Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ của tác giả Thuc Dinh Ngoc (Đinh Ngọc Thức), thực hiện dưới sự hướng dẫn của Giáo sư Wim Dehaen tại Bộ môn Thiết kế và Tổng hợp Phân tử (Molecular Design and Synthesis Division), Khoa Khoa học, Trường Tiến sĩ Arenberg, Đại học Công giáo Leuven (KU Leuven), Vương quốc Bỉ, được hoàn thành và bảo vệ vào tháng 5 năm 2014. Đề tài tập trung vào việc nghiên cứu tổng hợp và xác định tính chất của các dẫn xuất dị vòng mới từ các triterpenoid tự nhiên.

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ tiềm năng dược học to lớn của nhóm hợp chất thiên nhiên terpenoid, đặc biệt là các triterpenoid ngũ vòng. Trong tự nhiên, hơn 200 khung triterpene khác nhau đã được nhận diện. Các hợp chất này đóng vai trò quan trọng làm tiền chất tổng hợp các loại thuốc có tác dụng chống viêm, chống viêm khớp, ức chế sự phát triển của khối u và ứng dụng trong trị liệu ung thư. Trong số đó, betulin và axit betulinic là hai triterpenoid pentacyclic phân bố rất phổ biến trong tự nhiên, có thể thương mại hóa và dễ dàng tách chiết với số lượng lớn từ vỏ cây bạch dương (Betula spp.) – một nguồn phụ phẩm dồi dào từ công nghiệp chế biến gỗ. Khoảng trống nghiên cứu được chỉ ra là mặc dù betulin, allobetulin và axit betulinic đã được nghiên cứu từ thế kỷ 19, nhu cầu biến đổi cấu trúc để cải thiện hoạt tính sinh học, tăng tính hòa tan và mở rộng không gian hóa học của nhóm chất này vẫn là vấn đề thời sự. Cụ thể, các hướng tiếp cận tạo liên kết dị vòng ngưng tụ hoặc dị vòng liên hợp tại vòng A của khung phân tử còn nhiều hạn chế do các rào cản lập thể phức tạp; đồng thời các dẫn xuất kết hợp với chất đánh dấu huỳnh quang như khung BODIPY và tính chọn lọc vị trí trên các đồng phân carbonyl chưa từng được khảo sát đầy đủ.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể qua bốn nội dung chính:

  1. Tổng hợp một chuỗi các dẫn xuất dị vòng ngưng tụ [2,3] mới từ allobetulin và axit betulonic, bao gồm các dị vòng pyrrole, 1,2,3-thiadiazole, 1,2,3-selenadiazole, 1,2,4-triazine, thienopyridine và các dị vòng ngưng tụ chứa phẩm nhuộm huỳnh quang BODIPY.
  2. Khảo sát tính chọn lọc vị trí (regioselectivity) của các phản ứng chức hóa trên 2-oxoallobetulin (đồng phân vị trí của allobetulone) thông qua một số phản ứng hóa học kinh điển nhằm xác định trung tâm phản ứng ưu thế giữa vị trí C-1 và C-3.
  3. Khảo sát phản ứng cộng Grignard lên nhóm ketone của cả hai đồng phân allobetulone và 2-oxoallobetulin, sau đó phát triển tiếp các phản ứng nhiệt chu chuyển để tạo ra các hợp chất dị vòng liên hợp (conjugated heterocycles), cụ thể là dãy dẫn xuất 1,2,3-triazole mới.
  4. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của các hợp chất dị vòng mới tổng hợp và khảo sát các đặc tính huỳnh quang của các chất nhuộm BODIPY gắn khung triterpenoid.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các hợp chất triterpenoid pentacyclic thuộc khung lupane và oleanane, bao gồm betulin, allobetulin, allobetulone, 2-oxoallobetulin, axit betulinic và axit betulonic. Phạm vi nghiên cứu về mặt không gian được thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Thiết kế và Tổng hợp Phân tử, Đại học Công giáo Leuven, Bỉ. Về mặt hóa học, nghiên cứu giới hạn phạm vi biến đổi cấu trúc tập trung độc quyền vào vòng A của khung triterpene, bảo toàn khung carbon ngũ vòng và cầu ether của allobetulin hoặc nhóm chức tại C-28 của khung lupane. Mốc thời gian hoàn thành toàn bộ các nội dung nghiên cứu và bảo vệ luận án là tháng 5 năm 2014.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan, tác giả hệ thống hóa lịch sử sử dụng hợp chất tự nhiên trong y học từ thời kỳ Lưỡng Hà cổ đại (khoảng năm 2600 TCN) đến thời kỳ hiện đại. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hơn 80% dân số toàn cầu vẫn phụ thuộc vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khỏe ban đầu. Một tổng quan tài liệu bao quát đến năm 2010 cho thấy 71% tổng số các thuốc mới được phê duyệt có nguồn gốc từ thiên nhiên, và trong lĩnh vực điều trị ung thư, tỷ lệ này lên đến 75%.

Tác giả trình bày phân loại học hợp lý của các terpene dựa trên số lượng đơn vị isoprene ($C_5H_8$) cấu thành:

Nhóm Terpene Số đơn vị Isoprene Số nguyên tử Carbon Công thức hóa học Hợp chất tiêu biểu được điểm lại
Hemiterpenes 1 5 $C_5H_8$ Liên kết trong alkaloid, flavonoid, coumarin
Monoterpenes 2 10 $C_{10}H_{16}$ Geraniol, limonene, α-pinene, camphor
Sesquiterpenes 3 15 $C_{15}H_{24}$ Gossypol, artemisinin, α-cadinene
Diterpenes 4 20 $C_{20}H_{32}$ Taxol, steviol, stevioside, isosteviol
Sesterterpenes 5 25 $C_{25}H_{40}$ Ophiobolin A
Triterpenes 6 30 $C_{30}H_{48}$ Lupeol, betulin, betulinic acid, ursolic acid, oleanolic acid
Tetraterpenes 8 40 $C_{40}H_{64}$ β-Cryptoxanthin, α-carotene, β-carotene, lycopene
Polyterpenes >40 >200 $(C_5H_8)_n$ Cao su tự nhiên (Hevea brasiliensis), gutta-percha

Đối với đối tượng nghiên cứu chính, betulin (lup-20(29)-ene-3β,28-diol) được Lovits phát hiện lần đầu tiên vào năm 1788 và được Mason đặt tên vào năm 1831. Hợp chất này chiếm hàm lượng 10–40% trong vỏ cây bạch dương tùy thuộc vào loài cây, vị trí địa lý, điều kiện thổ nhưỡng và độ tuổi. Các kỹ thuật chiết tách betulin trong tài liệu bao gồm nhiệt phân chân không ở 250–300 °C, chiết xuất hỗ trợ bằng siêu âm, hoặc chiết quy mô lớn bằng ethanol và nước nóng điều áp ở 120 °C dưới áp suất 50 bar. Năm 1922, Schulze và Pieroh phát hiện phản ứng chuyển vị Wagner-Meerwein khi xử lý betulin bằng axit formic để tạo thành allobetulin ((18α)-19β,28-epoxyoleanan-3β-ol). Cấu trúc oleanane của allobetulin sau đó được Dischendorfer và cộng sự xác định. Cơ chế chuyển vị liên quan đến sự mở rộng vòng E của khung lupane thành oleanane, tạo carbocation trung gian và bị bẫy nội phân tử bởi nhóm rượu bậc một tại C-28, hình thành liên kết cầu ether. Các chất xúc tác axit hiện đại cho phản ứng này bao gồm $Bi(OTf)_3$ và axit para-toluenesulfonic (p-TsOH).

Tác giả tổng hợp các công trình chuyển hóa betulin và allobetulin trước đó:

  • Phản ứng tạo ester mono- hoặc di-ester với axit succinic, anhydrit phthalic hoặc acyl chloride trong pyridine (hợp chất 21–24).
  • Phản ứng glycosyl hóa với acetobromoglucose có mặt $CdCO_3$ tạo glycoside của betulin và allobetulin (25–28).
  • Phản ứng acyl hóa và hydro hóa tạo các dẫn xuất 30–35.
  • Chuyển hóa allobetulin thành allobetulone (36) bằng các tác nhân oxy hóa như natri hypochlorite, crom(VI) oxit trong axit sulfuric, axit meta-chloroperoxybenzoic (mCPBA), $FeCl_3/SiO_2$ hoặc quá trình oxy hóa Swern.
  • Phản ứng của allobetulone với hydroxylamine tạo oxime (37), với phenylhydrazine tạo hydrazone (38).
  • Ngưng tụ Claisen tạo 1,3-diketone (39), enamine (40) và ngưng tụ aldol tạo enone chưa no (41).
  • Oxy hóa allobetulone bằng oxy trong môi trường kiềm tạo 2-hydroxyenone (42) và phản ứng với isoamyl nitrite tạo dẫn xuất oxime (43), dẫn đến các dị vòng pyrazole và isoxazole (44–45).
  • Brom hóa allobetulone tạo dẫn xuất mono- và dibromo (46, 47), phản ứng tách hydrobromic tạo ketone chưa no (48, 49).
  • Phản ứng Hantzsch giữa 2-bromoallobetulone với thiourea tạo aminothiazole (50); ngưng tụ của 42 với 1,2-diaminoethane hoặc 1,2-diaminobenzene tạo hệ vòng pyrazine (51, 52).
  • Oxy hóa Baeyer-Villiger allobetulone bằng mCPBA tạo lactone giãn vòng (53) hoặc norlactone mở vòng (54) khi có axit.
  • Chuyển vị Beckmann của oxime 37 bằng tosyl chloride/pyridine hoặc $POCl_3$ tạo lactam (55) cùng sản phẩm mở vòng 3,4-secotriterpene nitrile (56).
  • Chuyển hóa allobetulone thành 2-oxoallobetulin (57) qua phản ứng Willgerodt-Kindler với lưu huỳnh và morpholine; phản ứng cộng acetylide tạo 58; phản ứng cộng trimethylsilyl cyanide tạo aminoalcohol (59); tạo enol acetate (60), acetoxyketone (61), enamine (62) và tổng hợp Fischer indole tạo 63.

Đối với axit betulinic (13) và axit betulonic (64):

  • Tác giả điểm lại phương pháp điều chế từ betulin bằng thuốc thử Jones (oxy hóa thành 64 rồi khử chọn lọc bằng $NaBH_4$ về 13) hoặc dùng $CrO_3/SiO_2$ tạo betulinal rồi oxy hóa tiếp bằng $KMnO_4$.
  • Phản ứng gắn các gốc anhydride xúc tác enzyme tạo các dẫn xuất 65–70 nhằm tăng độ tan.
  • Chức hóa tại C-28 bằng 1,1'-carbonylbis(2'-methylimidazole) (CBMI) và 1,1'-carbonyl-di(1,2,4-triazole) (CDT) tạo các dẫn xuất 71–74; tạo diacetate 75–76; gắn chuỗi diamine hoặc amino ester tạo các amide 77–85.
  • Oxy hóa bằng DDQ tạo 86–87; oxy hóa bằng $O_2/t-BuOK$ tạo 88–90; tạo các dẫn xuất thế vòng A 91–95.
  • Đóng vòng dị vòng trên axit betulonic: tổng hợp pyrazine 96; brom hóa bằng 5,5-dibromo Meldrum’s acid tạo 2-bromobetulonic acid (97) rồi phản ứng Hantzsch với thiourea hoặc thioacetamide tạo thiazole 98–99; ngưng tụ Claisen tạo 100–103 rồi đóng vòng isoxazole/isoxazolone (104–107) và pyrazole (108–113); ester hóa tạo 114 rồi qua semicarbazone 115, phản ứng với $SOCl_2$ tạo 1,2,3-thiadiazole (116) và khử methyl bằng LiI/DMF thành 117; ngưng tụ tạo enamine 121 rồi đóng vòng pyridine 122–125; phản ứng với $PhONH_2$ tạo 126; và phản ứng Fischer indole tạo các dẫn xuất 127–129.

Về hoạt tính sinh học được ghi nhận trong y văn: betulin hạ cholesterol, chống viêm, bảo vệ gan, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, độc tế bào, kháng Leishmania và kháng nguyên sinh động vật. Betulin và allobetulin có hoạt tính kháng vi khuẩn Chlamydia (48%); allobetulin ức chế virus cúm B. Allobetulone 36 cùng các dẫn xuất 48, 49 có hoạt tính chống virus herpes; oxime 37 chống virus cúm A; các hợp chất 39, 40 ức chế miễn dịch trên lympho bào. Axit betulinic gây chết theo chu trình (apoptosis), chống tăng sinh mạch máu qua ức chế VEGF và survivin, đặc biệt hiệu quả trên tế bào ung thư hắc tố (melanoma). Axit betulonic có hoạt tính kháng virus và chống loét dạ dày. Các dẫn xuất triazole 76, betulonic 87, 88, 90, 91, 94 có hoạt tính in vitro trên dòng tế bào bạch cầu CEM. Dẫn xuất 2-bromobetulonic acid (97) có hoạt tính trên các dòng ung thư máu và ruột kết. Thiazole 99 và pyrazole 111 ức chế quá trình hủy cốt bào (osteoclastogenesis), có tiềm năng chống loãng xương. Dẫn xuất indole 127 thể hiện độc tính tế bào tốt.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Luận án tập trung lấp đầy các khoảng trống về mặt tổng hợp hữu cơ đối với các hệ dị vòng chưa từng được khám phá trên khung triterpene, bao gồm dị vòng 1,2,4-triazine, selenadiazole, thienopyridine và đặc biệt là hệ màu huỳnh quang triterpenoid BODIPY; làm rõ quy luật chọn lọc vị trí trên phân tử đồng phân 2-oxoallobetulin (vốn rất ít được khảo sát so với allobetulone); và phát triển hướng gắn dị vòng liên hợp qua phản ứng cộng ái nhân Grignard vào nhóm carbonyl.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên nền tảng lý thuyết hóa học hữu cơ thực nghiệm và hóa học các hợp chất thiên nhiên:

  • Cơ chế chuyển vị Wagner-Meerwein: sự mở rộng vòng E từ khung lupane thành oleanane, hình thành cầu ether $19\beta,28$-epoxy nội phân tử dưới tác dụng của xúc tác axit.
  • Cơ chế phản ứng chuyển vị Beckmann và phân mảnh Beckmann (Beckmann fragmentation): proton hóa hoặc tosyl hóa nhóm hydroxyl của ketoxime, dẫn đến sự di chuyển đồng thời có kiểm soát lập thể của liên kết cacbon bậc bốn sang nguyên tử nitơ để giải phóng phân tử nước tạo ion nitrilium; trong trường hợp carbocation trung gian tạo thành có độ bền cao, phản ứng phân mảnh cạnh tranh sẽ xảy ra ưu thế, dẫn đến sự cắt đứt liên kết C-C tạo sản phẩm nitrile chưa no.
  • Cơ chế phản ứng tổng hợp indole của Fischer: ngưng tụ giữa hydrazone thơm và ketone vòng chứa proton α có thể enol hóa dưới xúc tác axit, qua các bước chuyển vị vòng kèm giải phóng phân tử amoniac để tạo vòng pyrrole ngưng tụ thơm.
  • Phản ứng dị vòng hóa Hantzsch, phản ứng Willgerodt-Kindler và phản ứng ngưng tụ tạo dị vòng 1,2,4-triazine từ hợp chất $\alpha$-dicarbonyl với thiosemicarbazide.
  • Hóa học tính toán cấu hình phân tử: Sử dụng phần mềm Chem-3D với trường lực cơ học phân tử MM2 (Molecular Mechanics) để mô hình hóa và tối ưu hóa cấu trúc không gian 3 chiều của các phân tử dị vòng ngưng tụ cồng kềnh.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

  • Phương pháp tổng hợp hóa học: Thực hiện các phản ứng hữu cơ ở quy mô từ miligram đến đa gam, sử dụng các hệ dung môi khan, môi trường khí trơ, các phản ứng hồi lưu nhiệt độ cao hoặc phản ứng ở nhiệt độ thấp (–78 °C).
  • Phương pháp phân lập và tinh chế: Sắc ký lớp mỏng (TLC) theo dõi phản ứng; sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng áp suất trung bình (MPLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  • Phương pháp phân tích và xác định cấu trúc:
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D: $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, COSY (Correlated Spectroscopy), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) và NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy).
    • Phổ khối lượng: Phổ khối ion hóa va chạm electron (EIMS) và phổ khối lượng phân giải cao (HRMS).
    • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR).
    • Phân tích cấu trúc tinh thể bằng nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (X-ray crystallography) để xác định cấu hình lập thể tuyệt đối.
  • Phương pháp quang lý và thử nghiệm hoạt tính sinh học: Đo phổ huỳnh quang (fluorescence measurement) để khảo sát đặc tính phát xạ quang học của các hợp chất BODIPY; thực hiện các phép thử hoạt tính sinh học in vitro (Biological activity assays) trên các dòng tế bào mục tiêu.

Nguồn tư liệu và hóa chất:

  • Betulin tự nhiên chiết xuất từ vỏ cây bạch dương; axit betulonic thương mại sử dụng trực tiếp không qua tinh chế; allobetulin và allobetulone được tổng hợp trực tiếp trong phòng thí nghiệm.
  • Các hóa chất, thuốc thử hữu cơ tiêu chuẩn: p-TsOH, oxalyl chloride, dimethyl sulfoxide (DMSO), triethylamine, morpholine, lưu huỳnh nguyên tố ($S_8$), hydroxylamine hydrochloride, p-toluenesulfonyl chloride (p-TsCl), thiourea, phenylhydrazine, kali cacbonat ($K_2CO_3$), thiosemicarbazide, kali tert-butoxide ($t-BuOK$), tert-butanol ($t-BuOH$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: General introduction (Tổng quan tài liệu)

Chương này trình bày chi tiết về nguồn gốc, cấu trúc và phân loại terpenoid, tập trung vào hai nhóm triterpenoid pentacyclic là lupane và oleanane. Tác giả tổng kết các công trình công bố về các phương pháp tách chiết betulin, phản ứng chuyển vị thành allobetulin, và các phản ứng biến đổi hóa học chức hóa tại các vị trí C-3, C-28 và vòng A của cả allobetulin và axit betulinic/betulonic. Đồng thời, chương 1 tổng hợp toàn diện các số liệu hoạt tính sinh học đã công bố trong y văn về khả năng kháng khuẩn, kháng virus, ức chế tế bào ung thư và ức chế hủy cốt bào của các hợp chất này.

Chương 2: Objectives (Mục tiêu nghiên cứu)

Chương này xác định định hướng nghiên cứu chính của luận án, tập trung vào việc khai thác nguồn nguyên liệu betulin dồi dào để biến đổi cấu trúc tại vòng A. Tác giả đặt ra ba hướng can thiệp hóa học cụ thể: (1) Tổng hợp các hệ dị vòng ngưng tụ [2,3] từ allobetulone và axit betulonic; (2) Khảo sát tính chọn lọc vị trí của đồng phân 2-oxoallobetulin; (3) Thực hiện phản ứng cộng Grignard trên nhóm carbonyl của allobetulone và 2-oxoallobetulin để tạo các dị vòng liên hợp 1,2,3-triazole. Mục tiêu cuối cùng là kiểm tra hoạt tính sinh học của các sản phẩm và đặc tính huỳnh quang của các khung BODIPY thu được.

Chương 3: Results and discussions (Kết quả và thảo luận)

Chương này là phần trọng tâm thực nghiệm của luận án, được chia thành các tiểu mục chi tiết:

3.1 Dẫn xuất dị vòng ngưng tụ của allobetulone và axit betulonic (Fused heterocyclic derivatives of allobetulone and betulonic acid)

Tác giả thiết lập quy trình điều chế các nguyên liệu đầu ở quy mô đa gam với hiệu suất cao nhằm tránh các tác nhân gây hại môi trường:

  • Chuyển vị Wagner-Meerwein từ betulin (12) thành allobetulin (20): Sử dụng xúc tác p-toluenesulfonic acid (p-TsOH) trong dichloromethane (DCM) ở điều kiện hồi lưu, đạt hiệu suất lặp lại 93% ở quy mô nhiều gam.
  • Oxy hóa allobetulin (20) thành allobetulone (36): Quá trình thử nghiệm các xúc tác oxy hóa "xanh" như TEMPO không thành công do phản ứng không diễn ra. Tác giả áp dụng phản ứng oxy hóa Swern (sử dụng oxalyl chloride, DMSO, triethylamine trong DCM ở nhiệt độ từ –78 °C đến 0 °C), thu được allobetulone 36 với hiệu suất 90%, loại bỏ việc phải dùng các thuốc thử crom độc hại.
  • Điều chế 2-oxoallobetulin (57): Tái sắp xếp allobetulone 36 qua phản ứng Willgerodt-Kindler với lưu huỳnh nguyên tố trong morpholine ở điều kiện hồi lưu, đạt hiệu suất 67%.
  • Axit betulonic (64) được sử dụng từ nguồn thương mại có sẵn.

Các phản ứng cổ điển không thành công (Unsuccessful classical reactions): Tác giả chứng minh rằng do cấu trúc triterpene ngũ vòng có hiệu ứng cản trở lập thể (steric hindrance) rất lớn, một số phản ứng tạo vòng kinh điển có phạm vi ứng dụng rộng rãi trên các chất khác đã hoàn toàn thất bại khi áp dụng lên allobetulone (36), axit betulonic (64) và 2-oxoallobetulin (57):

  • Phản ứng Gewald: Thử nghiệm ngưng tụ allobetulone 36, axit betulonic 64 hoặc 2-oxoallobetulin 57 với methyl cyanoacetate ($NC-CH_2-COOCH_3$) và lưu huỳnh nguyên tố ($S_8$) dưới sự có mặt của các amine (triethylamine, piperidine, pyridine, morpholine) trong nhiều dung môi (DMF, THF, ethanol, $CH_2Cl_2$). Kết quả không thu được bất kỳ dẫn xuất thiophene mong muốn nào.
  • Phản ứng ngưng tụ Robinson (Robinson annulation): Cho 36, 64 hoặc 57 phản ứng với methyl vinyl ketone dưới xúc tác sodium ethoxide (EtONa) trong hỗn hợp $CHCl_3$/ethanol ở nhiệt độ hồi lưu. Phản ứng không diễn ra, kể cả đối với phân tử ít cản trở lập thể hơn là 2-oxoallobetulin (57).
  • Phản ứng tổng hợp amino acid Strecker: Thử nghiệm trên 36 và 57 với các nguồn cung cấp ion cyanide ($KCN/SiCl_4$ hoặc $Me_3SiCN/(NH_4)_2CO_3$) trong các dung môi acetonitrile (ACN), ethanol, DMSO, DMF. Tất cả các trường hợp đều thu hồi lại nguyên liệu đầu.
  • Phản ứng Hantzsch mở rộng: Phản ứng brom hóa allobetulone 36 bằng brom ($Br_2$) trong hỗn hợp $AcONa/AcOH$ ở nhiệt độ phòng thu được hỗn hợp đồng phân $\alpha,\beta$-2-bromoallobetulone (47) với hiệu suất 74%. Cho 47 phản ứng với thiourea trong hỗn hợp ethanol/$CHCl_3$ ở nhiệt độ phòng tạo thành aminothiazole ngưng tụ (50) với hiệu suất 56%. Tuy nhiên, khi cho 47 phản ứng ngưng tụ vòng kiểu Hantzsch với 2-aminopyridine hoặc 2,6-diaminopyridine nhằm tạo hệ imidazopyridine ngưng tụ, phản ứng hoàn toàn không thành công.

Phản ứng chuyển vị và phân mảnh Beckmann (Beckmann rearrangement and fragmentation reactions):

  • Phản ứng của allobetulone 36 với hydroxylamine hydrochloride trong hỗn hợp methanol/pyridine ở nhiệt độ hồi lưu tạo allobetulone oxime (37) với hiệu suất 89%. Khi xử lý oxime 37 với p-toluenesulfonyl chloride (p-TsCl) trong pyridine ở nhiệt độ hồi lưu, phản ứng chuyển vị Beckmann xảy ra chọn lọc, tạo lactam mở rộng vòng A (55) với hiệu suất 60%; không quan sát thấy sản phẩm phân mảnh nitrile.
  • Ngược lại, phản ứng của axit betulonic 64 với hydroxylamine hydrochloride trong methanol/pyridine hồi lưu tạo betulonic acid oxime (130) với hiệu suất 87%. Khi xử lý oxime 130 với p-TsCl trong pyridine ở điều kiện hồi lưu, phản ứng phân mảnh Beckmann (Beckmann fragmentation) diễn ra hoàn toàn, tạo thành dẫn xuất cắt vòng 3,4-secotriterpene nitrile (131) với hiệu suất 63%; không quan sát thấy sản phẩm lactam.

Phản ứng tổng hợp Fischer indole (Fischer indole synthesis):

  • Phản ứng giữa allobetulone 36 và phenylhydrazine trong axit axetic (AcOH) ở nhiệt độ hồi lưu tạo dẫn xuất allobetulin indole ngưng tụ (63) với hiệu suất 71% (công trình trước đây năm 1969 chỉ đạt 50% và chưa có dữ liệu NMR).
  • Áp dụng tương tự cho axit betulonic 64 với phenylhydrazine trong AcOH hồi lưu, thu được dẫn xuất betulonic acid indole ngưng tụ (127) với hiệu suất 59%.

Tổng hợp dẫn xuất triterpenoid triazine (Synthesis of triterpenoid triazine derivatives):

  • Oxy hóa allobetulone 36 bằng khí oxy với xúc tác $t-BuOK$ trong $t-BuOH$ tạo 2-oxoallobetulone (42). Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ trong $CDCl_3$ chứng minh hợp chất 42 tồn tại chủ yếu ở dạng enol (2-hydroxyenone).
  • Ngưng tụ hợp chất 42 với thiosemicarbazide trong ethanol có mặt $K_2CO_3$ tạo thành dẫn xuất 1,2,4-triazine ngưng tụ (132). Cấu hình không gian tuyệt đối của hợp chất 132 được tối ưu hóa bằng tính toán lý thuyết cơ học phân tử (trường lực MM2 trên Chem-3D).

Các nội dung tiếp theo của mục 3.1 trong bảng mục lục bao gồm việc tổng hợp các dẫn xuất 1,2,3-thiadiazole, 1,2,3-selenadiazole và các hợp chất huỳnh quang triterpenoid BODIPY ngưng tụ.

Bảng tổng hợp các phản ứng tiêu biểu tại mục 3.1:

Nguyên liệu Tác nhân phản ứng Điều kiện Sản phẩm tạo thành Hiệu suất Ghi chú
Betulin (12) p-TsOH DCM, hồi lưu Allobetulin (20) 93% Quy mô đa gam
Allobetulin (20) $(COCl)_2$, DMSO, $Et_3N$ DCM, –78 °C đến 0 °C Allobetulone (36) 90% Oxy hóa Swern
Allobetulone (36) Lưu huỳnh ($S_8$), morpholine Hồi lưu 2-Oxoallobetulin (57) 67% Willgerodt-Kindler
Allobetulone (36) $Br_2$, AcONa AcOH, nhiệt độ phòng 2-Bromoallobetulone (47) 74% Hỗn hợp đồng phân $\alpha,\beta$
Dẫn xuất bromo 47 Thiourea EtOH, $CHCl_3$, nhiệt độ phòng Aminothiazole (50) 56% Phản ứng Hantzsch
Allobetulone (36) $NH_2OH\cdot HCl$ MeOH, pyridine, hồi lưu Oxime (37) 89% Tạo ketoxime
Oxime 37 p-TsCl Pyridine, hồi lưu Lactam vòng A (55) 60% Chuyển vị Beckmann
Axit betulonic (64) $NH_2OH\cdot HCl$ MeOH, pyridine, hồi lưu Oxime (130) 87% Tạo ketoxime
Oxime 130 p-TsCl Pyridine, hồi lưu Seco-nitrile (131) 63% Phân mảnh Beckmann
Allobetulone (36) Phenylhydrazine AcOH, hồi lưu Indole ngưng tụ (63) 71% Fischer indole
Axit betulonic (64) Phenylhydrazine AcOH, hồi lưu Indole ngưng tụ (127) 59% Fischer indole
Allobetulone (36) $O_2$, $t-BuOK$ $t-BuOH$ 2-Oxoallobetulone (42) — Tồn tại ở dạng enol
Enol 42 Thiosemicarbazide EtOH, $K_2CO_3$ 1,2,4-Triazine (132) — Cấu trúc MM2 Chem-3D

3.2 Tính chọn lọc vị trí của các phản ứng chức hóa 2-oxoallobetulin (Regioselectivity of functionalization reactions of 2-oxoallobetulin)

Phần này tập trung nghiên cứu tính chọn lọc phản ứng tại hai vị trí liền kề nhóm carbonyl của 2-oxoallobetulin (57), cụ thể là vị trí C-1 và vị trí C-3:

  • Khảo sát phản ứng brom hóa của 2-oxoallobetulin.
  • Khảo sát phản ứng oxy hóa Baeyer-Villiger.
  • Tổng hợp các dẫn xuất 1,2,3-thiadiazole và 1,2,3-selenadiazole. Dựa trên kết quả thực nghiệm và phân tích cấu trúc, tác giả kết luận rằng vị trí có hoạt tính hóa học cao nhất và ưu thế chọn lọc vị trí trên phân tử 2-oxoallobetulin là vị trí C-3.

3.3 Phản ứng trực tiếp của allobetulone, 2-oxoallobetulin và phản ứng tiếp theo tạo các hợp chất dị vòng liên hợp (Direct reaction of allobetulone, 2-oxoallobetulin and further reaction to fused heterocyclic compounds)

Nghiên cứu khảo sát phản ứng cộng Grignard trực tiếp lên nhóm chức ketone của hai đồng phân allobetulone (36) và 2-oxoallobetulin (57). Sau phản ứng cộng, các chất trung gian được chuyển hóa tiếp qua các phản ứng nhiệt chu chuyển để gắn các dị vòng liên hợp (không phải dạng ngưng tụ) vào khung triterpene, thu được một chuỗi các dẫn xuất 1,2,3-triazole mới. Cấu trúc của tất cả các sản phẩm mới đều được xác minh bằng phổ 2D-NMR và tinh thể học tia X.

3.4 Hoạt tính sinh học (Biological activities)

Trình bày các kết quả đánh giá thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro đối với các dãy hợp chất dị vòng ngưng tụ và liên hợp mới được tổng hợp trong luận án.

Chương 4: General conclusions and outlook (Kết luận chung và triển vọng)

Tóm tắt toàn bộ các thành quả nghiên cứu đã đạt được về mặt phương pháp tổng hợp, các quy luật phản ứng lập thể, và định hướng phát triển tiếp theo của đề tài.

Chương 5: Experimental section (Phần thực nghiệm)

Mô tả chi tiết quy trình tổng hợp, các thông số vật lý, dữ liệu phổ ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR, MS, IR), số liệu tinh thể học tia X (X-ray crystallographic data, mục 5.1) và các quy trình thử nghiệm sinh học (Biological activity assays, mục 5.2).

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được những kết quả cụ thể và đóng góp mới sau:

  1. Đóng góp về phương pháp tổng hợp tiền chất:
  • Xác lập điều kiện tối ưu để chuyển vị betulin (12) thành allobetulin (20) ở quy mô đa gam đạt hiệu suất lặp lại 93% bằng xúc tác p-TsOH trong DCM hồi lưu.
  • Ứng dụng thành công phản ứng oxy hóa Swern để điều chế allobetulone (36) từ allobetulin với hiệu suất 90%, giải quyết triệt để vấn đề phụ thuộc vào các tác nhân oxy hóa chứa crom độc hại trong các nghiên cứu trước đây.
  • Tối ưu hóa phản ứng Willgerodt-Kindler chuyển hóa allobetulone thành 2-oxoallobetulin (57) với hiệu suất 67%.
  1. Đóng góp về lý luận phản ứng và hiệu ứng lập thể:
  • Chỉ ra và chứng minh bằng thực nghiệm rằng hiệu ứng cản trở lập thể nghiêm trọng của khung triterpenoid pentacyclic là nguyên nhân làm vô hiệu hóa các phản ứng hữu cơ kinh điển như phản ứng Gewald, phản ứng Robinson annulation và phản ứng tổng hợp Strecker trên allobetulone, axit betulonic và 2-oxoallobetulin.
  • Phát hiện sự phân hóa cơ chế rõ rệt trong phản ứng Beckmann: trong cùng điều kiện phản ứng với p-TsCl trong pyridine hồi lưu, allobetulone oxime (37) trải qua chuyển vị Beckmann tạo lactam vòng A mở rộng 55 (hiệu suất 60%) mà không tạo nitrile; trong khi betulonic acid oxime (130) trải qua phản ứng phân mảnh Beckmann tạo secotriterpene nitrile 131 (hiệu suất 63%) mà không tạo lactam.
  1. Đóng góp về việc tạo mới các phân tử dị vòng triterpenoid:
  • Tổng hợp thành công các dẫn xuất aminothiazole (50, hiệu suất 56%), allobetulin indole (63, hiệu suất 71%) và betulonic acid indole (127, hiệu suất 59%) với cấu trúc được chứng minh đầy đủ bằng phổ NMR.
  • Tổng hợp thành công dẫn xuất 1,2,4-triazine triterpenoid mới (132) từ 2-oxoallobetulone và thiosemicarbazide, giải quyết bài toán thiếu hụt các dẫn xuất triazine trên khung terpene.
  • Làm sáng tỏ tính chọn lọc vị trí của 2-oxoallobetulin, khẳng định vị trí C-3 có tính phản ứng vượt trội so với C-1 qua các phản ứng brom hóa, Baeyer-Villiger và tạo dị vòng 1,2,3-thiadiazole, 1,2,3-selenadiazole.
  • Phát triển phương pháp cộng Grignard trên nhóm carbonyl của hai đồng phân allobetulone và 2-oxoallobetulin để tạo ra dãy hợp chất dị vòng liên hợp 1,2,3-triazole.
  • Tổng hợp thành công hai chất nhuộm huỳnh quang BODIPY ngưng tụ với khung triterpene, cung cấp dữ liệu quang lý huỳnh quang đầu tiên cho nhóm cấu trúc lai ghép này.
  • Toàn bộ cấu trúc của các hợp chất mới đều được xác định cấu hình chính xác bằng các kỹ thuật tiên tiến gồm 2D-NMR và nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Do hiệu ứng cản trở lập thể nội tại của bộ khung carbon ngũ vòng, một số hướng tổng hợp dị vòng mong muốn như phản ứng Gewald tạo thiophene, ngưng tụ Robinson tạo vòng cyclohexenone, phản ứng Strecker tạo amino acid và phản ứng Hantzsch với aminopyridine không thể diễn ra dù đã thay đổi nhiều hệ dung môi và xúc tác amine khác nhau.
  • Thử nghiệm oxy hóa allobetulin bằng các hệ xúc tác "xanh" thân thiện môi trường như TEMPO không thành công, buộc phải sử dụng phương pháp oxy hóa Swern ở nhiệt độ thấp (–78 °C).
  • Phạm vi nghiên cứu biến đổi cấu trúc mới chỉ tập trung vào vòng A, chưa kết hợp biến đổi đồng thời tại các vị trí khác trên cùng một phân tử.

Hướng nghiên cứu tiếp được đề xuất:

  • Tiếp tục tối ưu hóa các điều kiện phản ứng để vượt qua rào cản lập thể tại các vị trí khó phản ứng trên khung triterpene.
  • Mở rộng đánh giá sâu hơn về cơ chế tác động sinh học phân tử đối với các hợp chất mới thể hiện hoạt tính in vitro tiềm năng.
  • Khai thác ứng dụng phát xạ huỳnh quang của các dẫn xuất triterpenoid BODIPY trong nghiên cứu theo dõi và đánh dấu tế bào (cellular imaging).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và các nhà nghiên cứu thuộc chuyên ngành Hóa học hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Hóa dược (Medicinal Chemistry).
  • Các giảng viên đại học sử dụng làm tài liệu giảng dạy chuyên đề về hóa học triterpenoid, các phản ứng chuyển vị chọn lọc lập thể (Wagner-Meerwein, Beckmann rearrangement/fragmentation, Willgerodt-Kindler) và tổng hợp dị vòng ngưng tụ.
  • Các chuyên gia nghiên cứu phát triển thuốc quan tâm đến việc tận dụng phụ phẩm công nghiệp chế biến gỗ (vỏ cây bạch dương) để tạo ra các phân tử có hoạt tính chống ung thư, kháng virus hoặc làm chất đánh dấu huỳnh quang sinh học.

Các phần có giá trị tham khảo nổi bật:

  • Quy trình thực nghiệm chi tiết ở quy mô đa gam điều chế allobetulin và allobetulone với độ tinh khiết và hiệu suất cao.
  • Bộ số liệu phổ 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) và dữ liệu tinh thể học tia X dùng làm chuẩn đối sánh cấu trúc cho các dẫn xuất triterpenoid pentacyclic cồng kềnh.
  • Phương pháp luận xử lý và phân biệt sản phẩm chuyển vị Beckmann so với phân mảnh Beckmann trên khung triterpenoid.

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện tối ưu và hiệu suất đạt được trong phản ứng chuyển vị betulin thành allobetulin ở quy mô đa gam là gì? Tác giả sử dụng xúc tác axit para-toluenesulfonic (p-TsOH) trong dung môi dichloromethane (DCM) ở điều kiện hồi lưu. Phản ứng đạt hiệu suất 93%, có tính lặp lại cao ở quy mô nhiều gam, được chọn là phương pháp tối ưu thay thế cho việc sử dụng xúc tác $Bi(OTf)_3$.

2. Tại sao các phản ứng Gewald, Robinson annulation và Strecker không thể thực hiện thành công trên allobetulone và axit betulonic? Nguyên nhân trực tiếp được tác giả xác định là do hiệu ứng cản trở lập thể (steric hindrance) rất lớn của khung triterpenoid ngũ vòng bao quanh nhóm carbonyl tại vòng A, khiến các chất phản ứng và tâm ái nhân/ái điện tử không thể tiếp cận để hoàn thành chu trình đóng vòng hoặc cộng hợp.

3. Sự khác biệt giữa sản phẩm phản ứng Beckmann của oxime allobetulone và oxime axit betulonic khi xử lý với p-TsCl trong pyridine là gì? Khi phản ứng với p-toluenesulfonyl chloride trong pyridine hồi lưu, oxime của allobetulone (37) trải qua chuyển vị Beckmann tạo lactam mở rộng vòng A (hợp chất 55) với hiệu suất 60% và không tạo nitrile. Ngược lại, oxime của axit betulonic (130) trải qua phản ứng phân mảnh Beckmann (Beckmann fragmentation) tạo sản phẩm cắt vòng 3,4-secotriterpene nitrile (hợp chất 131) với hiệu suất 63% và không tạo lactam.

4. Phản ứng oxy hóa nào được lựa chọn thành công để chuyển hóa allobetulin thành allobetulone thay thế cho các tác nhân chứa crom độc hại? Tác giả đã thử nghiệm xúc tác oxy hóa "xanh" TEMPO nhưng phản ứng không diễn ra. Do đó, phản ứng oxy hóa Swern (sử dụng oxalyl chloride, DMSO và triethylamine trong DCM ở nhiệt độ từ –78 °C đến 0 °C) đã được lựa chọn thành công, thu được allobetulone với hiệu suất 90% mà không cần dùng đến các thuốc thử crom gây độc môi trường.

5. Vị trí nào được chứng minh là có hoạt tính hóa học cao hơn trong nghiên cứu tính chọn lọc vị trí của 2-oxoallobetulin? Qua các phản ứng brom hóa, oxy hóa Baeyer-Villiger và tổng hợp dị vòng 1,2,3-thiadiazole cũng như 1,2,3-selenadiazole, tác giả kết luận vị trí C-3 có tính phản ứng cao hơn và là trung tâm phản ứng ưu thế so với vị trí C-1 trên phân tử 2-oxoallobetulin.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Thuc Dinh Ngoc đã thực hiện thành công việc biến đổi cấu trúc hóa học tại vòng A của các triterpenoid tự nhiên dồi dào là betulin, allobetulin và axit betulonic để tạo ra chuỗi các dẫn xuất dị vòng ngưng tụ và liên hợp mới. Công trình làm sáng tỏ các quy luật lập thể quan trọng, bao gồm sự chi phối của hiệu ứng cản trở lập thể đối với các phản ứng hữu cơ kinh điển, sự khác biệt giữa chuyển vị và phân mảnh Beckmann, cũng như tính chọn lọc vị trí tại C-3 của 2-oxoallobetulin. Với việc kết hợp toàn diện các phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại, mô hình hóa phân tử MM2, xác định cấu trúc bằng 2D-NMR, tinh thể học tia X và thử nghiệm sinh học - quang lý, luận án cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc cho hướng phát triển các phân tử triterpene có hoạt tính sinh học và chất đánh dấu huỳnh quang BODIPY.