoạn Et3 (405,0 mg) tiếp tục được sắc ký cột silica gel với cùng hệ dung môi A, chia thành 5 phân đoạn phụ từ Et3.1 đến Et3.5.
- Lấy phân đoạn Et3.5 (15,0 mg) tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC) với hệ dung môi A, thu nhận được 8,0 mg hợp chất sạch ký hiệu là Et35.
- Phân lập hợp chất EtA từ phân đoạn TE:
- Phân đoạn TE (18,0 g) được sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải B (Ethyl Acetate : Acetone : Methanol : Acetic Acid tỉ lệ 3 : 1 : 1 : 0,5), thu được phân đoạn W1 (0,5 g).
- Thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC) trên phân đoạn W1 (0,5 g) bằng hệ dung môi B, thu nhận được 12,0 mg hợp chất sạch ký hiệu là EtA.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 3 trình bày dữ liệu vật lý và biện luận cấu trúc phân tử của hai hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ nghiệm NMR:
1. Khảo sát cấu trúc hợp chất Et35
- Tính chất cảm quan: Chất dầu không màu, hấp thụ bức xạ tử ngoại ở bước sóng $\lambda = 254\text{ nm}$, phân lập từ phân đoạn Et3.5.
- Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân:
- Phổ $^1\text{H}$-NMR ($500\text{ MHz, DMSO-}d_6$): Xuất hiện 2 mũi đơn của proton gắn dị tố nitrogen tại $\delta_{\text{H}}\text{ 9,14 (1H, s, NH-1)}$ và $\delta_{\text{H}}\text{ 7,73 (1H, m, NH-3)}$; 5 proton nhân thơm nhóm phenyl tại $\delta_{\text{H}}\text{ 7,23--7,33 (5H, m, H-2'' đến H-6'')}$; 1 proton methine liên kết dị tố ở $\delta_{\text{H}}\text{ 5,14 (1H, d, } J = 3,5\text{ Hz, H-4)}$; 1 nhóm ethoxyl gồm methylene $\delta_{\text{H}}\text{ 3,98 (2H, q, } J = 7,0\text{ Hz, H-2')}$ và methyl $\delta_{\text{H}}\text{ 1,09 (3H, t, } J = 7,0\text{ Hz, H-3')}$; 1 nhóm methyl liên kết trên carbon lai hóa $sp^2$ ở $\delta_{\text{H}}\text{ 2,24 (3H, s, H-4')}$.
- Phổ $^{13}\text{C}$-NMR ($125\text{ MHz, DMSO-}d_6$): Thể hiện tín hiệu của 1 carbon carbonyl ester ở $\delta_{\text{C}}\text{ 165,2 (C-1')}$; 1 carbon carbonyl amide ở $\delta_{\text{C}}\text{ 152,2 (C-2)}$; 1 carbon olefin mang nhóm thế methyl ở $\delta_{\text{C}}\text{ 148,4 (C-6)}$; 1 carbon thơm tứ cấp ở $\delta_{\text{C}}\text{ 145,9 (C-1'')}$; các carbon thơm nhóm phenyl gồm $\delta_{\text{C}}\text{ 128,4 (C-3'', C-5'')}$, $\delta_{\text{C}}\text{ 127,3 (C-4'')}$ và $\delta_{\text{C}}\text{ 126,2 (C-2'', C-6'')}$; 1 carbon olefin tứ cấp ở $\delta_{\text{C}}\text{ 99,3 (C-5)}$; 1 carbon methine $sp^3$ liên kết nitrogen ở $\delta_{\text{C}}\text{ 53,9 (C-4)}$; các carbon nhóm ethoxyl gồm $\delta_{\text{C}}\text{ 59,2 (C-2')}$, $\delta_{\text{C}}\text{ 14,1 (C-3')}$ và carbon methyl $\delta_{\text{C}}\text{ 17,8 (C-4')}$.
- Tương quan phổ 2D (HMBC, HSQC): Proton H-2'' và H-6'' có tương quan HMBC với C-1''; đồng thời proton H-4 có tương quan HMBC với C-1'', C-2'', C-6'', xác định vị trí liên kết giữa vòng thơm phenyl (nhân B) và dị vòng dihydropyrimidine (nhân A) tại vị trí C-4. Proton H-4 tương quan với C-5 và C-6. Nhóm methyl $\text{H}_3\text{-4'}$ tương quan với C-5, C-6 và tương quan xa với C-1', C-4. Proton $\text{H}_2\text{-2'}$ tương quan với C-1', xác nhận nhóm ethoxyl gắn vào carbonyl ester. Proton NH-1 tương quan với C-4, C-5; NH-3 tương quan với C-5, $\text{C-4'}$.
- Kết luận cấu trúc: Đối chiếu độ dịch chuyển hóa học và góc quay cực $[\alpha]_D$ với tài liệu tham khảo chuẩn (Huang Y. và cộng sự, 2005), cấu trúc của Et35 được xác định là (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one. Hợp chất này trước đây chỉ được tạo ra qua phản ứng tổng hợp hữu cơ nhân tạo (phản ứng Biginelli), đây là lần đầu tiên được ghi nhận phân lập từ một nguồn vi sinh vật tự nhiên.
| Vị trí C | Hợp chất chuẩn trong DMSO-$d_6$ [10] | Hợp chất Et35 trong DMSO-$d_6$ | ||
|---|---|---|---|---|
| $\delta_{\text{H}}\text{ (ppm, } J\text{ in Hz)}$ | $\delta_{\text{C}}\text{ (ppm)}$ | $\delta_{\text{H}}\text{ (ppm, } J\text{ in Hz)}$ | $\delta_{\text{C}}\text{ (ppm)}$ | |
| 1 (NH) | 9,14 (1H, s) | — | 9,14 (1H, s) | — |
| 2 (C=O) | — | 152,1 | — | 152,2 |
| 3 (NH) | 7,72 (1H, s) | — | 7,73 (1H, m) | — |
| 4 (CH) | 5,14 (1H, d, $J=3,4$) | 54,0 | 5,14 (1H, d, $J=3,5$) | 53,9 |
| 5 (C) | — | 99,3 | — | 99,3 |
| 6 (C) | — | 148,3 | — | 148,4 |
| 1' (C=O) | — | 165,3 | — | 165,2 |
| 2' ($\text{CH}_2$) | 3,98 (2H, q, $J=7,1$) | 59,2 | 3,98 (2H, q, $J=7,0$) | 59,2 |
| 3' ($\text{CH}_3$) | 1,09 (3H, t, $J=7,1$) | 14,1 | 1,09 (3H, t, $J=7,0$) | 14,1 |
| 4' ($\text{CH}_3$) | 2,24 (3H, s) | 17,8 | 2,24 (3H, s) | 17,8 |
| 1'' (C) | — | 144,9 | — | 145,9 |
| 2'', 6'' (CH) | 7,24 (2H, d, $J=7,2$) | 126,2 | 7,24 (2H, m) | 126,2 |
| 3'', 5'' (CH) | 7,31 (2H, t, $J=7,2$) | 128,4 | 7,33 (2H, m) | 128,4 |
| 4'' (CH) | 7,24 (1H, m) | 127,3 | 7,23 (1H, m) | 127,3 |
2. Khảo sát cấu trúc hợp chất EtA
- Tính chất cảm quan: Chất bột màu trắng, hấp thụ tử ngoại UV ở bước sóng 254 nm, phân lập từ phân đoạn W1.
- Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân:
- Phổ $^1\text{H}$-NMR ($500\text{ MHz, DMSO-}d_6$): Xuất hiện 4 nhóm tín hiệu gồm: 2 proton gắn dị tố tại $\delta_{\text{H}}\text{ 10,98 (2H, s rộng, NH-1 và NH-3)}$; 2 proton olefin tương tác spin-spin với nhau gồm $\delta_{\text{H}}\text{ 7,37 (1H, d, } J = 7,7\text{ Hz, H-6)}$ và $\delta_{\text{H}}\text{ 5,43 (1H, d, } J = 7,7\text{ Hz, H-5)}$.
- Phổ $^{13}\text{C}$-NMR ($100\text{ MHz, DMSO-}d_6$): Thể hiện 4 tín hiệu carbon gồm 2 carbon carbonyl tại $\delta_{\text{C}}\text{ 164,4 (C-4)}$ và $\delta_{\text{C}}\text{ 151,6 (C-2)}$; 2 carbon liên kết đôi olefin ở $\delta_{\text{C}}\text{ 142,2 (C-6)}$ và $\delta_{\text{C}}\text{ 100,3 (C-5)}$.
- Kết luận cấu trúc: Dữ liệu phổ $^1\text{H}$ và $^{13}\text{C}$-NMR hoàn toàn trùng khớp với hợp chất chuẩn Uracil (Pretsch và cộng sự, 2009). Do đó, hợp chất EtA được xác định là Uracil.
| Vị trí | Dữ liệu phổ Uracil chuẩn trong DMSO-$d_6$ [9] | Dữ liệu phổ EtA trong DMSO-$d_6$ | ||
|---|---|---|---|---|
| $\delta_{\text{H}}\text{ (ppm, } J\text{ in Hz)}$ | $\delta_{\text{C}}\text{ (ppm)}$ | $\delta_{\text{H}}\text{ (ppm, } J\text{ in Hz)}$ | $\delta_{\text{C}}\text{ (ppm)}$ | |
| 1 (NH) | 10,80 (1H, s) | — | 10,98 (1H, s rộng) | — |
| 2 (C=O) | — | 151,6 | — | 151,6 |
| 3 (NH) | 11,00 (1H, s) | — | 10,98 (1H, s rộng) | — |
| 4 (C=O) | — | 164,4 | — | 164,4 |
| 5 (CH) | 5,45 (1H, d, $J=7,5$) | 100,3 | 5,43 (1H, d, $J=7,7$) | 100,3 |
| 6 (CH) | 7,39 (1H, d, $J=7,5$) | 142,2 | 7,37 (1H, d, $J=7,7$) | 142,2 |
Chương 4: Kết luận - Đề xuất
- Kết luận: Đã điều chế thành công cao cồn thô từ 500,0 g sinh khối nấm Pestalotiopsis và tách thành hai phân đoạn tan DE và tủa TE. Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng điều chế đã cô lập được 2 hợp chất tinh sạch. Bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HSQC, HMBC), đã xác định được cấu trúc của 2 hợp chất là: (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one (Et35, 8,0 mg) và Uracil (EtA, 12,0 mg). Trong đó, Et35 là hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy tồn tại trong tự nhiên.
- Đề xuất: Tiến hành khảo sát thành phần hóa học trên các phân đoạn cao còn lại (Et1, Et2, Et4, Et5 và các phân đoạn khác của TE); thực hiện thử nghiệm hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, gây độc tế bào ung thư) trên các cao phân đoạn và các hợp chất tinh khiết đã phân lập.
Kết quả và đóng góp
- Kết quả định lượng cụ thể:
- Xử lý 500,0 g sinh khối nấm Pestalotiopsis thu được 19,2 g cao ethanol thô.
- Phân tách cao thô trong dung dịch cồn-nước (9 : 1) chia thành 2,0 g phân đoạn tan DE và 18,0 g phân đoạn tủa TE (tan hoàn toàn trong nước).
- Tinh chế từ phân đoạn DE: Qua 2 lần sắc ký cột và 1 lần sắc ký bản mỏng điều chế (pTLC), từ 405,0 mg cao Et3 (chứa 15,0 mg phân đoạn phụ Et3.5) đã cô lập được 8,0 mg hợp chất tinh khiết Et35.
- Tinh chế từ phân đoạn TE: Qua sắc ký cột và sắc ký bản mỏng điều chế (pTLC), từ 0,5 g phân đoạn W1 đã cô lập được 12,0 mg hợp chất tinh khiết EtA.
- Đóng góp khoa học:
- Công trình lần đầu tiên chứng minh và công bố sự tồn tại của dẫn xuất dihydropyrimidinone mang hoạt tính quang học là (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one trong tự nhiên từ sinh khối vi nấm chi Pestalotiopsis. Trước đó, hợp chất này chỉ được biết đến như một sản phẩm của phản ứng tổng hợp bất đối Biginelli trong hóa học hữu cơ tổng hợp.
- Cung cấp đầy đủ bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HSQC, HMBC) của hợp chất Et35 và Uracil phân lập từ chủng nấm sống trên cây Trang ngập mặn Cần Giờ.
- Giải pháp và kiến nghị: Tác giả đề xuất mở rộng khảo sát thành phần hóa học đối với các phân đoạn cao chiết chưa phân tích (Et1, Et2, Et4, Et5 và các phân đoạn từ TE), đồng thời thực hiện các thử nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học đối với các cao phân đoạn và hai hợp chất đã cô lập được khi có đủ điều kiện.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Do giới hạn về mặt thời gian và điều kiện cơ sở vật chất thực nghiệm, đề tài mới chỉ tập trung phân lập và khảo sát thành phần hóa học trên 2 phân đoạn cao chiết là Et3 (từ DE) và W1 (từ TE). Các phân đoạn cao còn lại chưa được phân tách triệt để. Đề tài cũng chưa triển khai được các thử nghiệm hoạt tính sinh học thực tế đối với các cao chiết và hai hợp chất cô lập được.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Tiếp tục thực hiện quy trình phân lập sắc ký trên các phân đoạn cao còn lại để tìm kiếm thêm các hợp chất tự nhiên mới.
- Nuôi cấy tăng sinh khối nấm để thu nhận lượng mẫu lớn hơn, phục vụ cho việc thử nghiệm các hoạt tính sinh học chuyên sâu như kháng vi sinh vật kiểm định, kháng nấm gây bệnh thực vật, kháng virus và khảo sát độc tính tế bào ung thư.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các lĩnh vực Hóa hữu cơ, Hóa học hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược và Công nghệ sinh học:
- Tài liệu tổng quan chuyên sâu: Cung cấp bức tranh toàn cảnh về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học (kháng sinh, kháng virus HIV/cúm/đường ruột, độc tế bào ung thư) của 126 hợp chất tự nhiên phân lập từ chi nấm Pestalotiopsis trên toàn thế giới theo từng cây chủ.
- Quy trình thực nghiệm: Cung cấp phương pháp chiết tách mẫu sinh khối nấm bằng phương pháp ngâm dầm cồn, kỹ thuật chia tách phân đoạn bằng hệ cồn-nước và các hệ dung môi sắc ký cột/bản mỏng điều chế hiệu quả (Hexan : EA : Ac : Me : AcOH).
- Phương pháp biện luận phổ: Là bài mẫu chi tiết về cách kết hợp dữ liệu phổ 1D ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$) và 2D NMR (HSQC, HMBC) để quy gán từng tín hiệu carbon, proton và xác định cấu trúc hoàn chỉnh của khung dihydropyrimidinone và pyrimidine.
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu nấm Pestalotiopsis trong khóa luận có nguồn gốc từ đâu và được nuôi cấy như thế nào? Mẫu nấm do ThS. Trần Thị Minh Định (Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP.HCM) phân lập từ cây Trang (Kandelia candel (L.) Druce) tại khu vực rừng ngập mặn Cần Giờ, sau đó được nuôi cấy tăng sinh khối trong điều kiện phòng thí nghiệm để phục vụ nghiên cứu hóa học.
2. Quy trình xử lý cao ethanol thô thành các phân đoạn ban đầu được thực hiện ra sao? Lượng cao ethanol thô thu được sau khi cô quay (19,2 g / 20,0 g) được hòa tan trong dung dịch $\text{EtOH} : \text{H}_2\text{O}$ tỉ lệ thể tích 9 : 1. Quá trình này tạo ra hai phần: phần tan trong dung dịch cồn-nước ký hiệu là DE (thu được 2,0 g) và phần tủa lắng không tan ký hiệu là TE (thu được 18,0 g, phần này tan hoàn toàn trong nước).
3. Khóa luận đã cô lập được những hợp chất tinh khiết nào và khối lượng cụ thể là bao nhiêu? Từ 500,0 g sinh khối nấm, đề tài đã cô lập được 2 hợp chất tinh khiết:
- Hợp chất Et35: Khối lượng thu được là 8,0 mg (dạng chất dầu không màu, cô lập từ phân đoạn Et3.5 thuộc phân đoạn cao DE).
- Hợp chất EtA: Khối lượng thu được là 12,0 mg (dạng bột màu trắng, cô lập từ phân đoạn W1 thuộc phân đoạn cao TE).
4. Phát hiện khoa học nổi bật nhất về mặt cấu trúc hóa học trong công trình này là gì? Khóa luận đã chứng minh hợp chất Et35 có cấu trúc là (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one. Đây là hợp chất trước đây vốn chỉ được biết đến như sản phẩm của phản ứng tổng hợp hữu cơ nhân tạo bất đối Biginelli, và đây là lần đầu tiên hợp chất này được tìm thấy tồn tại trong tự nhiên từ vi nấm.
5. Các tương quan phổ 2D NMR nào quyết định việc xác định vị trí liên kết giữa vòng thơm và dị vòng trong hợp chất Et35? Trên phổ HMBC, proton H-4 ($\delta_{\text{H}}\text{ 5,14 ppm}$) thể hiện các tương quan đa liên kết với carbon tứ cấp C-1'' ($\delta_{\text{C}}\text{ 145,9 ppm}$) và carbon thơm C-2'', C-6'' ($\delta_{\text{C}}\text{ 126,2 ppm}$) của vòng phenyl, đồng thời proton H-2'' và H-6'' cũng tương quan ngược lại với C-1''. Tương quan này cùng với tương quan giữa H-4 với C-5 ($\delta_{\text{C}}\text{ 99,3 ppm}$) và C-6 ($\delta_{\text{C}}\text{ 148,4 ppm}$) của dị vòng đã khẳng định vòng phenyl liên kết trực tiếp vào dị vòng tại vị trí carbon C-4.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Hoàng Khánh An đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học từ 500,0 g sinh khối nấm Pestalotiopsis sp. phân lập từ cây Trang rừng ngập mặn Cần Giờ. Nghiên cứu đã chiết tách và phân lập thành công hai hợp chất hữu cơ tinh sạch gồm (R)-(-)-5-ethoxycarbonyl-6-methyl-4-phenyl-3,4-dihydropyrimidin-2(1H)-one (8,0 mg) và Uracil (12,0 mg). Trong đó, việc phát hiện hợp chất khung dihydropyrimidinone lần đầu tiên từ tự nhiên là đóng góp khoa học đáng ghi nhận, mở ra triển vọng cho các nghiên cứu sinh tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học tiếp theo trên chi nấm này.