A laboratory manual for the isolation identification and characterization of avian pathogens 5th 2008

Phân lập, xác định và đặc trưng các tác nhân gây bệnh ở gia cầm là một quy trình quan trọng trong thú y. 267 trang · University of Georgia · 2008.

• Tác giả: Douglas Waltman
• Người hướng dẫn: Louise Dufour-Zavala, Editor-in-Chief
• Trường học: University of Georgia
• Chuyên ngành: Veterinary Medicine
• Đề tài: Hướng Dẫn Phòng Thí Nghiệm Về Cách Phân Lập, Xác Định Và Đặc Trưng Các Tác Nhân Gây Bệnh Ở Gia Cầm
• Loại tài liệu: laboratory manual
• Năm xuất bản: 2008
• Địa điểm: Athens

Mục lục chi tiết

• PREFACE
• 1. Diagnostic Principles
• Appendix of Abbreviations and Acronyms used in the Text
• Quick Reference Diagnostic Chart

Tóm tắt

I. Hướng dẫn tổng quan về phân lập tác nhân gây bệnh ở gia cầm

Phân lập, xác định và đặc trưng các tác nhân gây bệnh ở gia cầm là một quy trình quan trọng trong thú y. Quy trình này không chỉ giúp phát hiện sớm các bệnh truyền nhiễm mà còn hỗ trợ trong việc quản lý sức khỏe đàn gia cầm. Việc hiểu rõ về các phương pháp và kỹ thuật trong phòng thí nghiệm là cần thiết để đảm bảo hiệu quả trong việc chẩn đoán và điều trị.

1.1. Tổng quan về các tác nhân gây bệnh ở gia cầm

Các tác nhân gây bệnh ở gia cầm bao gồm virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Mỗi loại tác nhân có những đặc điểm riêng và gây ra các triệu chứng khác nhau. Việc phân loại và hiểu rõ về chúng là bước đầu tiên trong quy trình chẩn đoán.

1.2. Tầm quan trọng của việc phân lập tác nhân gây bệnh

Phân lập tác nhân gây bệnh giúp xác định nguyên nhân gây bệnh, từ đó đưa ra phương pháp điều trị hiệu quả. Điều này cũng giúp ngăn chặn sự lây lan của bệnh trong đàn gia cầm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn đề và thách thức trong việc xác định tác nhân gây bệnh

Việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh ở gia cầm gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như sự đa dạng của các tác nhân, sự tương tác giữa chúng và các triệu chứng không điển hình có thể gây khó khăn trong chẩn đoán. Ngoài ra, việc sử dụng các phương pháp truyền thống có thể không đủ nhạy và đặc hiệu.

2.1. Những khó khăn trong việc chẩn đoán bệnh

Nhiều bệnh ở gia cầm có triệu chứng tương tự nhau, điều này gây khó khăn trong việc phân biệt. Hơn nữa, một số tác nhân gây bệnh có thể không phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy, làm giảm khả năng phát hiện.

2.2. Tác động của môi trường đến việc xác định tác nhân

Môi trường sống của gia cầm có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của các tác nhân gây bệnh. Các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm và chất lượng thức ăn có thể làm thay đổi khả năng phát hiện và phân lập tác nhân.

III. Phương pháp phân lập tác nhân gây bệnh hiệu quả

Có nhiều phương pháp khác nhau để phân lập tác nhân gây bệnh ở gia cầm. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy vi sinh vật, xét nghiệm huyết thanh và các kỹ thuật phân tử. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng.

3.1. Kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật

Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp truyền thống để phân lập các tác nhân gây bệnh. Kỹ thuật này yêu cầu môi trường nuôi cấy thích hợp và điều kiện tối ưu để vi sinh vật phát triển.

3.2. Phương pháp xét nghiệm huyết thanh

Xét nghiệm huyết thanh giúp phát hiện kháng thể trong máu gia cầm, từ đó xác định sự hiện diện của tác nhân gây bệnh. Phương pháp này có thể nhanh chóng và hiệu quả trong việc chẩn đoán.

3.3. Kỹ thuật phân tử trong phân lập tác nhân

Kỹ thuật phân tử như PCR cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các tác nhân gây bệnh. Phương pháp này có độ nhạy cao và có thể phát hiện ngay cả khi số lượng tác nhân rất ít.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã chỉ ra rằng việc áp dụng các phương pháp phân lập và xác định tác nhân gây bệnh có thể cải thiện đáng kể sức khỏe đàn gia cầm. Những kết quả này không chỉ giúp nâng cao năng suất mà còn giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

4.1. Kết quả từ các nghiên cứu thực địa

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng các phương pháp phân lập hiệu quả giúp phát hiện sớm các bệnh truyền nhiễm, từ đó giảm thiểu thiệt hại cho ngành chăn nuôi.

4.2. Ứng dụng công nghệ mới trong phân lập tác nhân

Công nghệ mới như giải trình tự gen và phân tích sinh học phân tử đã mở ra hướng đi mới trong việc xác định và phân lập tác nhân gây bệnh. Những công nghệ này giúp nâng cao độ chính xác và tốc độ chẩn đoán.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về tác nhân gây bệnh ở gia cầm

Nghiên cứu về phân lập, xác định và đặc trưng các tác nhân gây bệnh ở gia cầm đang ngày càng trở nên quan trọng. Với sự phát triển của công nghệ, tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc bảo vệ sức khỏe đàn gia cầm và nâng cao năng suất chăn nuôi.

5.1. Tương lai của nghiên cứu tác nhân gây bệnh

Nghiên cứu trong lĩnh vực này sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của công nghệ mới. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và điều trị bệnh.

5.2. Tầm quan trọng của hợp tác quốc tế trong nghiên cứu

Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu về tác nhân gây bệnh sẽ giúp chia sẻ kiến thức và kinh nghiệm, từ đó nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh tật ở gia cầm trên toàn cầu.

Nội dung chính

A Laboratory Manual for the Isolation, Identification and Characterization of Avian Pathogens (Fifth Edition)

Tổng quan về giáo trình

A Laboratory Manual for the Isolation, Identification and Characterization of Avian Pathogens (Ấn bản lần thứ 5, năm 2008, ISBN: 978-0-9789163-2-9) là giáo trình thực hành chuyên sâu do Hiệp hội Bệnh học Gia cầm Hoa Kỳ (American Association of Avian Pathologists - AAAP) biên soạn và phát hành. Ban biên tập ấn bản này gồm Tiến sĩ Louise Dufour-Zavala (Tổng biên tập), cùng các biên tập viên chuyên mục David E. Swayne, John R. Glisson, Mark W. Jackwood, James E. Pearson, Willie M. Reed và Peter R. Woolcock, với sự tham gia của 67 nhà khoa học chuyên ngành.

Trong chương trình đào tạo Bác sĩ Thú y và sau đại học ngành Bệnh học Động vật, giáo trình giữ vị trí tài liệu quy chuẩn cho các học phần Chẩn đoán Vi sinh vật Thú y, Bệnh truyền nhiễm Gia cầm và Kỹ thuật Xét nghiệm Bệnh học Gia cầm.

Mục tiêu học tập của giáo trình bao gồm:

• Cung cấp cơ sở lý thuyết và quy trình thực nghiệm để phân lập, định danh và đặc tính hóa các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm trên gia cầm và các loài chim (bao gồm vi khuẩn, virus, nấm, xoắn khuẩn).
• Chuẩn hóa phương pháp thao tác bệnh phẩm từ hiện trường đến các xét nghiệm sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
• Thiết lập quy trình kiểm soát chất lượng xét nghiệm theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và hướng dẫn của Hiệp hội các nhà Chẩn đoán Phòng thí nghiệm Thú y Hoa Kỳ (AAVLD).

Cấu trúc giáo trình kết hợp giữa các chương nguyên lý đại cương (quản lý chất lượng, an toàn sinh học, môi trường nuôi cấy tế bào, phôi trứng) và các chương chuyên khảo chi tiết cho từng tác nhân bệnh lý cụ thể. Phương pháp tiếp cận đi từ việc nhận định ca bệnh thực địa, phân lập trên môi trường chọn lọc, đến thử nghiệm sinh hóa và phân tích di truyền học.

Nội dung kiến thức cốt lõi

Các chương/chủ đề chính

Cấu trúc giáo trình bao gồm hệ thống các chương chuyên khảo được phân bổ logic theo từng nhóm tác nhân vi sinh vật:

• Chương 1: Diagnostic Principles (Tác giả: Frederic J. Hoerr): Trình bày nguyên lý chẩn đoán dịch tễ và bệnh học quần thể. Phân tích ba yếu tố tác động đến biểu hiện bệnh: độc lực của mầm bệnh, liều lượng phơi nhiễm và tính cảm nhiễm của vật chủ. Chương này cung cấp quy chuẩn phân biệt chủng virus vắc-xin và chủng thực địa dựa trên phân tích di truyền; giải thích hiện tượng phản ứng vắc-xin kéo dài (rolling reactions) do miễn dịch không đồng đều; vai trò của đàn chỉ thị SPF (specific-pathogen-free); quy định an toàn sinh học cấp 1 đến cấp 3 (BSL-1, BSL-2, BSL-3) và nghĩa vụ báo cáo dịch tễ cho Tổ chức Thú y Thế giới (OIE).
• Chương 2: Salmonellosis (Tác giả: W. Douglas Waltman và Richard K. Gast): Hướng dẫn phân lập và định danh Salmonella pullorum (bệnh bạch lỵ), Salmonella gallinarum (bệnh thương hàn gà) và nhóm paratyphoid (S. enteritidis, S. arizonae, S. typhimurium). Hướng dẫn quy trình lấy mẫu môi trường bằng gạc kéo (drag swabs) thấm sữa gầy nồng độ kép (DSSM), lấy mẫu rác ấp (hatch residue) và đệm lót chuồng. Chi tiết hóa quy trình làm giàu trong môi trường Tetrathionate (TT) Hajna, Rappaport-Vassiliadis (RV), kỹ thuật làm giàu thứ cấp chậm (DSE), cấy truyền trên thạch chọn lọc BGN, XLT4, kết hợp thử nghiệm sinh hóa trên TSI, LIA và phản ứng ngưng kết huyết thanh học nhóm O, H.
• Chương 3: Colibacillosis (Tác giả: M. D. Lee và Lisa K. Nolan): Mô tả các thể bệnh do Escherichia coli gây bệnh trên gia cầm (APEC) như viêm túi khí, viêm màng ngoài tim, viêm bao khớp sợi huyết. Trình bày phương pháp phân lập trên thạch MacConkey, định danh hóa sinh thông qua phản ứng indole dương tính, H2S âm tính trên TSI và sử dụng hệ thống kít sinh hóa API 20E.
• Chương 8: Spirochetosis and Intestinal Spirochetes (Tác giả: Stephen R. Collett): Khảo sát Borrelia anserina gây nhiễm trùng huyết truyền qua ve Argas và các loài xoắn khuẩn đường ruột (Brachyspira hyodysenteriae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. pilosicoli). Cung cấp phương pháp quan sát tiêu bản tươi dưới kính hiển vi nền đen (dark-field), nhuộm bạc, kỹ thuật tập trung xoắn khuẩn bằng ly tâm microhematocrit lớp buffy coat, nuôi cấy kỵ khí trên thạch máu chứa spectinomycin/rifampin, và định danh bằng kỹ thuật 2S-N-D-PCR cùng hệ thống enzym API ZYM.
• Chương 9: Erysipelas (Tác giả: George L. Cooper và Arthur A. Bickford): Hướng dẫn phân lập Erysipelothrix rhusiopathiae gây bệnh đóng dấu trên gà tây và thủy cầm. Quy trình cấy phân lập trên thạch máu, môi trường chọn lọc ESB và Packer's; ghi nhận đặc tính tạo vệt đen sinh H2S trên thạch đứng TSI và dạng mọc hình chổi cọ (bottlebrush) trong gelatin; thực hiện thử nghiệm bảo vệ trên chuột (mouse protection test); phân loại serovar và phân tích ribotyping, MLEE.
• Các chương kỹ thuật hỗ trợ: Bao gồm phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Cell-Culture Methods), nuôi cấy trên trứng có phôi (Virus Propagation in Embryonating Eggs), chuẩn độ vi sinh (Titration of Biological Suspensions), các quy trình định danh phân tử (Molecular Identification Procedures) và hệ thống phát hiện kháng nguyên (Antigen Detection Systems).

Progression logic của giáo trình đi từ nguyên lý bảo đảm chất lượng xét nghiệm (Chương 1), chuyển sang các quy trình vi khuẩn học kinh điển và chuyên biệt (Chương 2-10), tiếp nối bằng các phương pháp virus học, nấm học và hoàn tất ở các chương công nghệ sinh học phân tử.

Kiến thức nền tảng được xây dựng

Giáo trình thiết lập các khối kiến thức cơ sở:

• Lý thuyết dịch tễ và sinh bệnh học vi sinh: Cơ chế truyền lây ngang và dọc, tương tác đồng nhiễm (co-pathogens giữa virus và vi khuẩn cơ hội như E. coli, Mycoplasma).
• Nguyên lý hóa sinh vi sinh vật: Phản ứng lên men đường, khử carboxyl của lysine (LIA), sinh khí hydro sulfide (H2S), hoạt tính urease, beta-galactosidase và cấu trúc enzyme nội bào (hệ thống API ZYM).
• Miễn dịch và di truyền học chẩn đoán: Cấu trúc kháng nguyên soma (O) và kháng nguyên lông (H); cơ chế phản ứng ngưng kết máu toàn phần (WBP) theo chương trình NPIP; nguyên lý phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP), Real-time RT-PCR định lượng và giải trình tự gen mã hóa protein gai (S1) của Coronavirus hoặc gen M của virus Cúm gia cầm.

Kỹ năng phát triển

• Kỹ năng kỹ thuật (Technical skills): Thao tác lấy mẫu bệnh phẩm mô vô trùng; pha chế và vận hành môi trường chuyên biệt (BGN, XLT4, ESB, RV); thao tác gieo cấy xoang niệu nang hoặc túi noãn hoàng trên phôi trứng gà/vịt; kỹ thuật soi kính hiển vi nền đen và tương phản pha.
• Kỹ năng phân tích (Analytical skills): Đọc và biện giải các chỉ số biến đổi màu sinh hóa trên TSI/LIA; đối chiếu bảng mã định danh vi khuẩn; phân tích kết quả điện di gel agar của sản phẩm PCR và RFLP.
• Năng lực thực hành chuẩn tắc (Practical competencies): Thực hiện quy trình an toàn sinh học cấp phòng thí nghiệm (BSL-2, BSL-3); lưu trữ mẫu chủng chuẩn ở nhiệt độ âm sâu (-70°C và nitơ lỏng); vận hành hệ thống kiểm soát chất lượng đáp ứng yêu cầu thẩm định của AAVLD và ISO/IEC 17025.

Phương pháp giảng dạy và học tập

Tiếp cận sư phạm (Pedagogical approach)

Giáo trình được cấu trúc theo phương pháp giảng dạy dựa trên thực hành phòng thí nghiệm (bench-oriented approach). Mỗi chương bệnh học đều được chuẩn hóa thành các mục cố định: Tổng quan dịch tễ $\rightarrow$ Biểu hiện bệnh lý lâm sàng $\rightarrow$ Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm $\rightarrow$ Môi trường nuôi cấy ưu tiên $\rightarrow$ Định danh tác nhân $\rightarrow$ Phát hiện huyết thanh học trên vật chủ $\rightarrow$ Chẩn đoán phân biệt.

Bài tập và ca bệnh thực hành

• Xử lý tình huống giám sát dịch tễ đàn: Phân tích mẫu gạc kéo chuồng trại và rác ấp để phát hiện đàn gia cầm mang trùng Salmonella không triệu chứng theo tiêu chuẩn NPIP.
• Chẩn đoán phân biệt hội chứng hô hấp phức hợp: Quy trình tách chiết virus viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) và xác định biến chủng mới so với chủng vắc-xin thông qua RT-PCR và enzyme cắt giới hạn (BstYI, HaeIII, XcmI).
• Phân lập vi khuẩn kỵ khí và vi hiếu khí khó nuôi: Thiết lập môi trường ủ kỵ khí (94% N2 / 6% CO2) cho Brachyspira từ niêm mạc manh tràng gà và chim đà điểu.

Phương pháp đánh giá và tự học

• Đánh giá năng lực: Đánh giá thông qua tỷ lệ thu hồi mầm bệnh tinh sạch, độ chính xác trong định danh serogroup/serotype và khả năng biện giải sai lệch giữa triệu chứng lâm sàng và kết quả phân lập.
• Hướng dẫn tự học: Sử dụng Sơ đồ chẩn đoán nhanh (Quick Reference Diagnostic Chart, trang 247) để tra cứu chỉ dấu sinh hóa và môi trường phân lập ưu tiên; đối chiếu các từ viết tắt chuyên ngành tại bảng Appendix of Abbreviations and Acronyms (trang 241).

Điểm nổi bật và cập nhật

So với các ấn bản tiền nhiệm (từ bản 1 năm 1975 đến bản 4 năm 1998), ấn bản lần thứ 5 có những cập nhật kỹ thuật cụ thể:

• Mở rộng tiêu đề và phạm vi: Bổ sung cụm từ "and Characterization" vào tên giáo trình nhằm phản ánh các bước tiến trong việc định type, định loài và xác định serotype của mầm bệnh thông qua công nghệ sinh học phân tử.
• Bổ sung chương bệnh học mới: Bổ sung chương chuyên khảo riêng về Turkey Coronavirus.
• Tích hợp tài liệu thị giác: Bổ sung bảng ảnh màu vi thể (color plate) hiển thị bệnh tích tế bào học (syncytia do virus ILT hình thành trên tế bào thận phôi gà), hình thái khuẩn lạc (Mycoplasma gallisepticum phóng đại 35x trên thạch) và cấu trúc kính hiển vi của bào tử Aspergillus sp. trên thạch Sabouraud dextrose.
• Cập nhật kỹ thuật phân tử hiện đại: Tích hợp quy trình Real-time RT-PCR phát hiện gen M của virus Cúm gia cầm trên hệ thống Applied Biosystems 7500 FAST; kỹ thuật PCR lồng 2 bước kép (2S-N-D-PCR) phát hiện Brachyspira pilosicoli và Brachyspira intermedia trong phân; phân tích ribotyping và MLEE cho Erysipelothrix.
• Thay thế các quy trình lỗi thời: Loại bỏ môi trường Selenite (do độc tính gây đột biến gen và hạn chế khi ủ nhiệt độ cao) để thay thế bằng môi trường Rappaport-Vassiliadis (RV); chuyển đổi phụ lục nguồn cung cấp kháng huyết thanh tham chiếu sang tra cứu dữ liệu trực tuyến.

Đối tượng sử dụng giáo trình

• Sinh viên đại học: Sinh viên năm thứ 4 và năm cuối các ngành Bác sĩ Thú y, Chăn nuôi - Thú y, Công nghệ Sinh học Động vật tham gia các học phần Chẩn đoán Vi sinh Thú y và Bệnh truyền nhiễm.
• Học viên sau đại học: Học viên Cao học và Nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học Thú y, Dịch tễ học Thú y và Bệnh lý học Động vật sử dụng làm tài liệu tham khảo quy chuẩn cho các đề tài nghiên cứu phân lập và giải trình tự gen mầm bệnh.
• Yêu cầu kiến thức tiên quyết (Prerequisites): Đã hoàn thành các học phần Vi sinh vật học đại cương, Miễn dịch học đại cương, Hóa sinh học và Nguyên lý Bệnh học Thú y.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Giảng viên sử dụng giáo trình để thiết kế giáo án thực hành thí nghiệm; kỹ thuật viên tại các phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y quốc gia, chi cục thú y vùng và phòng lab của các doanh nghiệp chăn nuôi gia cầm sử dụng làm sổ tay quy trình thao tác chuẩn (SOP).

Câu hỏi thường gặp

1. Giáo trình này phù hợp với ai?
Tài liệu phù hợp cho sinh viên đại học năm cuối ngành Thú y, học viên cao học, giảng viên chuyên ngành Bệnh học Gia cầm và các kỹ thuật viên làm việc tại các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh thú y.

2. Cần kiến thức nền nào để học?
Người học cần có kiến thức cơ bản về kỹ thuật vi sinh (khử trùng, đổ đĩa, cấy ria, nhuộm Gram), kiến thức sinh hóa (chuyển hóa đường, phản ứng enzyme) và các khái niệm cơ bản về sinh học phân tử (nguyên lý PCR, điện di).

3. Điểm khác biệt với giáo trình khác?
Giáo trình tập trung chuyên biệt vào thao tác phòng thí nghiệm (laboratory bench manual), cung cấp công thức môi trường, nhiệt độ và thời gian ủ chính xác, cùng các lưu ý kỹ thuật để loại bỏ vi khuẩn tạp nhiễm thay vì chỉ mô tả triệu chứng lâm sàng tổng quan.

4. Làm sao để tự học hiệu quả?
Người học nên bám sát sơ đồ chẩn đoán ở từng chương (diagnostic flowcharts), đối chiếu các phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn mục tiêu trên bảng phản ứng chuẩn (như Bảng 2.1 cho Salmonella), và tra cứu bảng Quick Reference Diagnostic Chart ở cuối sách.

5. Có tài liệu bổ trợ nào kèm theo?
Giáo trình cung cấp các bảng ảnh màu hình thái khuẩn lạc và tổn thương tế bào ở đầu sách, phụ lục giải thích từ viết tắt (trang 241), biểu đồ chẩn đoán nhanh (trang 247) và trích dẫn hệ thống tiêu chuẩn kiểm định của AAVLD, OIE và NPIP.

Kết luận

A Laboratory Manual for the Isolation, Identification and Characterization of Avian Pathogens (Fifth Edition) là công trình chuyên khảo chuẩn hóa các quy trình xét nghiệm vi sinh bệnh học gia cầm, kết hợp đồng bộ giữa phương pháp nuôi cấy cổ điển và kỹ thuật sinh học phân tử. Lộ trình học tập khuyến nghị là nắm vững nguyên tắc an toàn và kiểm soát chất lượng (Chương 1), thực hành các quy trình phân lập vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn kỵ khí (Chương 2, 3, 8, 9), sau đó tiến tới các kỹ thuật chẩn đoán virus và sinh học phân tử chuyên sâu. Để hỗ trợ học tập, người học có thể tham khảo thêm các tiêu chuẩn cập nhật từ OIE (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals) và quy định của Chương trình Cải thiện Gia cầm Quốc gia Hoa Kỳ (NPIP).

Trích đoạn nội dung tài liệu

A LABORATORY MANUAL FOR THE ISOLATION, IDENTIFICATION, AND CHARACTERIZATION - OF AVIAN UH* ** w/ « Fifth Edition THE AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATHOLOGISTS A LABORATORY MANUAL FOR THE ISOLATION, IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF AVIAN PATHOGENS Fifth Edition American Association of Avian Pathologists Editorial Committee Louise Dufour-Zavala, Editor-in-Chief David E. Woolcock Copies Available from: American Association of Avian Pathologists 953 College Station Road Athens, GA 30602-4875 Frederic J. Direct fluorescent antibody test on primary chicken embryo kidney cells showing syncytia formed by ILT virus in primary chick embryo kidney cells. Ninety well serum plate prepared for ELISA testing for the detection of AE antibodies.

Bacterial culture on a TSI slant. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis if the spike (SI) glycoprotein gene of the Arkansas strain of infectious bronchitis virus (IBV). Lanes 1 and 2 are molecular weight markers. Lane 3 is the IBV amplicon digested 9 with BstYI, lane 4 is the IBV amplicon digested with Haein, and lane 5 is the IBV amplicon digested with XcmI.

Ten-fold dilution series of avian influenza virus RNA run with the USDA type A influenza M gene real-time RT-PCR test on the Applied Biosystems 7500 FAST system. Microphotograph of Mycoplasma gallisepticum colonies on agar (35x) (Stan Kleven, PDRC, Athens, GA). Bio Merieux API 20 system for bacteria identification using a series of biochemical tests. Embryonated egg candling to locate the chorio-allantoic sac for inoculation of a virus isolation sample.

Wet mount of Aspergillus 2 sp. conidiofores after culture in Sabouraud's dextrose agar (100X). The isolate was obtained from a case of systemic aspergillosis in 9-wk-old broiler breeder pullets. Pictures 2,3,7,8 and Page design by HMM Photography (Heidi Migalla).

5 6 7 1-------- 1 8 Copyright © 1975, 1980, 1989,1998,2008 by American Association of Avian Pathologists, Inc. Athens, Georgia All rights reserved Copyright is not claimed for Chapters 22, 36 Chapters 16,29, 35,40,44, 49: US Government copyrighted, user rights reserved, printed by permission Chapters 30, 31: (British) Crown copyrighted and (British) Crown user rights reserved, printed by permission Chapter 6: (Australian) Crown copyrighted and (Australian) Crown user rights reserved, printed by permission Mention of a trademark or proprietary product does not constitute a guarantee or warranty of the product by the author, the supporting institutions or the American Association of Avian Pathologists and does not imply its approval to the exclusion of other products that also may be suitable Fifth edition 2008 Previously entitled Isolation and Identification ofAvian Pathogens Library of Congress Catalog Card Number: 2008924452 ISBN 978-0-9789163-2-9 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the copyright owner. Printed in the United States of America 10 987654321 Printed by OmniPress, Inc., Madison, Wisconsin 53704 ii A Laboratory Manual for the Isolation, Identification and Characterization of Avian Pathogens TABLE OF CONTENTS 1.

Douglas Waltman and Richard K. Lee and Lisa K. Pasteurellosis, Avibacteriosis, Gallibacteriosis, Riemerellosis, and Pseudotuberculosis. Sandhu, and Charles L.

Campylobacter in Poultry. Wagenaar and Wilma F. Cooper and Arthur A. Cooper and Arthur A.

Streptococcosis and Enterococcosis. Thayer and David A. Susan Sanchez and Richard M. Andersen and Daisy Vanrompay.

Chin and Bruce R. Mycoses and Mycotoxicoses. Hemorrhagic Enteritis of Turkeys Marble Spleen Disease of Pheasants. William Pierson and Sctott D.

Tripathy and Maricarmen Garcia. Wakenell and Jagdev M. Duck Virus Enteritis. Herpesviruses of Free-Living and Pet Birds.

Tripathy and Willie M. Budgerigar Fledgling Disease and Other Avian Polyomavirus Infections. Ritchie and Phil D. Psittacine Beak and Feather Disease.

Ritchie and Phil D. Chicken Anemia Virus. Stewart McNulty and Daniel Todd. Senne and David L.

Newcastle Disease Virus and Other Avian Paramyxoviruses. Alexander and Dennis A. Gough and Janice C. Jack Gelb, Jr.

Jackwood and James S. Don Reynolds and Ching Ching Wu. Oncornaviruses, Leukosis/Sarcomas and Reticuloendotheliosis. Witter, and Henry D.

Louis van der Heide. Turkey Viral Hepatitis. Viral Arthritis/Tenosynovitis and Other Reovirus Infections. Rosenberger and Erica Spackman.

Ostlund and James E. Infectious Bursal Disease. Saif, and Daral J. Parvovirus of Waterfowl.

Cell-Culture Methods. Schat and Holly S. Virus Propagation in Embryonating Eggs.